Homocisteína plasmática total e fator von Willebrand no diabete melito experimental

OBJETIVOS: Determinar os valores plasmáticos de homocisteína e fator von Willebrand, como marcador de disfunção endotelial, em ratos com diabete melito induzido por estreptozotocina. MÉTODOS: Trinta e cinco ratos (rattus norvegicus albinus), machos, adultos (180-200 g), randomizados em três grupos: controle (n=10) não receberam agente ou veículo; sham (n=10) receberam solução veículo da estreptozotocina; e diabético (n=15) receberam estreptozotocina. Após oito semanas de indução do diabete melito, os animais foram pesados, anestesiados e tiveram sangue colhido da aorta abdominal para determinação dos valores de homocisteína plasmática total, fator von Willebrand e glicemia. RESULTADOS: O modelo experimental foi reprodutível em 100% dos animais. A média das concentrações plasmáticas de homocisteína foi: 7,9 µmol/l (controle); 8,6 µmol/l (sham) e 6,1 µmol/l (diabético), com diferença entre os grupos (p<0,01). Pelo método de comparações múltiplas entre os grupos, observou-se que os valores no grupo diabético foram menores que no sham (p<0,01). A média dos valores do fator von Willebrand foi 0,15 U/l (controle), 0,16 U/l (sham) e 0,18 U/l (diabético), com diferença entre os grupos (p=0,03). A média dos seus valores no grupo diabético foi maior que no grupo controle (p<0,05). No grupo diabético não houve correlação entre homocisteína e fator von Willebrand. CONCLUSÃO: No diabete melito induzido por estreptozotocina constataram-se valores reduzidos de homocisteína e elevados de fator von Willebrand, sem, contudo, haver correlações entre si e com níveis de glicemia final.

Paciente portadora de doença de von Willebrand submetida a cirurgia da valva mitral: uma estratégia para o controle da coagulopatia

Relatamos o caso de uma mulher de 60 anos portadora da doença de von Willebrand tipo I, submetida a cirurgia da valva mitral. A paciente necessitou de cuidados especiais em razão da coagulopatia e foi necessária a utilização de concentrado de fator VIII (VIIIf) e fator de von Willebrand (vWf) antes, durante e depois da cirurgia. Não houve complicações durante e após a cirurgia. Nove meses depois, a paciente encontra-se assintomática. A correção para valores adequados de VIIIf e vWf permitiu a realização da cirurgia com segurança.

Fator von Willebrand e disfunção endotelial pulmonar. Implicações prognósticas

OBJETIVO: Avaliar alterações quantitativas e estruturais do fator von Willebrand (fvW) circulante em 40 pacientes com hipertensão pulmonar pré-capilar e verificar possíveis implicações prognósticas dos resultados iniciais, em um ano de seguimento. MÉTODOS: A atividade antigênica plasmática do fator von Willebrand (vWF:Ag) foi analisada por imunoeletroforese. A concentração de multímeros de baixo peso molecular em relação ao total de multímeros do fvW (MBPM%) e o grau de fragmentação de sua subunidade principal foram analisados por Western immunoblotting. RESULTADOS: Em 40 pacientes, observamos aumento significativo de vWF:Ag em relação aos controles (p<0,001). Também foi observado aumento de MBPM% (p<0,001), além de degradação patológica da subunidade do fvW (p<0,05). Em 11 pacientes que evoluíram para óbito no 1º ano, os valores iniciais de vWF:Ag foram 95% superiores em relação aos sobreviventes (p<0,001). Os não sobreviventes tiveram ainda 31% de aumento em MBPM% (p<0,005). A variável MBPM% foi selecionada por regressão logística (p<0,05), como preditor de óbito no primeiro ano de evolução. CONCLUSÃO: As alterações do fvW circulante, consideradas como índices de lesão endotelial, têm valor prognóstico em hipertensão arterial pulmonar, com potencial impacto em decisões terapêuticas, como a indicação de transplante cardiopulmonar.

The infection of microvascular endothelial cells with ExoU-producing Pseudomonas aeruginosa triggers the release of von Willebrand factor and platelet adhesion

An increased plasma concentration of von Willebrand factor (vWF) is detected in individuals with many infectious diseases and is accepted as a marker of endothelium activation and prothrombotic condition. To determine whether ExoU, a Pseudomonas aeruginosa cytotoxin with proinflammatory activity, enhances the release of vWF, microvascular endothelial cells were infected with the ExoU-producing PA103 P. aeruginosa strain or an exoU-deficient mutant. Significantly increased vWF concentrations were detected in conditioned medium and subendothelial extracellular matrix from cultures infected with the wild-type bacteria, as determined by enzyme-linked immunoassays. PA103-infected cells also released higher concentrations of procoagulant microparticles containing increased amounts of membrane-associated vWF, as determined by flow cytometric analyses of cell culture supernatants. Both flow cytometry and confocal microscopy showed that increased amounts of vWF were associated with cytoplasmic membranes from cells infected with the ExoU-producing bacteria. PA103-infected cultures exposed to platelet suspensions exhibited increased percentages of cells with platelet adhesion. Because no modulation of the vWF mRNA levels was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction assays in PA103-infected cells, ExoU is likely to have induced the release of vWF from cytoplasmic stores rather than vWF gene transcription. Such release is likely to modify the thromboresistance of microvascular endothelial cells.

von Willebrand factor antigen levels in plasma of patients with malignant breast disease

von Willebrand factor (vWF) is a protein that mediates platelet adherence to the subendothelium during primary hemostasis. High plasma vWF concentrations have been reported in patients with various types of cancer, such as head and neck, laryngeal and prostatic cancer, probably representing an acute phase reactant. In the present study we determined the plasma levels of vWF antigen (vWF:Ag) by quantitative immunoelectrophoresis in 128 female patients with breast cancer as well as in 47 women with benign breast disease and in 27 healthy female controls. The levels of vWF:Ag were 170.7 ± 78 U/dl in patients with cancer, 148.4 ± 59 U/dl in patients with benign disease and 130.6 ± 45 U/dl in controls (P<0.005). We also detected a significant increase in the levels of vWF:Ag (P<0.0001) in patients with advanced stages of the disease (stage IV = 263.3 ± 113 U/dl, stage IIIB = 194.0 ± 44 U/dl) as compared to those with earlier stages of the disease (stage I = 155.3 ± 65 U/dl, stage IIA = 146.9 ± 75 U/dl). In conclusion, vWF levels were increased in plasma of patients with malignant breast disease, and these levels correlated with tumor progression.

A mathematical framework for group analysis of von Willebrand factor multimeric composition following luminography

The objective of the present study was to establish a method for quantitative analysis of von Willebrand factor (vWF) multimeric composition using a mathematical framework based on curve fitting. Plasma vWF multimers from 15 healthy subjects and 13 patients with advanced pulmonary vascular disease were analyzed by Western immunoblotting followed by luminography. Quantitative analysis of luminographs was carried out by calculating the relative densities of low, intermediate and high molecular weight fractions using laser densitometry. For each densitometric peak (representing a given fraction of vWF multimers) a mean area value was obtained using data from all group subjects (patients and normal individuals) and plotted against the distance between the peak and IgM (950 kDa). Curves were constructed for each group using nonlinear fitting. Results indicated that highly accurate curves could be obtained for healthy controls and patients, with respective coefficients of determination (r²) of 0.9898 and 0.9778. Differences were observed between patients and normal subjects regarding curve shape, coefficients and the region of highest protein concentration. We conclude that the method provides accurate quantitative information on the composition of vWF multimers and may be useful for comparisons between groups and possibly treatments.

Association studies between -1185A/G von Willebrand factor gene polymorphism and coronary artery disease

High levels of von Willebrand factor (vWF) have been associated with cardiovascular disease. The A allele of the -1185A/G polymorphism in the 5'-regulatory region of the vWF gene was associated with the highest plasma vWF levels in a normal population. To examine the association between -1185A/G polymorphism and coronary artery disease (CAD), 173 Brazilian Caucasian subjects submitted to coronary angiography were studied. Of these, 57 (33%) had normal coronary arteries (control group) and 116 (67%) had CAD (patient group). Plasma vWF levels were higher in patients (145 U/dl) than in controls (130 U/dl), but the differences were significant only for O blood group subjects. Polymerase chain reaction amplification of the 864-bp vWF promoter region followed by AccII restriction digestion was used to identify the -1185A/G genotypes. The -1185A allele frequency was 43.1% in patients and 44.7% in controls. Allele and genotype frequencies were not significantly different between patients and controls. No association was observed between the -1185A/G genotypes and plasma vWF levels in patients or controls. These results suggest that -1185A/G polymorphism is not an independent risk factor for CAD.

Plasma von Willebrand factor as a predictor of survival in pulmonary arterial hypertension associated with congenital heart disease

Biomarkers have been identified for pulmonary arterial hypertension, but are less well defined for specific etiologies such as congenital heart disease-associated pulmonary arterial hypertension (CHDPAH). We measured plasma levels of eight microvascular dysfunction markers in CHDPAH, and tested for associations with survival. A cohort of 46 inoperable CHDPAH patients (age 15.0 to 60.2 years, median 33.5 years, female:male 29:17) was prospectively followed for 0.7 to 4.0 years (median 3.6 years). Plasma levels of von Willebrand factor antigen (VWF:Ag), tissue plasminogen activator (t-PA) and its inhibitor (PAI-1), P-selectin, reactive C-protein, tumor necrosis factor alpha, and interleukin-6 and -10 were measured at baseline, and at 30, 90, and 180 days in all subjects. Levels of six of the eight proteins were significantly increased in patients versus controls (13 to 106% increase, P < 0.003). Interleukin-10 level was 2.06 times normal (P = 0.0003; Th2 cytokine response). Increased levels of four proteins (t-PA, PAI-1, P-selectin, and interleukin-6) correlated with disease severity indices (P < 0.05). Seven patients died during follow-up. An average VWF:Ag (mean of four determinations) above the level corresponding to the 95th percentile of controls (139 U/dL) was independently associated with a high risk of death (hazard ratio = 6.56, 95%CI = 1.46 to 29.4, P = 0.014). Thus, in CHDPAH, microvascular dysfunction appears to involve Th2 inflammatory response. Of the biomarkers studied, plasma vWF:Ag was independently associated with survival.

Plasmatic ADAMTS-13 metalloprotease and von Willebrand factor in children with cyanotic congenital heart disease

Changes in plasma von Willebrand factor concentration (VWF:Ag) and ADAMTS-13 activity (the metalloprotease that cleaves VWF physiologically) have been reported in several cardiovascular disorders with prognostic implications. We therefore determined the level of these proteins in the plasma of children with cyanotic congenital heart disease (CCHD) undergoing surgical treatment. Forty-eight children were enrolled (age 0.83 to 7.58 years). Measurements were performed at baseline and 48 h after surgery. ELISA, collagen-binding assays and Western blotting were used to estimate antigenic and biological activities, and proteolysis of VWF multimers. Preoperatively, VWF:Ag and ADAMTS-13 activity were decreased (65 and 71% of normal levels considered as 113 (105-129) U/dL and 91 ± 24% respectively, P < 0.003) and correlated (r = 0.39, P = 0.0064). High molecular weight VWF multimers were not related, suggesting an interaction of VWF with cell membranes, followed by proteolytic cleavage. A low preoperative ADAMTS-13 activity, a longer activated partial thromboplastin time and the need for cardiopulmonary bypass correlated with postoperative bleeding (P < 0.05). Postoperatively, ADAMTS-13 activity increased but less extensively than VWF:Ag (respectively, 2.23 and 2.83 times baseline, P < 0.0001), resulting in an increased VWF:Ag/ADAMTS-13 activity ratio (1.20 to 1.54, respectively, pre- and postoperative median values, P = 0.0029). ADAMTS-13 consumption was further confirmed by decreased ADAMTS-13 antigenic concentration (0.91 ± 0.30 to 0.70 ± 0.25 µg/mL, P < 0.0001) and persistent proteolysis of VWF multimers. We conclude that, in pediatric CCHD, changes in circulating ADAMTS-13 suggest enzyme consumption, associated with abnormal structure and function of VWF.

Estudo de fatores pró-trombóticos e pró-inflamatórios na cardiomiopatia chagásica

FUNDAMENTO: A relação entre atividade inflamatória e pró-trombótica na cardiomiopatia chagásica e em outras etiologias é obscura. OBJETIVO: Estudar o perfil de marcadores pró-trombóticos e pró-inflamatórios em pacientes com insuficiência cardíaca chagásica e compará-los com os de etiologia não chagásica. MÉTODOS: Coorte transversal. Critérios de inclusão: fração de ejeção do VE (FEVE) < 45% e tempo de início de sintomas > um mês. Os pacientes foram divididos em dois grupos: grupo 1 (G1) - sorologias positivas para Chagas - e grupo 2 (G2) - sorologias negativas para Chagas. Fator pró-inflamatório: PCR ultrassensível. Fatores pró-trombóticos: fator trombina-antitrombina, fibrinogênio, antígeno do fator de von Willebrand, P-selectina plasmática e tromboelastograma. Amostra calculada para poder de 80%, assumindo-se diferença de 1/3 de desvio-padrão; p significativo se < 0,05. Análise estatística: teste exato de Fischer para variáveis categóricas; teste t de Student não pareado para variáveis contínuas paramétricas e teste de Mann-Whitney para variáveis contínuas não paramétricas. RESULTADOS: Entre janeiro e junho de 2008, foram incluídos 150 pacientes, 80 no G1 e 70 no G2. Ambos os grupos mantinham médias de PCR ultrassensível acima dos valores de referência, porém, sem diferença significativa (p=0,328). Os níveis de fibrinogênio foram maiores no G2 do que no G1 (p=0,015). Entre as variáveis do tromboelastograma, os parâmetros MA (p=0,0013), G (p=0,0012) e TG (p=0,0005) foram maiores no G2 em comparação ao G1. CONCLUSÃO: Não há indícios de maior status pró-trombótico entre chagásicos. A dosagem de fibrinogênio e dos parâmetros MA, G e TG do tromboelastograma apontam para status pró-trombótico entre não chagásicos. Ambos os grupos tinham atividade inflamatória exacerbada.

Aspectos epidemiológicos e anatomopatológicos do hemagiossarcoma em cães: 40 casos (1965-2012)

Os aspectos epidemiológicos e anatomopatológicos de casos de hemangiossarcoma em cães da Região Central do RS foram estudados. Dos casos avaliados (n=40), cães idosos e da raça Pastor Alemão foram nitidamente os mais afetados (72,2% e 20% dos casos, respectivamente), visto que na população total de cães necropsiados nesse mesmo período (n=7.063) essa faixa etária e raça tiveram comparativamente uma prevalência bem mais baixa (14,6% e 10,1% dos casos, respectivamente). Na necropsia (n=40), os tumores ocorreram quase sempre como nódulos (92,5%) e, menos frequentemente, como massas (37,5%), e afetaram principalmente: baço (62,5%), pulmão (60%), fígado (52,5%), peritônio (42,5%), rim (37,5%), encéfalo (30%), pleura (25%) e coração (22,5%). Hemoperitônio (42,5%) e, consequentemente, anemia (22,5%) foram vistos com certa frequência. Na histologia (n=25), os hemangiossarcomas eram principalmente bem diferenciados (84%), de baixo grau (64%) e com estroma escasso (84%), mas frequentemente (68%) havia áreas com células demonstrando algum grau de atipia. Necrose, hemorragia e trombose foram vistos em todos os casos, mas hematopoiese extramedular (28%) e proliferação angiomatosa benigna (12%) foram achados menos comuns. Na imuno- -histoquímica (n=24), utilizando anticorpo anti-fator de von Willebrand, todos os casos demonstraram marcação de intensidade variável com um padrão citoplasmático finamente granular. Em relação à classificação anatômica, 55% dos hemangiossarcomas foram considerados como multicêntricos, 30% como primários com metástase(s) e 15% como solitários. Esse artigo discute esses resultados e propõe, com base em combinações de órgãos afetados, um esquema de separação entre hemangiossarcomas primário com metástase(s) e multicêntrico, a fim de tentar homogeneizar a maneira com que patologistas veterinários referem-se a esse neoplasma.

Intoxicação por selênio em suínos no Sul do Brasil

São descritos dois surtos de intoxicação por selênio em suínos na região Sul do Brasil. Foram acometidos leitões em fase de creche, entre 27 e 22 dias, com mortalidade variando de 16% a 15,3% (Surto 1 e 2 respectivamente). Os suínos apresentaram poliomielomalacia simétrica focal e lesões de casco, que inicialmente eram caracterizadas por uma linha avermelhada na borda coronária que evoluía nos suínos sobreviventes para desprendimento do casco. Os sinais clínicos iniciaram após seis dias (Surto 1) e 30 horas (Surto 2) da introdução da ração com alto teor de selênio. O surgimento dos sinais foi abrupto, caracterizado por andar cambaleante, com evolução para paralisia dos membros pélvicos e posteriormente tetraparesia. Macroscopicamente observaram-se focos circulares amarelados com áreas deprimidas mais escuras, restritas ao corno ventral da substância cinzenta em intumescências cervical e lombar. Microscopicamente essas áreas corresponderam à malacia da substância cinzenta, caracterizada por microcavitações, perda neuronal, cromatólise, neuronofagia, infiltrado de células Gitter, microgliose, astrócitos de Alzheimer tipo II e proliferação de células endoteliais evidenciadas na imunohistoquímica (IHQ) para fator de von Willebrand. Ainda, no segundo surto, dois animais apresentaram vacuolização difusa do citoplasma de neurônios e em um suíno foram observados astrócitos gemistocíticos. Na IHQ para GFAP ficou evidenciada uma astrocitose e astrogliose. Além dessas alterações medulares, em dois suínos observou-se, polioencefalomalácia simétrica no tronco encefálico. Em amostras de ração, detectou-se 3,38ppm (Surto 1) e 154ppm (Surto 2) de Se/kg e em amostras de fígado foram encontradas dosagens superiores a 3,34ppm (variando de 3,34 até 10ppm). No Surto 2, após 44 dias da retirada da ração, foi realizada eutanásia de seis suínos para monitoramento de níveis hepáticos de selênio (dois suínos controles e quatro sobreviventes ao surto) e todos apresentaram níveis normais de selênio no fígado.

Microangiopatias trombóticas: púrpura trombocitopênica trombótica e síndrome hemolítico-urêmica

As microangiopatias trombóticas (MATs) são condições caracterizadas por oclusão microvascular generalizada por trombos de plaquetas, trombocitopenia, e anemia hemolítica microangiopática. Duas manifestações fenotípicas típicas das MATs são a síndrome hemolítica urêmica (SHU) e a púrpura trombocitopênica trombótica (PTT). Outras doenças ocasionalmente apresentam manifestações similares. Na dependência de prevalecer a lesão renal ou a cerebral, duas entidades patologicamente indistinguíveis, mas de alguma forma clinicamente diferentes, têm sido descritas: a SHU e a PTT. Injúria das células endoteliais é o fator desencadeante central na sequência de eventos que levam a MAT. Perda da trombo resistência fisiológica, adesão de leucócitos no endotélio lesado, consumo de complemento, liberação e fragmentação anormais do fator de von Willebrand (FvW), e aumento do estresse de cisalhamento vascular podem sustentar e ampliar o processo microangiopático. Anormalidades intrínsecas do sistema do complemento e do FvW podem acompanhar a predisposição genética à doença, que pode ter um papel chave, em particular nas formas recorrentes e familiares. Nos casos de SHU associada à diarreia (SHU+D), o dano endotelial renal é mediado (pelo menos em parte) pela Shigatoxina (Stx) bacteriana, uma família de toxinas elaboradas por certas cepas da Escherichia coli e Shigella dysenteriae. A evolução é geralmente boa na criança, na SHU associada a Stx, enquanto sequelas renais e neurológicas são mais frequentemente encontradas em adultos, formas familiares e atípicas da SHU e na PTT. Estudos recentes têm demonstrado que a deficiência na clivagem do FvW pela proteinase ADAMTS13 pode ser genética ou mais comumente adquirida, resultante da produção de anticorpos inibidores da ADAMTS13, causando a PTT. Durante a última década, demonstrou-se que a SHU atípica (SHU-D) é uma doença de desregulação da via alternativa do complemento. Uma série de mutações e polimorfismo em genes que codificam proteínas reguladoras do complemento sozinhas ou em combinação podem levar a SHU atípica. Aproximadamente 60% dos casos de SHU atípica têm mutações do tipo "perda da função" em genes que codificam as proteínas reguladoras do complemento, as quais protegem as células hospedeiras da ativação do complemento: fator H do complemento (FHC), fator I (FIC) e proteína cofator de membrana (PCM ou CD46), ou mutações do tipo "ganho da função" em genes que codificam o FHC ou C3. Além disso, aproximadamente 10% dos pacientes com SHU atípica têm deficiência na função do FHC devido a anticorpos anti-FHC. Mesmo que as MATs sejam condições altamente heterogêneas, um terço dos pacientes tem deficiência severa da ADA-MTS13. Transfusões de plaquetas são contraindicadas nesses pacientes. Infusão de plasma ou plasma exchange (PE) é o único tratamento eficiente.

Inflammation in disseminated lesions: an analysis of CD4+, CD20+, CD68+, CD31+ and vW+ cells in non-ulcerated lesions of disseminated leishmaniasis

Disseminated leishmaniasis (DL) differs from other clinical forms of the disease due to the presence of many non-ulcerated lesions (papules and nodules) in non-contiguous areas of the body. We describe the histopathology of DL non-ulcerated lesions and the presence of CD4-, CD20-, CD68-, CD31- and von Willebrand factor (vW)-positive cells in the inflamed area. We analysed eighteen biopsies from non-ulcerated lesions and quantified the inflamed areas and the expression of CD4, CD20, CD68, CD31 and vW using Image-Pro software (Media Cybernetics). Diffuse lymphoplasmacytic perivascular infiltrates were found in dermal skin. Inflammation was observed in 3-73% of the total biopsy area and showed a significant linear correlation with the number of vW+ vessels. The most common cells were CD68+ macrophages, CD20+ B-cells and CD4+ T-cells. A significant linear correlation between CD4+ and CD20+ cells and the size of the inflamed area was also found. Our findings show chronic inflammation in all DL non-ulcerated lesions predominantly formed by macrophages, plasmacytes and T and B-cells. As the inflamed area expanded, the number of granulomas and extent of the vascular framework increased. Thus, we demonstrate that vessels may have an important role in the clinical evolution of DL lesions.

Retrospective canine skin peripheral nerve sheath tumors data with emphasis on histologic, immunohistochemical and prognostic factors

Abstract: In this retrospective study was determined the frequency of canine skin peripheral nerve sheath tumors (PNST) in cases diagnosed by the Setor de Patologia Veterinária of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV-UFRGS), Brazil, between the years 2000 and 2012. The canine profiles, as well as histological, immunohistochemical and prognostic aspects of the tumors were based on 70 samples, comprising 40 females, 29 males and one unspecified sample. Between 2000 and 2012, 2,984 skin tumors of dogs were diagnosed in the SPV-UFRGS, totaling 2.34% of skin neoplasms in dogs. Animals that comprised the largest amount of samples (43%) were those with no breed (SRD), followed by German Shepherds (10%). Females were more affected than males (40/70 - 57% and 29/70 - 41% respectively). Skin PNST of this research showed predominant localization on the limbs (40% in the forelimbs and 29% in the hindlimbs); affecting adult dogs, mostly aged between 8 and 11 years (54%). The samples were routinely processed for hematoxylin and eosin, and were also evaluated by toluidine blue and Masson's trichrome staining, and immunohistochemistry (IHC) anti-vimentin, -S-100, -GFAP, -actin, von Willebrand factor and neurofilament. Anisocytosis and anisokaryosis, mitotic index, intratumoral necrosis, invasion of adjacent tissues, tumor location, local recurrence and metastasis were related to the diagnosis of benign (49/70) or malignant tumor (21/70). The Antoni A histological pattern was observed more frequently in benign tumors. The immunohistochemistry helped to diagnose PNST, and anti-vimentin and anti-protein S-100 showed the highest rates of immunostaining. Throughout statistical analysis of animals with tumor recurrence, it was found that the chance of an animal with a malignant peripheral nerve sheath tumor to develop recurrence is 4.61 times higher than in an animal that had a benign tumor.