Isolamento e eficiência de plaqueamento de protoplastos de citros

As recentes ferramentas biotecnológicas para o melhoramento in vitro de citros incluem a hibridação somática por fusão de protoplastos. A otimização dos protocolos de isolamento, plaqueamento e cultura de protoplastos, fundamental para maior eficiência na produção de híbridos somáticos, foi avaliada em 11 variedades cítricas. As soluções enzimáticas testadas foram: 1. celulase Onozuka RS, 1%; macerase R-10, 1%, pectoliase Y-23, 0,2%; 2. celulase Onozuka R-10, 0,2 %; macerase R-10, 0,3%; driselase, 0,1%; 3. celulase Onozuka R-10, 1%; macerase R-10, 0,2%; driselase, 0,1%. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado em meio de cultura EME 0,7 M, nas densidades de 2 x 10(4); 5 x 10(4); 10(5); 2 x 10(5) e 3 x 10(5) protoplastos.mL-1, no escuro, a 25 ± 1°C. A solução enzimática 1 possibilitou melhor rendimento no isolamento de protoplastos para a maioria das variedades, exceto para o limão-'Cravo', onde o melhor rendimento foi obtido na solução enzimática 3, e para as laranjas-doces 'Valência' e 'Succari', que apresentaram maiores rendimentos na solução enzimática 2. A eficiência final de plaqueamento, avaliada aos 90 dias de cultivo, foi superior nas densidades de 10(5) e 2 x 10(5) protoplastos.mL-1, para todas as variedades. O desenvolvimento de embriões somáticos foi observado em todas as variedades, exceto para tangor 'Murcote'.

Regeneração de plantas após fusão de protoplastos de tangelo 'Page' e toranja 'Lau Tau'

Buscou-se a hibridação somática entre tangelo 'Page' e toranja 'Lau Tau' visando à produção de porta-enxerto semelhante à laranja-azeda, por esta espécie ser considerada um provável híbrido entre C. reticulata e C. grandis. Após isolamento, fusão e cultivo de protoplastos, obtiveram-se brotações que foram enxertadas in vitro, em laranja 'Hamlin'. Dezessete plantas foram aclimatizadas em casa de vegetação. A análise de citometria de fluxo confirmou a constituição diplóide dessas plantas. Marcadores moleculares RAPD das plantas regeneradas apresentaram padrão de bandas similar ao de tangelo 'Page'. Entretanto, todas as plantas apresentaram conformação fenotípica diferente dos genitores.

Eficiência de isolamento e de plaqueamento de protoplastos de laranja-doce

O isolamento e plaqueamento de protoplastos são fatores fundamentais para o sucesso no cultivo in vitro deste tipo de explante visando a manipulações genéticas. A composição da solução enzimática no isolamento, a densidade de cultivo, bem como o próprio genótipo utilizado são variáveis importantes nestas etapas. Desta forma, o objetivo do trabalho foi avaliar a eficiência de isolamento de protoplastos em função de três soluções enzimáticas e a eficiência de plaqueamento em função de cinco densidades de protoplastos e diferentes composições de meio de cultura em cultivares de laranja-doce. As soluções enzimáticas avaliadas para o isolamento de protoplastos foram: 1. celulase Onozuka RS 1%, macerase R-10 1% e pectoliase 0,2%; 2. celulase Onozuka RS 1%, macerase R-10 1% ; 3. celulase Onozuka R-10 4%, macerase R-10 1%. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado nas densidades de 2 x 10(4); 5 x 10(4); 10(5); 2x 10(5) e 3 x 10(5) protoplastos.mL-1, nos meios de cultura EME 0,7M, BH3 0,7M e BH3 + EME 0,7M em ausência de luz, a 25 ± 1 ºC. A solução enzimática 2 proporcionou maior rendimento no isolamento de protoplastos das cultivares 'Hamlin', 'Natal' e 'Pera', e a solução enzimática 1 foi a mais adequada para a laranja 'Westin'. Para a cultivar 'Lima-Verde', a solução enzimática 3 foi a mais eficiente. A eficiência final de plaqueamento, avaliada aos 90 dias de cultivo, foi superior nas densidades de 3 x 10(5) e 2 x 10(5) protoplastos.mL-1 para as cultivares 'Hamlin', 'Natal' e 'Lima-Verde', e nas densidades de 2 x 10(5) e 10(5) protoplastos.mL-1 para a laranja 'Westin'.

Isolamento e regeneração de protoplastos de Magnaporthe grisea

Protoplastos são ferramentas biológicas importantes para pesquisas em fungos filamentosos, sendo empregados intensamente em transformação genética. O isolamento de protoplastos de Magnaporthe grisea foi facilitado com Novozym 234, contudo, este complexo enzimático encontra-se indisponível no mercado. Assim, objetivou-se comparar a eficiência de enzimas líticas disponíveis comercialmente na obtenção de protoplastos de M. grisea. Paralelamente, analisaram-se estabilizadores osmóticos, tempos de digestão e freqüência de regeneração. Maior produção de protoplastos foi obtida com o uso simultâneo de Lysing Enzymes e Cellulase Onozuka R-10. O uso de 10 ou 15 mg de cada complexo enzimático, em 3 mL de estabilizador osmótico, resultou em maior liberação de protoplastos. O melhor estabilizador osmótico foi MgSO4 1,2 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8, seguido por MgSO4 0,8 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8. O isolamento de protoplastos foi monitorado a cada 60 minutos, atingindo o máximo após incubação por 3 a 6 horas. No entanto, maior freqüência de regeneração (19,4%) foi registrada para protoplastos obtidos após 3 horas de hidrólise enzimática.

Produção de protoplastos e lise da parede celular de leveduras utilizando β-1,3 glucanase

O presente trabalho visou a aplicação da β-1,3 glucanase lítica, obtida do microrganismo Cellulosimicrobium cellulans 191, na produção de protoplastos e na lise da parede celular de leveduras. A preparação bruta da enzima foi capaz de lisar as leveduras Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann e Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587 e Hansenula mrakii NCYC 500. A β-1,3 glucanase purificada foi capaz de lisar as leveduras Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii e Pichia membranaefaciens e formar protoplastos de Saccharomyces cerevisiae KL-88.

Estruturas secretoras da lâmina foliar de amapá amargo (Parahancornia fasciculata, Apocynaceae): histoquímica e doseamento de flavonoides

Amapá amargo (Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist) produz um látex, que se presume ter propriedades medicinais, pois é usado no tratamento da malária, problemas pulmonares, gastrite, e como um agente de cura. Este estudo teve como objetivo analisar estrutural e histoquimicamente os locais de produção e/ou acumúlo de compostos biologicamente ativos, bem como realizar o doseamento de flavonóides presentes no limbo do amapá amargo. Para a análise estrutural e histoquímica foram utilizados protocolos padrão em anatomia vegetal. Considerando que, para o doseamento de flavonóides utilizou-se a espectrometria de absorção na região ultravioleta-visível. O sistema secretor das folhas de amapá amargo é constituído de idioblastos secretores e laticíferos ramificados. Os testes histoquímicos revelaram diferentes tipos de substâncias químicas nos protoplastos celulares de idioblastos e laticíferos. Propriedades farmacológicas do látex de amapa amargo podem ser atribuídas à dois compostos químicos (flavonoides e alcaloides) encontrados neste estudo, ambos estão presentes em idioblastos e laticíferos.

Obtenção de híbridos somáticos de limão 'Cravo' e tangerina 'Cleópatra'

Este trabalho teve como objetivo a obtenção de híbridos somáticos entre o limão 'Cravo' (Citrus limonia Osbeck) e a tangerina 'Cleópatra' (Citrus reshni Hort.), para serem usados como porta-enxertos de citros. O limão 'Cravo' é atualmente o principal porta-enxerto comercial utilizado no Brasil, em virtude de suas boas qualidades agronômicas. Entretanto, é suscetível ao "declínio" dos citros, doença responsável pela eliminação anual de milhões de plantas cítricas no Brasil. A tangerina 'Cleópatra' é uma espécie bastante utilizada como porta-enxerto em outros países e tem sido descrita na literatura como tolerante ao "declínio". Protoplastos de suspensões celulares embriogênicas e protoplastos derivados de tecidos foliares foram utilizados para fusão com solução de PEG (50%) e posterior cultivo em agarose. A porcentagem de obtenção de células híbridas interespecíficas logo após a fusão, variou entre 5,1% e 6,8%. Foram obtidas mais de 500 plantas a partir de produtos de fusão cultivados em gotas de agarose. No total de 180 plantas avaliadas, 11 híbridos somáticos foram discriminados e confirmados, utilizando-se marcadores moleculares RAPD e isoenzimáticos (sistemas PO, IDH e PGI). Seis plantas foram aclimatizadas, plantadas no solo e estão sendo multiplicadas por estaquia para avaliação futura como porta-enxertos de citros.

CALOGÊNESE EM ÓVULOS DE ESPÉCIES E VARIEDADES DE CITRUS

A Embrapa Mandioca e Fruticultura vem realizando ações de pesquisa visando à obtenção de híbridos somáticos de citros, particularmente porta-enxertos, melhor adaptados às condições tropicais de cultivo brasileiras que as variedades atualmente em uso. Como objetivo principal, busca-se a seleção de genótipos tolerantes à seca e ao alumínio, tolerantes/resistentes a gomose de Phytophthora e tristeza dos citros, além de adaptados a altas densidades populacionais. Como fontes de protoplastos, vêm sendo utilizadas as tangerinas-'Cleópatra', 'Sunki' e 'Swatow', limões-'Cravo Santa Cruz' e 'Santa Bárbara', 'Volkameriano' e 'Rugoso Mazoe', laranja 'Hamlin CNPMF 04' e 'CNPMF 20', laranjas-azedas 'Comum' e 'Narrow Leaf', citrange-'Troyer', Citrus amblycarpa e Microcitrus papuana. O estudo concentrou-se na etapa de obtenção e cultivo de calos embriogênicos. Foram utilizados óvulos extraídos de frutos imaturos, empregando-se como meio de cultura o MT, adicionando-se 50 g.L-1 de sacarose e 500 mg.L-1de extrato de malte e solidificando com 7 g.L-1 1de ágar. Em geral, a indução de calos nas variedades estudadas ocorreu entre a 6ª e a 8ª semana de cultivo, com maior precocidade na laranja-‘Hamlin’, sendo que, em limão-‘Cravo’, laranja-‘Hamlin’ , tangerinas-‘Cleópatra’ e ‘Swatow’ e citrange-‘Troyer’, a porcentagem de formação de calos foi igual ou superior a 50%, destacando-se a tangerina-‘Cleópatra’ com um porcentual próximo a 70% de calogênese.

Integração de pAN7-1 no genoma de Magnaporthe grisea mediada por enzima de restrição

Visando explorar a mutagênese insercional em Magnaporthe grisea, foram avaliadas a transformação dos protoplastos obtidos após adequação do protocolo e a eficiência da integração de pAN7-1 no genoma do ascomiceto na presença da enzima de restrição Hind III. Os protoplastos de M. grisea I-22 foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando o vetor linearizado com Hind III foi usado para transformar o fungo na presença de Hind III, a eficiência de transformação foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da enzima. No geral, a melhor concentração de Hind III foi 5 unidades/reação de transformação. Tal concentração promoveu a produção média de 332 transformantes/µg de pAN7-1/10(7) protoplastos. A presença do gene de seleção hph no genoma de 18 indivíduos resistentes à higromicina foi confirmada por PCR.