Purification of bovine pancreatic glucagon as a by-product of insulin production

A process for purifying bovine pancreatic glucagon as a by-product of insulin production is described. The glucagon-containing supernatant from the alkaline crystallization of insulin was precipitated using ammonium sulfate and isoelectric precipitation. The isoelectric precipitate containing glucagon was then purified by ion-exchange chromatography on Q-Sepharose FF, gel filtration on Sephadex G-25 and ion-exchange chromatography on S-Sepharose FF. A pilot scale test was performed with a recovery of 87.6% and a purification factor of 8.78 for the first chromatographic step, a recovery of 75.1% and a purification factor of 3.90 for the second, and a recovery of 76.2% and a purification factor of 2.36 for the last one. The overall yield was 50%, a purification factor of 80.8 was obtained and the fraction containing active glucagon (suitable for pharmaceutical preparations) was 84% pure as analyzed by HPLC

High quality human immunoglobulin G purified from Cohn fractions by liquid chromatography

In order to obtain intravenous immunoglobulin G (iv IgG) of high quality from F-I+II+III or F-II+III pastes prepared by the Cohn method, we developed a chromatography process using ion exchange gels, Q-Sepharose FF and CM-Sepharose FF, and Sephacryl S-300 gel filtration. Viral inactivation was performed by incubating the preparation with pepsin at pH 4.0 at 35oC for 18 h. The characteristics of 28 batches produced by us were: yield 4.3 ± 0.2 g/l plasma, i.e., a recovery of 39.1 ± 1.8%; IgG subclasses distribution: IgG1 = 58.4%, IgG2 = 34.8%, IgG3 = 4.5% and IgG4 = 2.3%; IgG size distribution was 98.4% monomers, 1.2% dimers and 0.4% polymers and protein aggregates; anticomplement activity was less than 0.5 CH50/mg IgG, and prekallikrein activator activity (PKA) was less than 5 IU/ml. These characteristics satisfied the requirements of the European Pharmacopoea edition, and the regulations of the Brazilian Health Ministry (M.S. Portaria No. 2, 30/10/1998).

Streptococcus mutans GlnK protein: an unusual PII family member

Streptococcus mutans is a Gram-positive bacterium present in the oral cavity, and is considered to be one of the leading causes of dental caries. S. mutans has a glnK gene, which codes for a PII-like protein that is possibly involved in the integration of carbon, nitrogen and energy metabolism in several organisms. To characterize the GlnK protein of S. mutans, the glnK gene was amplified by PCR, and cloned into the expression vectors pET29a(+) and pET28b(+). The native GlnK-Sm was purified by anion exchange (Q-Sepharose) and affinity (Hi-Trap Heparin) chromatography. The GlnK-His-Sm protein was purified using a Hi-Trap Chelating-Ni2+ column. The molecular mass of the GlnK-His-Sm proteins was 85 kDa as determined by gel filtration, indicating that this protein is a hexamer in solution. The GlnK-His-Sm protein is not uridylylated by the Escherichia coli GlnD protein. The activities of the GlnK-Sm and GlnK-His-Sm proteins were assayed in E. coli constitutively expressing the Klebsiella pneumoniae nifLA operon. In K. pneumoniae, NifL inhibits NifA activity in the presence of high ammonium levels and the GlnK protein is required to reduce the inhibition of NifL in the presence of low ammonium levels. The GlnK-Sm protein was unable to reduce NifL inhibition of NifA protein. Surprisingly, the GlnK-His-Sm protein was able to partially reduce NifL inhibition of the NifA protein under nitrogen-limiting conditions, in a manner similar to the GlnK protein of E. coli. These results suggested that S. mutans GlnK is functionally different from E. coli PII proteins.

Expression, production, and renaturation of a functional single-chain variable antibody fragment (scFv) against human ICAM-1

Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is an important factor in the progression of inflammatory responses in vivo. To develop a new anti-inflammatory drug to block the biological activity of ICAM-1, we produced a monoclonal antibody (Ka=4.19×10−8 M) against human ICAM-1. The anti-ICAM-1 single-chain variable antibody fragment (scFv) was expressed at a high level as inclusion bodies in Escherichia coli. We refolded the scFv (Ka=2.35×10−7 M) by ion-exchange chromatography, dialysis, and dilution. The results showed that column chromatography refolding by high-performance Q Sepharose had remarkable advantages over conventional dilution and dialysis methods. Furthermore, the anti-ICAM-1 scFv yield of about 60 mg/L was higher with this method. The purity of the final product was greater than 90%, as shown by denaturing gel electrophoresis. Enzyme-linked immunosorbent assay, cell culture, and animal experiments were used to assess the immunological properties and biological activities of the renatured scFv.

Isolamento da globulina majoritária, digestibilidade in vivo e in vitro das proteínas do tremoço-doce (Lupinus albus L.), var. Multolupa

Os objetivos do trabalho foram isolar, purificar e estudar algumas propriedades da fração globulina majoritária de tremoço-doce, var. Multolupa; assim como avaliar as características de digestibilidade da farinha e frações isoladas. As frações protéicas foram separadas por fracionamento diferencial com uso de diferentes solventes. A globulina majoritária de tremoço-doce foi isolada, purificada por cromatografia em Q-Sepharose, revelando um único pico de proteína. Apresentou um peso molecular de 162,5 ± 10,0 kDa, determinado por cromatografia em Sephacryl S-300, e subunidades entre 20-70 kDa em PAGE-SDS. A solubilidade em função do pH e concentrações de NaCl revelaram curva típica dessa fração. A digestibilidade da proteína da farinha e das frações albumina, globulina e glutelina foi avaliada por experimentos in vitro e in vivo e se revelou alta para a fração globulina, seguida pela glutelina, albumina e farinha. A digestibilidade in vivo da fração globulina, tanto aparente quanto verdadeira, não diferiu significativamente daquela determinada para a caseína. Apesar da alta digestibilidade da fração majoritária e frações protéicas, a utilização como única fonte de proteína nas dietas revelou valores baixos de RPLR (razão protéica líquida relativa), indicando ser insuficiente para sustentar o crescimento dos animais, comparativamente à caseína.

A Técnica Q - como instrumento de medida na área da educação em saúde

Foi elaborado um instrumento de medida baseado na Técnica Q de W. Stephenson, cujas operações exigidas são semelhantes às primeiras etapas de construção de uma Escala Thurstone, pelo método de intervalos aparentemente iguais. Utilizando-se desse instrumento, foi realizado estudo sobre a "Percepção da Função do Educador de Saúde Pública, na Equipe de Saúde", desenvolvido em duas fases: a primeira, compreendendo a construção do Instrumento, propriamente dito, e a segunda, a execução de uma pesquisa exploratória fazendo uso do referido instrumento. São descritos todos os passos da primeira fase, que compreende: a coleta de informações sobre as atribuições da função do educador de saúde pública; listagem das mesmas, convertendo-as em afirmações transcritas em cartões: seleção de uma amostra de 70 cartões, por um corpo de juizes altamente especializado; tabulação dos dados obtidos e a definição do instrumento definitivo. Para preencher os requisitos de validade, a distribuição escalar deveria apresentar um certo equilíbrio entre as afirmações não pertinentes, intermediárias e pertinentes. Para a conveniência estatística e para garantir este equilíbrio, cada juiz foi instruído a colocar números variados de cartões em várias pilhas, fazendo de sua totalidade um continuum que se aproximasse de uma distribuição normal ou quase normal. Este equilíbrio foi alcançado e a distribuição de freqüência das afirmações amostradas pelos juizes demonstrou ótima concordância interna, o que permitiu considerar satisfatório este estudo. As 70 afirmações foram confirmadas como componentes definitivo do instrumento de medida PF-ESP-Percepção da Função do Educador de Saúde Pública, para a utilização na segunda fase desse estudo.

Fiebre "Q" en Uruguay

Los autores hacen una revisión de la problemática referida a la fiebre Q, tanto desde el punto de vista clínico como epidemiológico. El primer caso nacional se comunicó en el año 1956, en un adulto, obrero de frigorífico. En 1966 se comunica el primer caso en un niño. A partir de esa fecha se realizan varias encuestas serológicas en humanos y en animales. En seres humanos los hallazgos varían entre 4.2% y 5.5% según el año estudiado. En animales se hallaron valores que oscilaron entre 0.9% (animal para abasto) y 30% (animal tipo industria) para bovinos. En ovinos, en el único estudio se halló un 10.3% de positivos. En equinos los valores de positividad variaron de 5.5% a 21.7%. En suinos se refiere un porcentaje de positividad del 21.2% en la primera encuesta, sendo en la más reciente del 0.0%. En aves y cobayos no se evidenciaron sueros positivos. Entre 1975 y 1985 los autores estudiaron 14 brotes en seres humanos en esta-blecimentos de procesamiento de carne, con un total de 1358 casos estudiados, habiéndose confirmado el 60% de ellos. Pasan revista a la sintomatologia común, así como el tipo de tarea de los pacientes. Para los estudios serológicos, como los diagnósticos de los casos clínicos, los autores utilizaron la fijación del complemento, la aglutinación capilar y la microa-glutinación en lámina.

Questing one Brazilian query: reporting 16 cases of Q fever from Minas Gerais, Brazil

Q fever has been considered non-existing in Brazil where reports of clinical cases still cannot be found. This case-series of 16 patients is a result of a systematic search for such illness by means of clinical and serologic criteria. Serologic testing was performed by the indirect microimmunofluorescence technique using phase I/II C. burnetii antigens. Influenza-like syndrome was the most frequent clinical form (eight cases - 50%), followed by pneumonia, FUO (fever of unknown origin), mono-like syndrome (two cases - 12.5% each), lymphadenitis (one case - 6.3%) and spondylodiscitis associated with osteomyelitis (one case - 6.3%). The ages varied from four to 67 years old with a median of 43.5. All but one patient had positive serologic tests for phase II IgG whether or not associated with IgM positivity compatible with acute infection. One patient had both phase I and phase II IgG antibodies compatible with chronic Q fever. Seroconvertion was detected in 10 patients. Despite the known limitations of serologic diagnosis, the cases here reported should encourage Brazilian doctors to include Q fever as an indigenous cause of febrile illness.

QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (Q-PCR) FOR SPUTUM SMEAR DIAGNOSIS OF PULMONARY TUBERCULOSIS AMONG PEOPLE WITH HIV/AIDS

Objective: To assess quantitative real-time polymerase chain reaction (q-PCR) for the sputum smear diagnosis of pulmonary tuberculosis (PTB) in patients living with HIV/AIDS with a clinical suspicion of PTB.Method: This is a prospective study to assess the accuracy of a diagnostic test, conducted on 140 sputum specimens from 140 patients living with HIV/AIDS with a clinical suspicion of PTB, attended at two referral hospitals for people living with HIV/AIDS in the city of Recife, Pernambuco, Brazil. A Löwenstein-Jensen medium culture and 7H9 broth were used as gold standard.Results: Of the 140 sputum samples, 47 (33.6%) were positive with the gold standard. q-PCR was positive in 42 (30%) of the 140 patients. Only one (0.71%) did not correspond to the culture. The sensitivity, specificity and accuracy of the q-PCR were 87.2%, 98.9% and 95% respectively. In 39 (93%) of the 42 q-PCR positive cases, the CT (threshold cycle) was equal to or less than 37.Conclusion: q-PCR performed on sputum smears from patients living with HIV/AIDS demonstrated satisfactory sensitivity, specificity and accuracy, and may therefore be recommended as a method for diagnosing PTB.

Endocardite por Coxiella burnetii (febre Q): doença rara ou pouco diagnosticada? Relato de caso

A febre Q é uma zoonose de distribuição mundial causada por Coxiella burnetii, sendo raros os registros da doença no Brasil. Estudos soroepidemiológicos mostraram uma freqüência relativamente elevada de anticorpos contra Coxiella burnetii em populações com exposição ocupacional. Em humanos, pode se manifestar clinicamente como doença aguda ou crônica, sendo que a endocardite é a forma crônica mais freqüente da febre Q e de maior morbi-mortalidade. Relatamos um caso grave de endocardite por Coxiella burnetii adquirida no Brasil com desfecho fatal, apesar de antibioticoterapia adequada e tratamento cirúrgico valvar.

Molecular identification of the agent of Q fever – Coxiella burnetii – in domestic animals in State of Rio de Janeiro, Brazil

Introduction Over the last recent years, the number of Q fever cases have has increased throughout the world. An epidemiological investigation was performed in the area in which the first molecular documentation of Q fever in Brazil was previously reported. Methods Indirect immunofluorescence assay (IFA) and PCR of Coxiella burnetii targeting the htpAB gene were performed in samples from 14 dogs (blood); 1 cat (blood); 10 goats (blood, milk, vaginal swab and anal swab); 3 sheep (blood); and 2 horses (blood). Results Two dogs, two sheep and five goats were seroreactive. DNA was amplified from 6 milk and 2 blood samples from goats and from dogs, respectively. The sequence of the amplicons exhibited 99% sequence similarity with the homologous sequence of the htpAB gene of C. burnetii RSA 331 (GenBank - CP000890). Conclusions The results confirm C. burnetii infection in animals in Rio de Janeiro and reinforce the need for the surveillance of Q fever in Brazil.

Validação para o português do Maugerl CaRdiac preventiOn-Questionnaire (MICRO-Q)

FUNDAMENTO: O Maugerl CaRdiac preventiOn-Questionnaire (MICRO-Q) é um instrumento específico, validado e utilizado para avaliar o conhecimento do paciente coronariano sobre aspectos relacionados à prevenção secundária da doença arterial coronariana (DAC). OBJETIVO: Traduzir, adaptar e validar o MICRO-Q para a língua portuguesa do Brasil. MÉTODOS: Duas traduções iniciais independentes foram realizadas para o português. Após sua comparação foi feita a tradução reversa, que foi revisada por um comitê e gerou a versão final, testada em um estudo-piloto. O instrumento foi aplicado em 212 pacientes coronarianos, com idade média de 60 a 72 anos (desvio padrão = 9,4; mín = 35; máx = 86), participantes de programas de reabilitação cardíaca. A consistência interna foi verificada por meio do coeficiente Alpha de Cronbach, a correlação através do Spearman Rho e a validade de construto foi verificada por análise fatorial exploratória. As médias foram analisadas comparando as escalas das questões corretas em função de variáveis, como idade, sexo, comorbidades associadas, grau de escolaridade, renda familiar, entre outros. RESULTADOS: A versão brasileira do MICRO-Q possui 25 questões. Essa versão, quanto à confiabilidade, apresentou Alpha de Cronbach de 0,64 e Spearman Rho das respostas corretas de 0,65. A análise fatorial revelou a existência de 6 fatores, relacionados aos domínios de conhecimento do questionário. A análise das características da população, em função das escalas das questões corretas, apresentou diferenças significativas apenas em função da renda familiar mensal e grau de escolaridade. CONCLUSÃO: A versão brasileira do MICRO-Q aprovada apresenta validade e confiabilidade adequadas para sua utilização em futuras pesquisas.

Construção e validação do "CADE-Q" para educação de pacientes em programas de reabilitação cardíaca

FUNDAMENTO: O conhecimento sobre a doença arterial coronariana pode ser considerado o primeiro passo para reduzir o risco de complicações cardíacas. OBJETIVOS: Construir e validar um instrumento capaz de avaliar e descrever o conhecimento do paciente coronariano em programas de reabilitação cardíaca, com a finalidade de educação. MÉTODOS: Para construção, foi realizada análise de artigos e estudo de campo para a apresentação de itens a uma equipe multidisciplinar associada à reabilitação cardíaca. Após análise, foi gerada a versão testada em um estudo-piloto. O instrumento, nomeado CADE-Q (Questionário para Educação do Paciente Coronariano), foi aplicado em 155 pacientes com idade de 61 ± 9 anos (mín = 36 ; máx = 86), participantes de programas de reabilitação cardíaca. Dos 155 pacientes, 114 eram homens. A consistência interna foi verificada pelo coeficiente Alpha de Cronbach. A reprodutibilidade foi testada através do coeficiente de correlação intraclasse (CCIC) e a validade de construto por análise fatorial exploratória. Foi realizada análise comparando os escores totais em função de características da população e entre os grupos de reabilitação (privado e público). RESULTADOS: A versão final possui 19 questões com 4 alternativas, com 4 quadrantes de conhecimento. O Alpha de Cronbach foi de 0,68 e CCIC foi de 0,783. A análise fatorial revelou 6 fatores, abrangendo três áreas de conhecimento, o que demonstra a multifatoriedade do instrumento. A análise das características da população em função do escore total apresentou diferenças significativas em função das variáveis do nível socioeconômico (tipo de reabilitação, renda familiar e escolaridade). CONCLUSÃO: O instrumento CADE-Q apresenta validade e confiabilidade adequadas para sua utilização na população brasileira em futuras pesquisas.