Selection of shrimp breeders free of white spot syndrome and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis

The objective of this work was to select surviving breeders of Litopenaeus vannamei from white spot syndrome virus (WSSV) outbreak, adapted to local climatic conditions and negatively diagnosed for WSSV and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and to evaluate if this strategy is a viable alternative for production in Santa Catarina, Brazil. A total of 800 males and 800 females were phenotypically selected in a farm pond. Nested-PCR analyses of 487 sexually mature females and 231 sexually mature males showed that 63% of the females and 55% of the males were infected with IHHNV. Animals free of IHHNV were tested for WSSV, and those considered double negative were used for breeding. The post-larvae produced were stocked in nine nursery tanks for analysis. From the 45 samples, with 50 post-larvae each, only two were positive for IHHNV and none for WSSV. Batches of larvae diagnosed free of virus by nested-PCR were sent to six farms. A comparative analysis was carried out in growth ponds, between local post-larvae and post-larvae from Northeast Brazil. Crabs (Chasmagnathus granulata), blue crabs (Callinectes sapidus), and sea hares (Aplysia brasiliana), which are possible vectors of these viruses, were also evaluated. The mean survival was 55% for local post-larvae against 23.4% for post-larvae from the Northeast. Sea hares showed prevalence of 50% and crabs of 67% of WSSV.

Nitrogen and potassium fertilization on the yield and intensity of the maize white spot

A plant's nutritional balance can influence its resistance to diseases. In order to evaluate the effect of increasing doses of N and K on the yield and severity of the mayze white spot, two experiments were installed in the field, one in the city of Ijaci, Minas Gerais, and the other in the city of Sete Lagoas, Minas Gerais. The experimental delimitation was in randomized blocks with 5 x 5 factorial analysis of variance, and four repetitions. The treatments consisted of five doses of N (20; 40; 80; 150; 190 Kg ha-1of N in the experiments 1 and 2) and five doses of K (15; 30; 60; 120; 180 Kg ha-1of K in experiment 1 and 8.75; 17.5; 35; 50; 100 Kg ha-1of K in experiment 2). The susceptible cultivar 30P70 was planted in both experiments. The plot consisted of four rows 5 meters long, with a useful area consisting of two central rows 3 meters each. Evaluations began 43 days after emergence (DAE) in the first experiment and 56 DAE in the second one. There was no significant interaction between doses of N and K and the disease progress P+. The effect was only observed for N. The K did not influence the yield and the severity of the disease in these experiments. Bigger areas below the severity progress curve of the white spot and better yield were observed with increasing doses of N. Thus, with increasing doses of N, the white spot increased and also did the yield.

Characterization of Tomato yellow spot virus, a novel tomato-infecting begomovirus in Brazil

The objective of this work was the biological and molecular characterization of a begomovirus detected in São Joaquim de Bicas, Minas Gerais, Brazil, named TGV-[Bi2], by determining its host range, complete nucleotide sequence and phylogenetic relationships with other begomoviruses. Biological characterization consisted of a host range study using either sap inoculation or particle bombardment as inoculation methods. The yellow spot virus can infect plants in Solanaceae and Amaranthaceae, including economically importat crops as sweet pepper, and weeds as Datura stramonium and Nicotiana silvestris. For the molecular characterization, the full-length genome (DNA-A and DNA-B) was amplified, cloned and completely sequenced. Sequence comparisons and phylogenetic analyses indicated that TGV-[Bi2] constitutes a novel begomovirus species named Tomato yellow spot virus (ToYSV), closely related to Sida mottle virus (SiMoV).

Caracterização do Tomato chlorotic spot virus isolado de jiló no Vale do Paraíba, Estado de São Paulo

Os tospovírus são responsáveis por perdas significativas em diversas culturas, principalmente solanáceas. No município de São José dos Campos (SP), plantas de jiló (Solanum gilo) apresentando sintomas de mosaico, bolhosidades, nanismo e queda acentuada da produção foram coletadas para análise. Visando a caracterização do agente causador dos sintomas, testes biológicos, elétrono microscópicos, sorológicos e moleculares foram realizados. Através de inoculação mecânica em plantas indicadoras das famílias Amaranthaceae, Chenopodiaceae e Solanaceae obtiveram-se resultados típicos aos esperados para tospovírus. Ao microscópio eletrônico de transmissão, observaram-se, em contrastação negativa, partículas pleomórficas com diâmetro entre 80 e 110 nm e em cortes ultra-finos partículas presentes em vesículas do retículo endoplasmático. Através de DAS-ELISA, identificou-se o Tomato chlorotic spot virus (TCSV). A partir de RNA total extraído de folhas infetadas, amplificaram-se, via RT-PCR, fragmentos correspondentes ao gene da proteína do capsídeo (cp) os quais foram seqüenciados e comparados com outros depositados no "GenBank". A homologia de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos foi respectivamente de 99 e 95% quando comparada com seqüências de isolados de TCSV. A comparação com as outras espécies do gênero Tospovirus apresentou valores de homologia entre 72 e 84%. Estes resultados confirmam a identidade deste vírus como pertencente à espécie TCSV, que é predominante no Estado de São Paulo e importante patógeno de outras plantas cultivadas. Além disso, variedades de jiló quando inoculadas foram susceptíveis tanto ao TCSV como às espécies Tomato spotted wilt virus (TSWV) e Groundnut ringspot virus (GRSV).

Tomato chlorotic spot virus in hydroponically-grown lettuce in São Paulo State, Brazil

In the regions of Campinas and Sumaré, São Paulo, Brazil, hidroponically grown crops of Lettuce (Lactuca sativa) cv. Verônica, which showed virus-like symptoms were examined by electron microscope, biological, serological and molecular tests. Pleomorphic, enveloped particles (80-100 nm in diameter) were always detected in these samples. Experimentally inoculated host plants, including lettuce, reacted with tospoviruses-induced symptoms. Some differences were observed in Gomphrena globosa, which reacted by showing local lesions and systemic mosaic. Two isolates of Tomato chlorotic spot virus (TCSV) were identified by DAS-ELISA and by RT-PCR. The sequencing and alignment of the RT-PCR coat protein amplified fragments have indicated a high degree of homology with the TCSV sequences stored in the GenBank. This is the first report of losses due to a virus from the genus Tospovirus in commercial hydroponic lettuce crops in Brazil. Further epidemiological studies are needed for better understanding the spread of the virus in hydroponic crops, since Tomato spotted wilt virus (TSWV) is reported to spread through the nutritive solution.

Resistência de cultivares e linhagens de tomateiro a Tomato chlorotic spot virus e a Potato virus Y

Linhagens avançadas do programa de melhoramento do tomateiro (Lycopersicon esculentum) do IAC foram avaliadas em condições de campo em Campinas (SP) para resistência a tospovírus e a potyvírus, nos anos agrícolas 2002/2003 e 2003/2004, respectivamente. No primeiro ano, a única espécie de tospovírus que ocorreu na área experimental foi Tomato chlorotic spot virus (TCSV). As sete linhagens do grupo IAC exibiram baixa porcentagem de plantas sintomáticas em duas avaliações, com médias abaixo de 28%; as cultivares testadas mostraram-se altamente suscetíveis, com médias acima de 85%, à exceção de 'Franco', que apresentou cerca de 55% de infecção. No segundo experimento, conduzido em 2003/2004, dez linhagens do grupo IAC foram comparadas com cinco cultivares de polinização aberta e híbridos F1, além do acesso LA-444-1 de L. peruvianum. Nesse experimento, por meio de testes biológicos e sorológicos, verificou-se ocorrência generalizada de Potato virus Y (PVY). Foi determinado o percentual de plantas com sintomas e avaliada a intensidade dos sintomas mediante uso de escala de notas. Com base nos dois critérios, verificou-se que LA-444-1 apresenta alta resistência a PVY, que 'Tyrade' exibe comportamento intermediário, enquanto todos os demais genótipos demonstram alta suscetibilidade ao vírus. O comportamento dos genótipos avaliados neste trabalho mostra a necessidade de se considerar, nos programas de melhoramento do tomateiro, a introgressão de fatores de resistência não só a vírus de importância atual nas regiões produtoras, como geminivírus, mas também a outros vírus potencialmente nocivos à cultura, como tospovírus e potyvírus.

Detection and partial characterization of an isolate of Groundnut ringspot virus in Solanum sessiliflorum

The cubiu (Solanum sessiliflorum) fruit, originating in the Amazon basin, is commonly used in that region for food, medicine, and cosmetics. In an experimental culture of cubiu, in order to evaluate its adaptation to conditions in the Northern region of the state of Rio de Janeiro, it was observed plants with mosaic symptoms. A cubiu plant was collected and analyzed to identify the etiological agent. After mechanical passage through a local lesion host, a host range test was performed. The virus induced chlorotic local lesions in Chenopodium quinoa, necrotic local lesions in Gomphrena globosa, mosaic in S. sessiliflorum, leaf and stem necrosis in tomato (Lycopersicon esculentum) 'Rutgers', mosaic and leaf distortion in Datura stramonium and Physalis floridana, and necrotic local lesions followed by systemic necrosis and plant death in four Nicotiana species. Electron microscopic observations of ultra thin sections from infected cubiu leaves showed the presence of spheroidal, membrane-bound particles typical of tospovirus species. Analysis of the nucleocapsid protein from concentrated virus particles indicated the presence of a 28 kDa protein. RT-PCR was performed after total RNA extraction from infected IPA-6 tomato leaves. A fragment of approximately 0,8 kbp corresponding to the N gene was amplified, cloned and sequenced. The N protein from the cubiu isolate was 95% homologous to the Groundnut ringspot virus (GRSV) protein, and no more than 85% homologous to those from Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) and Chrysanthemun stem necrosis virus (CSNV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), and Tomato chlorotic spot virus (TCSV). This is the first report of the occurrence of GRSV (or any other plant virus) in cubiu.

RT-PCR-ELISA for detection of Apple stem grooving virus in apple trees

A method to detect Apple stem grooving virus (ASGV) based on reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was developed using primers ASGV4F-ASGV4R targeting the viral replicase gene, followed by a sandwich hybridisation, in microtiter plates, for colorimetric detection of the PCR products. The RT-PCR was performed with the Titan™ RT-PCR system, using AMV and diluted crude extracts of apple (Malus domestica) leaf or bark for the first strand synthesis and a mixture of Taq and PWO DNA polymerase for the PCR step. The RT-PCR products is hybridised with both a biotin-labelled capture probe linked to a streptavidin-coated microtiter plate and a digoxigenin (DIG)-labelled detection probe. The complex was detected with an anti-DIG conjugate labelled with alkaline phosphatase. When purified ASGV was added to extracts of plant tissue, as little as 400 fg of the virus was detected with this method. The assay with ASGV4F-ASGV4R primers specifically detected the virus in ASGV-infected apple trees from different origins, whereas no signal was observed with amplification products obtained with primers targeting the coat protein region of the ASGV genome or with primers specific for Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) and Apple stem pitting virus (ASPV). The technique combines the power of PCR to increase the number of copies of the targeted gene, the specificity of DNA hybridization, and the ease of colorimetric detection and sample handling in microplates.

Integração de dados em estudos de diversidade genética de tomateiro

O objetivo deste trabalho foi integrar dados de caracteres quantitativos, multicategóricos, moleculares e fitopatológicos para a avaliação da diversidade genética de subamostras de tomateiro do Banco de Germoplasma de Hortaliças da Universidade Federal de Viçosa (BGH-UFV). Foram utilizados dados de 67 subamostras de tomateiro do BGH-UFV, caracterizadas quanto a 19 caracteres quantitativos, 30 multicategóricos, 52 locos ISSR e à reação a três patógenos (Alternaria solani, Pseudomonas syringae pv. tomato e Tomato yellow spot virus). Inicialmente, a avaliação da diversidade entre as subamostras foi realizada para cada conjunto de caracteres individualmente, e indicou que a diversidade baseada em qualquer um dos conjuntos de dados não reflete a diversidade dos demais. Para a integração dos dados, codificaram-se os de natureza quantitativa em multicategóricos, por meio de cinco estratégias diferentes. A estratégia de divisão equitativa da amplitude dos dados em três classes foi a mais indicada, com correlação de 0,78 entre as matrizes de dissimilaridade dos dados codificados e originais. A análise de diversidade genética a partir da integração dos dados resultou em grupos com maior correspondência às origens das subamostras de tomateiro avaliadas, o que indica que a integração de dados de diferentes naturezas pode ser realizada com êxito pela conversão dos dados quantitativos em multicategóricos.

RT-PCR and Dot Blot hybridization methods for a universal detection of tospoviruses

Transcriptase reverse - polymerase chain reaction (RT-PCR) and dot blot hybridization with digoxigenin-labeled probes were applied for the universal detection of Tospovirus species. The virus species tested were Tomato spotted wilt virus, Tomato chlorotic spot virus, Groundnut ringspot virus, Chrysanthemum stem necrosis virus, Impatiens necrotic spot virus, Zucchini lethal chlorosis virus, Iris yellow spot virus. Primers for PCR amplification were designed to match conserved regions of the tospovirus genome. RT-PCR using distinct primer combinations was unable to simultaneously amplify all tospovirus species and consistently failed to detect ZLCV and IYSV in total RNA extracts. However, all tospovirus species were detected by RT-PCR when viral RNA was used as template. RNA-specific PCR products were used as probes for dot hybridization. This assay with a M probe (directed to the G1/G2 gene) detected at low stringency conditions all Tospovirus species, except IYSV. At low stringency conditions, the L non-radioactive probe detected the seven Tospovirus species in a single assay. This method for broad spectrum detection can be potentially employed in quarantine services for indexing in vitro germplasm.

Hipersensibilidade e necrose sistêmica em Nicotiana benthamiana transformada com o gene de resistência Sw-5 de tomateiro

O gene Sw-5 do tomateiro confere resistência a várias espécies de tospovírus e codifica uma proteína contendo domínios de ligação a nucleotídeos e repetições ricas em leucina. Tomateiros com Sw-5 exibem reações necróticas nas folhas inoculadas com tospovírus. Estas reações e a estrutura da proteína Sw-5 indicam que a resistência ocorre por meio do reconhecimento do patógeno e desencadeamento da resposta de hipersensibilidade. A capacidade de Sw-5 de conferir resistência a tospovírus em tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana Domin.) foi avaliada em plantas transgênicas. Uma construção com a seqüência aberta de leitura de Sw-5 e sua região 3’ não-traduzida sob controle do promotor 35S do CaMV foi utilizada para transformação de N. benthamiana via Agrobacterium tumefaciens. Plantas de progênies R1 foram inoculadas com um isolado de tospovírus e avaliadas quanto à ocorrência de reação de hipersensibilidade e resistência à infecção sistêmica. Em uma progênie com segregação 3:1 (resistente:suscetível), foi selecionada uma planta homozigota e sua progênie avaliada quanto ao espectro da resistência a tospovírus. Plantas com o transgene exibiram resposta de hipersensibilidade 48 h após a inoculação, sendo resistentes à infecção sistêmica. O fenótipo da resistência foi dependente do isolado viral e um isolado de Tomato chlorotic spot virus (TCSV) causou necrose sistêmica em todas as plantas inoculadas, enquanto que isolados de Groundnut ringspot virus (GRSV) e um isolado relacionado a Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) ficaram restritos ao sítio de infecção. Comparações do espectro da resistência obtido neste trabalho com aquele observado em outros membros da família Solanaceae indicam que as vias de transdução de sinais e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 são conservadas dentro desta família e polimorfismos genéticos nas vias de transdução de sinais ou em componentes das respostas de defesa podem resultar em diferentes níveis de resistência.

Anatomia de lesões foliares causadas pelo vírus da Mancha Clorótica do Clerodendrum, transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis em diferentes espécies

O gênero botânico Clerodendrum pertence à família Lamiaceae e compreende várias espécies ornamentais, Manchas cloróticas e necróticas em folhas de coração-sangrento foram observadas pela primeira vez em um jardim de Piracicaba, SP, associadas à infestação com Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). Exames de secções de tecidos das lesões foliares ao microscópio eletrônico revelaram ocorrência de efeitos citopáticos do tipo nuclear e concluiu-se que os sintomas eram causados por um vírus transmitido por Brevipalpus (VTB), o qual foi designado de mancha clorótica de Clerodendrum (Clerodendrum Chlorotic Spot Virus- ClCSV). O ClCSV é transmitido mecanicamente de coração-sangrento para coração-sangrento. Em ensaios preliminares foi transmitido por B. phoenicis e mecanicamente para várias outras plantas, além da ocorrência de sua disseminação natural por este ácaro para outras espécies. Visando complementar a caracterização do ClCSV foram feitos estudos sobre alterações anatômicas em folhas de plantas infectadas pelo ClCSV. Foram examinadas secções histológicas de folhas sadias e infectadas pelo ClCSV de C. x speciosum e de outras hospedeiras como Hibiscus schizopetalus, Salvia leucantha, Malvaviscus arboreus e Annona muricata. Constatou-se que o ClCSV causa alterações celulares semelhantes nas diferentes hospedeiras e os sintomas causados por este vírus são similares aos causados por outros vírus transmitidos por Brevipalpus como o vírus da leprose dos citros citoplasmático (Citrus Lepros Virus Cytoplasmic- CiLV-C) e nuclear (Citrus Leprosis Virus Nuclear- CiLV-N), mancha anular do cafeeiro (Coffee Ringspot Virus- CoRSV), mancha anular de Solanum violaefolium (Solanum violaefolium Ringspot Virus- SvRSV) e "Orchid Fleck Vírus" (OFV), representadas por hipertrofia e hiperplasia frequentemente acompanhadas de necrose nos tecidos do parênquima paliçádico e lacunoso.

Further molecular characterization of weed-associated begomoviruses in Brazil with an emphasis on Sida spp

Begomoviruses are whitefly-transmitted, single-stranded DNA viruses that are often associated with weed plants. The aim of this study was to further characterize the diversity of begomoviruses infecting weeds (mostly Sida spp.) in Brazil. Total DNA was extracted from weed samples collected in Viçosa (Minas Gerais state) and in some municipalities of Alagoas state in 2009 and 2010. Viral genomes were amplified by RCA, cloned and sequenced. A total of 26 DNA-A clones were obtained. Sequence analysis indicated the presence of 10 begomoviruses. All viral isolates from Blainvillea rhomboidea belonged to the same species, Blainvillea yellow spot virus (BlYSV ), thereby suggesting that BlYSV may be the only begomovirus present in this weed species. Four isolates represent new species, for which the following names are proposed: Sida yellow blotch virus (SiYBV), Sida yellow net virus (SiYNV), Sida mottle Alagoas virus (SiMoAV) and Sida yellow mosaic Alagoas virus (SiYMAV). Recombination events were detected among the SiYBV isolates and in the SiYNV isolate. These results constitute further evidence of the high species diversity of begomoviruses in Sida spp. However, the role of this weed species as a source of begomoviruses infecting crop plants remains to be determined.