Viabilidade celular, fagocitose e espraiamento de fagócitos mononucleares, e liberação de peróxido de hidrogênio por leucócitos de glândulas mamárias bovinas sadias e infectadas

O presente estudo objetivou avaliar a viabilidade celular, a capacidade de fagocitose e espraiamento pelos fagócitos mononucleares, e a liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) por leucócitos oriundos de glândulas mamárias bovinas sadias e infectadas. Deste modo, 94 amostras foram divididas de acordo com os resultados da cultura bacteriológica e da contagem de células somáticas (CCS). O presente estudo não encontrou diferenças na viabilidade celular, e nos índices de fagocitose e espraiamento entre os diferentes grupos. No entanto, a liberação de H2O2 oriundos dos quartos mamários infectados, infectados por Streptococcus spp. ou Corynebacterium spp. foi menor do que nas amostras de leite provenientes dos quartos mamários sadios. Ao estimar a concentração de H2O2 mL-1 leite observou-se que as amostras de quartos mamários positivos no exame bacteriológico, infectados por Staphylococcus spp. e negativos no exame bacteriológico com alta celularidade foram maiores que aquelas provenientes de quartos mamários sadios. Observou-se também correlação positiva entre a CCS e a viabilidade celular e os índices de fagocitose e espraiamento; e correlação negativa entre a liberação de H2O2 e a CCS e a viabilidade celular. Conclui-se que a CCS, assim como a sua viabilidade e função, são conceitos intimamente relacionados com a saúde da glândula mamária.

Viabilidade celular da fração mononuclear da medula óssea e fração vascular estromal do tecido adiposo de equinos após o processo de congelamento e descongelamento

Cinco cavalos adultos foram submetidos à coleta de medula óssea do esterno e de tecido adiposo da região glútea. As amostras foram processadas para obtenção da fração mononuclear da medula óssea e fração vascular estromal do tecido adiposo, o número de células obtidas e a viabilidade celular foram determinados. Em seguida, realizou-se o congelamento das amostras em solução contendo 20% de soro fetal bovino e 10% de dimetilsulfóxido. Depois de um mês, realizou-se o descongelamento das amostras e a viabilidade celular foi novamente mensurada. Os resultados revelaram que as técnicas utilizadas tanto para coleta de medula óssea quanto de tecido adiposo em equinos são simples, rápidas e seguras. As metodologias adotadas para o processamento das amostras foram eficientes, obtendo-se aproximadamente 95% de viabilidade celular. Após o descongelamento, a viabilidade média das amostras de células mononucleares da medula óssea foi de 86% e da fração vascular estromal do tecido adiposo de 64%. Frente à importância da terapia celular na clínica médica de equinos, concluiu-se que é necessária a realização de mais estudos, visando padronizar uma técnica de criopreservação que mantenha a integridade das células da fração mononuclear da medula óssea e da fração vascular estromal do tecido adiposo de equinos.

Efeitos in vitro de ocratoxina A, deoxinivalenol e zearalenona sobre a viabilidade celular e atividade de E-ADA em linfócitos de frangos de corte

Micotoxinas representam um vasto grupo de contaminantes químicos naturais originados a partir do metabolismo secundário de fungos filamentosos patogênicos. Elas são produzidas, principalmente, pelos gêneros Fusarium, Alternaria, Aspergillus e Penicillium, os quais podem contaminar grãos e cereais, como trigo, milho e soja. Conforme sua natureza e níveis de concentração, micotoxinas podem induzir efeitos tóxicos em animais de produção e humanos. Um estudo in vitro foi realizado para avaliar a susceptibilidade das células linfocitárias de frangos de corte a diferentes concentrações de ocratoxina A, deoxinivalenol e zearalenona. Cada micotoxina foi adicionada ao meio celular em diferentes concentrações (0,001; 0,01; 0,1 e 1μg/mL). A viabilidade celular e atividade de ecto-adenosina desaminase foram analisadas em 24, 48 e 72 horas através de ensaios colorimétricos. Para isso, foram utilizados 0,7x10(5) linfócitos/mL em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2,5 UI de penicilina/estreptomicina por mL, incubados em atmosfera de 5% de CO2 a 37 °C. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram expressos como média e erro padrão da média. Os resultados obtidos demonstraram que tanto ocratoxina A como deoxinivalenol induziram proliferação linfocitária e baixa atividade enzimática in vitro (P<0,05), enquanto zearalenona também induziu proliferação (P<0,05), mas nenhuma alteração na atividade enzimática (P>0,05). Foi possível correlacionar os dados referentes à viabilidade celular e atividade de ecto-adenosina desaminase, sugerindo que, em concentrações mínimas, as micotoxinas testadas não estimularam a atividade da enzima, que possui ação pró-inflamatória e contribui para o processo de imunossupressão e, portanto, evitando um decréscimo na viabilidade celular. Este é o primeiro estudo feito com OCRA, DON e ZEA sobre linfócitos de frangos de corte em cultivos in vitro na avaliação desses parâmetros.

Viabilidade celular de Saccharomyces cerevisiae cultivada em associação com bactérias contaminantes da fermentação alcoólica

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência de bactérias dos gêneros Bacillus e Lactobacillus, bem como de seus produtos metabólicos, na redução da viabilidade celular de leveduras Saccharomyces cerevisiae. As bactérias Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum foram cultivadas em associação com a levedura S. cerevisiae (cepa Y-904) por 72 horas a 32 °C, sob agitação. A viabilidade celular, a taxa de brotamento e a população de células de S. cerevisiae e a acidez total, a acidez volátil e o pH dos meios de cultivos foram determinados às 0, 24, 48 e 72 horas do cultivo misto. As culturas de bactérias foram tratadas através do calor, de agente antimicrobiano e de irradiação. Os resultados mostraram que apenas os meios de cultivo mais acidificados, contaminados com as bactérias ativas L. fermentum e B. subtilis, provocaram redução na viabilidade celular de S. cerevisiae. Excetuando a bactéria B. subtilis tratada com radiação gama, as demais bactérias tratadas pelos diferentes processos (calor, irradiação e antimicrobiano) não causaram diminuição da viabilidade celular e da população de S. cerevisiae, indicando que a presença isolada dos metabólitos celulares dessas bactérias não foi suficiente para reduzir a porcentagem de células vivas de S. cerevisiae.

Seleção de leveduras da Região Amazônica para produção de protease extracelular

O objetivo deste trabalho foi identificar 50 leveduras isoladas a partir de diferentes substratos da Região Amazônica e selecionar uma espécie de maior atividade proteolítica. Entre as 26 espécies identificadas predominaram Candida aquatica (12%) e Candida tropicalis (10%). A fermentação submersa foi realizada em Extrato de Malte suplementado com gelatina 1%, Candida intermedia foi a que expressou maior atividade proteolítica, halo = 25 mm e 273 U/mL, crescimento máximo a 30 ºC, viabilidade celular 6,2 x 10(6) UFC, em 48 horas, não demonstrou características de patogenicidade e a melhor densidade do inóculo foi 3%, utilizando-se culturas com 24 horas de crescimento em ágar Malte.

Capacidade fermentativa de Saccharomyces cerevisiae enriquecida com ácidos graxos

Levedura de panificaçao (Saccharomyces cerevisiae) foi obtida anaerobicamente (sem e com adição dos ácidos graxos palmítico, oleico e linoleico) e aerobicamente e utilizada em ensaios de fermentação com 14% e 16% de sacarose a 32°C. Não houve diferenças significativas, quanto a viabilidade celular, entre os tratamentos das leveduras com ácido oleico, ácido linoleico e aerobicamente (as quais foram ricas em palmitoleico e oleico). As leveduras enriquecidas com ácido palmítico e anaeróbicas apresentaram maior redução na viabilidade do que com ácidos graxos insaturados. Foi observado um aumento na produção de ácido pirúvico e uma redução nos álcoois superiores com a redução da viabilidade celular.

Aumento da produção de etanol a partir de melaço de cana-de-açúcar pela adição de benzoato

O efeito da adição de benzoato de sódio sobre a fermentação alcoólica de meio de melaço de cana-de-açúcar com 15% de açúcares redutores totais foi estudado utilizando a levedura industrial Saccharomyces cerevisiae M-300-A. Foram adicionados 7,5 miligramas de benzoato de sódio para 0,8 gramas de levedura seca durante 0, 2, 4 e 6 ciclos fermentativos. Com a adição de benzoato ocorreu aumento na produção de etanol, redução do crescimento da levedura e dos teores de glicerol e dos álcoois n-propílico, isobutílico e isoamílico. O inibidor não provocou redução da viabilidade celular e após a retirada do inibidor a levedura voltou a apresentar crescimento. Este fato sugere a possibilidade do uso do benzoato em destilarias de álcool combustível.

Efeito do nitrito sobre a fermentação alcoólica realizada por Saccharomyces cerevisiae

O efeito de concentrações de até 80 ppm de nitrito sobre a fermentação alcoólica foi estudado com levedura de panificação (Saccharomyces cerevisiae). Houve aumento no tempo de fermentação com adição de nitrito sem afetar a produção de etanol. Com a adição de 60 e 80 ppm de NO2-, ocorreu redução na viabilidade celular e brotamento acompanhada por aumento no acúmulo de trealose e glicogênio. Aumentando a concentração de nitrito houve aumento no álcool n-propílico e redução nos teores de álcoois isobutílico e isoamílico.

Uso de polímeros em formulações para preservação de Pectobacterium atrosepticum e Ralstonia solanacearum

A sobrevivência de Pectobacterium atrosepticum e de Ralstonia solanacearum foi avaliada em veículo à base de goma xantana (GX), um polímero biológico, e de goma xantana acrescida de polivinilpirrolidona (PVP), um polímero sintético. As culturas, após crescimento até 10(11) ufc mL-1 foram injetadas junto a essas formulações e a sobrevivência avaliada em diferentes condições de armazenamento: em temperatura ambiente, em refrigerador (4ºC) e em freezer (-20ºC), por 36 meses. A concentração de células viáveis foi realizada através de diluições seriadas. A patogenicidade foi avaliada em plantas hospedeiras e em iscas. Os resultados permitem observar que a concentração de células viáveis decresceu ao longo do tempo, mantendo-se entre 10³ e 10(4) ufc mL-1 ao final de três anos, exceto para a formulação à base de GX e armazenamento à -20°C, que se mostrou ineficiente para ambas as bactérias. Conclui-se, que os polímeros avaliados mostraram-se eficientes em preservar e manter as características bioquímicas e fisiológicas das bactérias Pectobacterium atrosepticum e de Ralstonia solanacearum.

Aspectos histológicos do ovário de coelhas após criopreservação

OBJETIVO: avaliar a preservação folicular e as características celulares do tecido ovariano criopreservado, em coelhas. MÉTODOS: fez-se, sob anestesia, a ooforectomia direita de dez coelhas brancas, adultas. Dissecou-se o ovário mantendo-se o córtex com espessura de 1,5 milímetros. Fragmentou-se o tecido em pequenas secções, algumas para o estudo histológico de controle e outras destinadas à criopreservação pelo protocolo de congelamento lento. Passadas seis semanas efetuou-se o descongelamento e fez-se a avaliação histológica. As amostras do controle e do experimento, após processamento, foram coradas pela hematoxilina-eosina para identificação dos aspectos histológicos e submetidas à técnica imuno-histoquímica utilizando-se o PCNA (proliferating cell nuclear antigen) para a avaliação da viabilidade celular. Utilizaram-se os testes não paramétricos "comparação entre duas proporções" e Mann-Whitney e o teste paramétrico t de Student. RESULTADOS: observou-se que no tecido criopreservado só persistiram oócitos primordiais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se: vacuolização citoplasmática em todas as amostras (p=0,039), lise estromal em 50% (p=0,648) e oócitos com contornos irregulares em 80% (p=0,007). Encontraram-se alterações irreversíveis como degeneração hialina e picnose em 30% das amostras (p=0,210). A análise imuno-histoquímica demonstrou os folículos, em diferentes estágios de desenvolvimento, no tecido não congelado e folículos primordiais no tecido criopreservado com positividade para o PCNA, indicando a presença de DNA ativo. CONCLUSÃO: no tecido ovariano criopreservado sobrevivem apenas os folículos primordiais; existem alterações histológicas reversíveis (vacuolização citoplasmática, lise estromal, fragmentação das células da granulosa e oócitos com contornos irregulares); alterações irreversíveis, em níveis não significantes (degeneração hialina e picnose) e presença de PCNA positivo em todos os folículos.

Comparação de dois métodos de colheita de medula óssea de equinos e de dois meios de diluição para o isolamento de células mononucleares

Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar a concentração e viabilidade da fração de células mononucleares (FCM) a partir de diferentes técnicas de colheita e processamento de medula óssea (MO) em equinos. Foram avaliados cinco equinos adultos, hígidos e sem raça definida. Obtiveram-se frações de medula óssea (MO) do osso esterno, de acordo com dois protocolos: na colheita A, utilizou-se 10mL de solução de heparina dentro da seringa e em seguida, aspirou-se a MO; na colheita B, 10mL de solução de heparina foi injetada na MO e a aspiração foi realizada após 20 segundos. Todos os animais foram submetidos aos dois protocolos de colheitas, realizadas em sequência, sem intervalo entre os dois procedimentos. Após isolamento da fração de células mononucleares (FCM), das amostras de MO obtidas nas colheitas A e B, cada amostra foi dividida em dois tubos, um contendo solução de DMEM e outro contendo PBS. Assim, alternando-se o tipo de colheita e a solução diluidora, obteve-se quatro tubos de amostras por animal. Os tubos foram centrifugados e os sedimentos foram homogeneizados nos respectivos meios obtendo-se o volume final de 100μL. Realizou-se determinação da concentração e viabilidade celular, obtendo-se as concentrações médias de FCM. Para ambos os meios de diluição, a colheita B apresentou valor numérico maior em comparação à colheita A, porém não foi significativo (p>0,05). Atribui-se tal tendência à menor ocorrência de coagulação da MO no momento da colheita B, sugerindo-se melhor aproveitamento da FCM. Não houve diferença (p>0,05) entre os meios DMEM ou PBS, indicando que os mesmos não alteraram a viabilidade celular. Os protocolos utilizados para colheita de MO e separação da FCM se mostraram eficientes, para o uso em terapia celular em equinos.

Efeito e modo de ação das bacteriocinas produzidas por Lactococcus lactis subsp. lactis ITAL 383, ATCC 11454 e CNRZ 150 contra Listeria innocua LIN 11

O efeito e o modo de ação das bacteriocinas produzidas por L. lactis subsp. lactis ITAL 383 e CNRZ 150 são similares à nisina de L. lactis subsp. lactis ATCC 11454. Estas bacteriocinas apresentaram um modo de ação bactericida, causando a lise de células de L. innocua LIN 11, associada ao decréscimo da absorbância e da viabilidade celular. O efeito letal foi maior para células em fase exponencial comparativamente à fase estacionária de crescimento. A adsorção dessas bacteriocinas às células de L. innocua LIN 11 foi muito rápida e influenciada pelo pH do meio de suspensão; adsorção máxima foi verificada a pH 6,0 e logo após o contato inicial. Perda completa de adsorção ocorreu em pH 2,0.

Fermentação de trealose e glicogênio endógenos em Saccharomyces cerevisiae

As linhagens PE-2 e VR-1 de Saccharomyces cerevisiae foram submetidas à fermentação das reservas endógenas na temperatura de 40oC. No intervalo de 0 a 24 horas foram recolhidas as amostras para a determinação de etanol, nitrogênio no fermento e no vinho, bem como os carboidratos de reserva (trealose e glicogênio) e a viabilidade celular. A trealose foi esgotada durante 24 horas. Os teores de glicogênio sofreram muitas oscilações ao longo do tempo, entre a mobilização e a síntese e embora não esgotado, deve ter contribuído significativamente para a formação de álcool na suspensão. Foi observada a relação proporcional entre a mobilização de trealose e a queda da viabilidade celular. No transcorrer da fermentação das reservas de carboidratos houve aumento nos teores de nitrogênio no fermento até 6 e 8 horas, sendo tal incremento afetado pela linhagem de levedura. No prosseguimento da fermentação ocorreu a autólise celular, que foi percebida pelo aumento brusco de nitrogênio no vinho (de 200 para 1500mg/L) e pela queda da viabilidade celular. O ganho alcançado com a fermentação endógena foi de 40 e 68 litros de álcool por tonelada de levedura seca com incremento de 25 e 27% de proteína no fermento para as linhagens PE-2 e VR-1, respectivamente. Este resultado tem reflexos positivos quando da comercialização da levedura seca como proteína microbiana.

Cultura lática mista com potencial de aplicação como cultura iniciadora em produtos cárneos

Bactérias viáveis adicionadas em produtos cárneos com a finalidade de melhorar a qualidade sanitária, as características sensoriais e reduzir nitritos, são denominadas de cultura iniciadora. Pode ser constituída de cultura pura ou mista com habilidade em produzir substâncias antimicrobianas como ácido lático e bacteriocinas, capazes de inibir microrganismos indesejáveis ao produto alimentício. Neste trabalho, avaliou-se algumas associações entre bactérias láticas, Lactobacillus, Pediococcus e Enterococcus, visando obter culturas láticas com habilidade bioquímica para fermentação homolática; alta viabilidade celular; tolerância ao sais NaCl e NaNO2; capacidade de reduzir nitritos e inibir patógenos como S. aureus; Salmonella spp. e E. coli enteropatogênica. Os cultivos foram desenvolvidos em MRS, incubados a 37ºC por 48 horas. O ácido lático foi determinado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Nitrito residual foi determinado por espectrofotometria. A fermentação homolática com melhor produção de ácido lático (4,61%) e alta viabilidade celular (3 x 10(15) UFC/mL) foi obtida pela cultura constituída de L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium . A cultura mista selecionada apresentou alta viabilidade celular (1x10(14) UFC/mL), mesmo em altas concentrações de NaCl e NaNO2. O caldo fermentado apresentou 99% de redução do nitrito inicial. A cultura lática mista selecionada inibiu S. aureus, Salmonella spp. e E. coli em ágar BHI. Em lingüiça frescal, observou-se a diminuição da contagem de S. aureus e coliformes totais em relação ao controle. Salmonella spp. não foi detectada nas amostras testadas. Os resultados mostram a possibilidade de aplicação da cultura mista selecionada como cultura iniciadora em produtos cárneos.

Influência da fonte de carbono e da temperatura sobre a fermentação lática desenvolvida por cultura mista de bactérias láticas

Bactérias ácido láticas vêm sendo aplicadas em produtos cárneos como culturas iniciadoras. A finalidade das culturas iniciadoras em produtos cárneos é reduzir o pH no início da fermentação O que contribui na inibição de microrganismos indesejáveis, melhorar as propriedades sensoriais, reduzir o tempo de maturação e reduzir nitratos e nitritos. A composição do meio, assim como as condições de cultivo, são importantes para o bom desenvolvimento da cultura iniciadora, sendo necessário conhecer a influência da fonte de carbono e da temperatura no processo fermentativo. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos da temperatura e de diferentes concentrações de glicose e lactose sobre a fermentação lática desenvolvida em caldo MRS (Man-Rogosa-Sharpe) pela cultura mista constituída de L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium. O caldo MRS foi suplementado com glicose e lactose, e as temperaturas de fermentação foram de 28ºC, 37ºC e 46ºC. Os ensaios foram delineados por desenho fatorial incompleto de 3³. Através da Superfície de Resposta, o modelo matemático mostrou que o caldo MRS suplementado de glicose 4,5% (m/v) e lactose 0,5% (m/v) e temperatura de incubação de 46ºC foram as condições mais adequadas para obtenção de ácido lático. A fermentação lática desenvolvida pela cultura mista, durante 48 horas nestas condições, forneceu em média 4,78% de ácido lático sendo a viabilidade celular de 1x10(15)UFC/mL.