Indução de embriões somáticos a partir de embriões zigóticos de Heliconia bihai (L.) L. cv. Lobster Claw Two

As flores tropicais têm contribuído para o aumento do mercado florístico no Brasil; dentre elas destacam-se as do gênero Heliconia. A propagação de helicônias que atinge maior número de mudas ocorre por via vegetativa, por meio da divisão de rizomas, aumentando a probabilidade de disseminação de doenças, podendo, num futuro próximo, comprometer a produção de flores. O cultivo in vitro surge como importante alternativa para proporcionar a produção de mudas de helicônia com elevado padrão de qualidade. Entretanto, a micropropagação de helicônias via ápices caulinares depara-se com problemas de contaminação endofítica, dificultando a multiplicação do explante. Diante disso, fez-se necessário avaliar alternativas que promovam a produção de mudas in vitro, por meio da utilização de outros explantes. Para tanto, realizou-se um experimento, utilizando embriões zigóticos, provenientes de frutos imaturos e maduros de H. bihai (L.) L. cv. Lobster Claw Two, em combinações de AIA (0; 5,70 e 11,41 µm L-1) e 2,4-D (0; 22,62; 45,24; 67,86 e 90,48 µm L-1), para induzir a formação de embriões somáticos durante 90 dias. Por meio de análise histológica, observou-se a formação de embriões somáticos apenas nos embriões zigóticos, provenientes de frutos maduros, cultivados na ausência de reguladores de crescimento.

Histologia da embriogênese somática induzida em embriões de sementes maduras de Urochloa brizantha apomítica

O objetivo deste trabalho foi descrever o processo de embriogênese somática em Urochloa brizantha cv. Marandu (Syn. Brachiaria brizantha cv. Marandu) e fornecer subsídios para o aprimoramento dos métodos de cultura de tecidos e transformação genética. Calos embriogênicos foram obtidos por indução em embriões isolados de sementes maduras, e cultivados in vitro, em meio de cultura que continha ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 6-benzilaminopurina e caseína hidrolisada. Plântulas foram regeneradas a partir dos calos embriogênicos, na presença de ácido naftalenoacético e cinetina. Esse processo foi descrito morfologicamente por observações em microscopia de luz de secções seriadas semifinas de tecidos fixados, ao longo do processo de regeneração, em FAA [formaldeído (40%): ácido acético glacial: etanol (50%), a 5:5:90 v/v/v]. Os embriões das sementes de U. brizantha cv. Marandu não têm epiblasto e são classificados como do tipo panicoide. Nas condições estabelecidas de cultura in vitro, calos embriogênicos e embriões somáticos de U. brizantha cv. Marandu, desenvolvem-se a partir de células meristemáticas do escutelo.

Embriogênese somática in vitro em couve-comum

O objetivo deste estudo foi obter calos e embriões somáticos de couve-comum (Brassica oleracea L., var. leucocephala) e caracterizá-los por meio de observações histológicas. Foram cultivadas, in vitro, explantes foliares, sob condições assépticas, em meio nutritivo MS, suplementado com várias combinações entre 2,4-D/BAP e 2,4-D/KIN. Na fase de indução de calos (fase I), houve o desenvolvimento de calos com características embriogênicas nos meios suplementados com 5,0 mg/L de 2,4-D; 1,0 mg/L de 2,4-D e 0,1 mg/L de BAP; 1,0 mg/L de 2,4-D e 1,0 mg/L de BAP e 2,0 mg/L de 2,4-D e 0,05 mg/L de BAP, que foram selecionados para o subcultivo em meio de regeneração (fase II). Nesta fase, foram utilizados meios de cultura suplementados com reduzidas concentrações de 2,4-D, BAP e AG3, ou totalmente desprovidos destes, em que os calos permaneceram por mais 30 dias em cultivo. Os calos subcultivados nos meios de regeneração com 0,1 mg/L de BAP (R3) e 0,01 e 0,001 mg/L de BAP e 2,4-D respectivamente (R8), provenientes dos meios para indução, acrescidos de 5,0 mg/L de 2,4-D (M16) e 1,0 e 1,0 mg/L de BAP e 2,4-D (M30), desenvolveram estruturas semelhantes a embriões. No entanto, a caracterização histológica revelou a superioridade da interação entre os meios M30 e R8, para a regeneração de calos e embriões somáticos.

Protocolo para a embriogênese somática do mamoeiro

O presente trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo de embriogênese somática para o mamoeiro (Carica papaya L.) cv. Baixinho de Santa Amália, grupo Solo. Foram utilizados quatro tipos de explantes e duas condições de cultivo, sendo as fases de indução de calos, indução e maturação de embriões somáticos, alongamento e enraizamento das plântulas avaliadas em diferentes meios de cultura. A combinação explante hipocótilo com folhas cotiledonares e meio de cultura ½MS + 10 mg L-1 de 2,4-D, sob condições de escuro, foi a mais favorável para a indução de calos friáveis. Os meios de cultura HMH com 0,2 mg L-1 de ANA e 2,0 mg L-1 de cinetina e ½MS foram adequados para a indução e maturação de embriões somáticos; o meio MS com 1 mg L-1 de GA3 foi adequado para o alongamento das plântulas; e o meio MS com 1 mg L-1 IBA, para o enraizamento. A eficiência das fases de indução de calos, indução de embriões, maturação de embriões, alongamento, enraizamento e aclimatação das plântulas foi de 100%, 98%, 44%, 42%, 50% e 80%, respectivamente. O protocolo estabelecido possibilita que o processo de embriogênese somática seja realizado em um período de 230 dias, com uma eficiência final de 7%, e pode ser utilizado em trabalhos de transformação genética do mamoeiro.

Capacidade embriogênica da cultivar IAS-5 de soja

O objetivo deste trabalho foi estudar o controle genético da formação de embriões somáticos da cultivar IAS-5 de soja. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, cultivando-se quatro plantas por vaso, sob fotoperíodo de 14 horas e temperatura em torno de 28°C. Efetuaram-se cruzamentos entre os parentais não-embriogênicos (cultivares IAC-6, Paraná e IAC-15) e embriogênico (cultivar IAS-5) e retrocruzamentos para obtenção das gerações F1, F2,RC1P1 e RC1P2. Cotilédones imaturos, com 4-6 mm de comprimento, derivados dos parentais das gerações F1, F2, RC1P1 e RC1P2 foram cultivados em placas de Petri contendo meio N10, por um período de 90 dias, em câmara de crescimento. Os embriões somáticos derivados da indução foram contados, e os números, usados para obtenção dos parâmetros genéticos. Os resultados obtidos mostraram que o caráter capacidade de produção de embriões somáticos da cultivar IAS-5 é de natureza quantitativa e controlado por, aproximadamente, 20 genes.

Criopreservação e embriogênese somática de calos de Dimocarpus longan

Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos de crioprotetores na criopreservação e da sacarose na embriogênise somática de calos de Dimocarpus longan. Após degelo os calos foram cultivados em meio de multiplicação, e a massa da matéria fresca foi determinada. Para se obter os embriões somáticos, calos e massas pro-embriônicas foram transferidos para meio de cultura contendo diferentes concentrações de sacarose. Entre os crioprotetores, a mistura de 5% de glicerol + 5% de dimetilsulfóxido proporcionou a maior quantidade de massa fresca dos calos. O maior número de embriões foi obtido no meio de cultura com 50 g L-1 de sacarose. Os resultados mostram que calos de Dimocarpus longan podem ser criopreservados e plântulas podem ser obtidas.

Isolamento e eficiência de plaqueamento de protoplastos de citros

As recentes ferramentas biotecnológicas para o melhoramento in vitro de citros incluem a hibridação somática por fusão de protoplastos. A otimização dos protocolos de isolamento, plaqueamento e cultura de protoplastos, fundamental para maior eficiência na produção de híbridos somáticos, foi avaliada em 11 variedades cítricas. As soluções enzimáticas testadas foram: 1. celulase Onozuka RS, 1%; macerase R-10, 1%, pectoliase Y-23, 0,2%; 2. celulase Onozuka R-10, 0,2 %; macerase R-10, 0,3%; driselase, 0,1%; 3. celulase Onozuka R-10, 1%; macerase R-10, 0,2%; driselase, 0,1%. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado em meio de cultura EME 0,7 M, nas densidades de 2 x 10(4); 5 x 10(4); 10(5); 2 x 10(5) e 3 x 10(5) protoplastos.mL-1, no escuro, a 25 ± 1°C. A solução enzimática 1 possibilitou melhor rendimento no isolamento de protoplastos para a maioria das variedades, exceto para o limão-'Cravo', onde o melhor rendimento foi obtido na solução enzimática 3, e para as laranjas-doces 'Valência' e 'Succari', que apresentaram maiores rendimentos na solução enzimática 2. A eficiência final de plaqueamento, avaliada aos 90 dias de cultivo, foi superior nas densidades de 10(5) e 2 x 10(5) protoplastos.mL-1, para todas as variedades. O desenvolvimento de embriões somáticos foi observado em todas as variedades, exceto para tangor 'Murcote'.

Expressão transiente do gene gus, sob regulação de quatro promotores, em diferentes tecidos de mamoeiro (Carica papaya L.) e videira (Vitis sp.)

O mamoeiro (Carica papaya L.) e a videira (Vitis vinifera L.) destacam-se entre as fruteiras produzidas no Brasil por serem plantadas em quase todo o território nacional e apresentarem importância econômica e social. A tecnologia de produção de organismos geneticamente modificados, também conhecidos como "transgênicos", tem grande potencial de uso no desenvolvimento de fruteiras melhoradas. Porém, questões de propriedade intelectual limitam o uso da engenharia genética por países em desenvolvimento, que normalmente não detêm direitos sobre processos ou produtos necessários ao uso desta. Neste contexto, o presente estudo buscou avaliar promotores de expressão gênica alternativos ao CaMV 35S, que é o mais utilizado no desenvolvimento de transgênicos, mas é patenteado. Para tanto, construções gênicas com o gene gus sob a regulação de diferentes promotores foram testadas para expressão transiente em diversos tecidos de mamoeiro e videira. Expressão transiente foi avaliada em embriões somáticos, folhas, caules, raízes e frutos. O promotor do gene UBQ3, que é constitutivo e se encontra em domínio publico, mostrou ser uma alternativa promissora para futuros trabalhos de transformação genética de mamoeiro, mas não de videira.

Indução de embriogênese somática em cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.)

Folhas jovens de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.) foram empregadas para indução de embriogênese somática, as quais foram cultivadas inicialmente em meio MS suplementado com 6,0 mg/L BAP e 0,5 mg/L AIA (meio de estabelecimento), seguindo-se o cultivo em meio MS suplementado com 2,20 mg/L TDZ (meio de indução). A região da nervura mostrou intumescimento três dias após inoculação no meio de estabelecimento, o qual foi seguido pela formação de cachos de calos. As massas calosas foram transferidas para o meio de indução, e as estruturas com características pró-embriogênicas puderam ser observadas após uma semana. Estudos de microscopia eletrônica de varredura revelaram estruturas com características de embriões somáticos no meio com TDZ.

Diluição celular, características do meio de cultura e biorreatores de imersão temporária na diferenciação e regeneração de células em suspensão de bananeira

Altos custos de produção geralmente limitam o uso comercial da micropropagação. O uso de meios de cultura líquidos é considerado uma solução para a automação e redução de custos. Entretanto, dependendo da cultivar de bananeira, esse processo pode mostrar diferentes níveis de dificuldade, e adaptações nos protocolos são necessárias. Neste estudo, experimentos de diferenciação celular e regeneração de plantas foram desenvolvidos em células em suspensão de banana pela avaliação da densidade inicial de células, meios de cultura e sistemas de imersão temporária. Para tanto, uma sequência de três experimentos foi realizada: o primeiro avaliou os efeitos da densidade celular (0,5; 1 e 2 mL), meios de cultura (M1: 1/2MS, 0,1 g.L-1 de ácido ascórbico, 0,1 g.L-1 de L-prolina, 30 g.L-1 de sacarose e 10 µM de 2iP; M2: MS, 30 g.L-1 de sacarose, 2,2 µM de BAP e 11,4 µM de AIA) e períodos de diferenciação celular (40 e 130 dias); o segundo experimento analisou o efeito do tamanho dos propágulos diferenciados em meio líquido (aprox. 2,5; 5 e 10 mm em diâmetro) na formação de embriões somáticos ou na regeneração de plantas; finalmente, um terceiro experimento avaliou o efeito de sistemas de cultivo com papel-filtro cobrindo o meio de cultura semissólido e sistemas de imersão temporários na diferenciação dos propágulos e na regeneração de plantas. Não foram observadas diferenças significativas entre os meios de diferenciação, porém as melhores diluições de células para a diferenciação foram de 1 e 2 mL/30mL de meio de cultura, enquanto diluições de 0,5 mL/30 mL de meio aumentaram a oxidação celular. A extensão do período de diferenciação de 40 para 130 dias foi importante para produzir maior número de calos/propágulos uniformes e com pelo menos de 10 mm de diâmetro, que puderam ser usados em sistemas de imersão temporária (biorreatores) para a diferenciação de embriões somáticos e regeneração de plantas. Considerando todos os sistemas de regeneração, verificou-se que o uso de meios de regeneração de consistência semissólida com papel-filtro na superfície do meio é o mais responsivo para a diferenciação de embriões somáticos e regeneração de plantas.

Efeito dos reguladores de crescimento dicamba e picloram na embriogênese somática em Eucalyptus grandis

Este trabalho objetivou avaliar o efeito das auxinas dicamba e picloram na indução de embriogênese somática em embriões zigóticos maduros, cotilédones e hipocótilos de Eucalyptus grandis. Os calos foram induzidos em meio de cultura MS contendo dicamba (0,25; 0,5; 1,0; e 2,0 mg L-1) ou picloram (0,5; 1,5; 5,0; e 10,0 mg L-1). Nos tratamentos com 0,5 mg L-1 de dicamba ou 5,0 e 10,0 mg L-1 de picloram, em explantes cotiledonares, foram observadas estruturas semelhantes a embriões somáticos em diferentes estádios de desenvolvimento. A análise histológica confirmou tratar-se de estruturas independentes, com um sistema vascular fechado, evidenciando se tratar de embriões somáticos.

Controle da calogênese do pau-brasil in vitro

A indução da calogênese é a primeira etapa para obtenção de embriões e sementes. Para o controle da calogênese de Caesalpinia echinata, foram usados discos de foliólolos do pau-brasil em diferentes fases de desenvolvimento combinados com os fitorreguladores 2,4-D (0, 5, 10, 20, 50, 100 mg/L) e 6-BAP (2,0 mg/L), cultivados em meio de cultura de Murashige e Skoog (1962) acrescido de sacarose (30 g/L), mioinositol (100 mg/L) e ágar (7,5 g/L). Foi testado, também, o efeito de 6-BAP (0, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 e 10 mg/L) no crescimento de ápices meristemáticos. Foliólolos juvenis cultivados com baixa concentração de 2,4-D (5 e 20 mg/L) e foliólolos jovens tratados com altas concentrações de 2,4-D (50 e 100 mg/L) geraram calos sem diferenças significativas entre luz e escuro. Quanto ao controle da oxidação, melhores resultados foram proporcionados pelo carvão ativado, porém inibidores da calogênese. A transferência dos calos do meio de cultura MS com altas concentrações de 2,4-D (5,0; 10,0; e 20,0 mg/L) para meio sem fitorreguladores estimulou a formação de massas pró-embrionárias (MPEs). Os meios livres de fitorreguladores, 2,0 mg/L de 2,4-D e 0,5 mg/L de 2,4-D elevaram o número de calos embriogênicos e de massas pré-embrionárias. Somente em 0,5 mg/L 2,4-D se verificaram algumas estruturas semelhantes a embriões somáticos nas fases globular e codiforme.

PARÂMETROS GENÉTICOS PARA A CAPACIDADE DE PROPAGAÇÃO DE Pinus taeda POR EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA1

Objetivou-se com este trabalho avaliar a capacidade de propagação de famílias dePinus taeda por embriogênese somática utilizando estimativas de parâmetros genéticos. Para a embriogênese somática, foram selecionados cones imaturos de 65 famílias-elite de Pinus taeda. O germoplasma utilizado para a implantação dos testes de campo foi composto por 238 clones de 31 famílias. O estudo foi realizado por meio de análise genetíoco-estatística pelo procedimento de estimação de componentes de variância via máxima verossimilhança residual (Reml) e de predição de valores genéticos via melhor predição linear não viesada (Blup), usando-se o software Selegen-Reml/Blup. De acordo com os resultados, a variabilidade genética possibilita ganhos genéticos altos pela seleção entre famílias, para os caracteres presença de embriões somáticos e número de clones por famílias dePinus taeda. Há baixa ou nenhuma correlação genética entre o número de clones propagados viaembriogênese somática e as características altura, diâmetro, sobrevivência e volume avaliados aos 4 anos de idade em testes clonais. Conclui-se que há maior ganho genético para a capacidade de propagação por embriogênese somática com a seleção de famílias de Pinus taeda.

Efeito do frio sobre os carboidratos solúveis em culturas embriogênicas de Acca sellowiana O. Berg (Myrtaceae)

A rota da embriogênese somática de Acca sellowiana, uma espécie arbórea frutífera com limitações quanto à propagação vegetativa, já foi estabelecida mas o número de embriões que restabelecem o crescimento após a fase cotiledonar é baixo. No presente trabalho, embriões somáticos em diferentes fases de desenvolvimento foram obtidos após tratamentos com 2,4-D e submetidos à condição de frio (4 °C) durante 20 dias, visando induzir a transformação de embriões somáticos em plântulas. Observou-se que 95% dos embriões zigóticos desenvolveram embriões somáticos quando tratados com 2,4-D de forma contínua (T1), enquanto que apenas 55% foram formados quando a auxina foi usada na forma pulsada (T2). Porém, o tratamento T1 induziu altas taxas (82%) de deformações nos embriões quando comparados a T2 (62%). Em ambos os tratamentos, não houve formação de plântulas a partir de embriões somáticos após a exposição ao frio, sendo observada redução nos níveis de rafinose. Em T1, 50% dos embriões cultivados na fase globular permaneceram quiescentes e apenas os embriões na fase cotiledonar (76%) apresentaram características positivas de retomada de desenvolvimento, havendo, porém, redução nos teores de açúcares totais com o desenvolvimento e a diferenciação dos embriões. No tratamento T2, apenas 30% dos embriões na fase cotiledonar tornaram-se verdes e apresentaram maiores valores de carboidratos solúveis totais. A análise da composição destes açúcares evidenciou que os componentes majoritários foram myo-inositol, glucose e frutose, no início da cultura e teores decrescentes de sacarose durante o período de cultivo. As baixas concentrações de rafinose durante o período de crescimento e sua redução durante o tratamento a frio, bem como o complexo metabolismo dos carboidratos associado ao uso de reguladores de crescimento podem estar relacionadas com as alterações observadas no desenvolvimento normal dos embriões somáticos, sem haver acúmulo de carboidratos, e inibindo a regeneração das plântulas de Acca sellowiana.

Germinação de embriões zigóticos e desenvolvimento in vitro de coquinho-azedo

Este trabalho foi desenvolvido com objetivo de avaliar os efeitos da luz, das concentrações de sais MS e de sacarose sobre a germinação, in vitro, de embriões, e o desenvolvimento de plântulas de coquinho-azedo (Butia capitata (Mart.) Becc.). Para o preparo do meio de cultivo, foram utilizados sais MS suplementados com vitaminas, mio-inositol, caseína hidrolizada, carvão ativado, sacarose e ágar. Para avaliação do efeito da luminosidade, embriões zigóticos foram cultivados na presença e na ausência de luz. Diferentes concentrações de minerais MS (0; 25; 50; 75 e 100% em relação à formulação original do meio MS) foram testadas em associação com duas concentrações de sacarose ( de0 a 2%). Em ambos os experimentos, avaliaram-se, após 30 dias da inoculação, percentuais de oxidação, germinação e emissão de raízes e bainhas foliares. Os resultados obtidos mostraram que condição de luminosidade não afetou a germinação, porém, a ausência de luz favoreceu a emissão de raízes. Ocorreu o alongamento na ausência de sacarose, indicando a existência de reservas energéticas no embrião. A adição de sacarose proporcionou menores níveis de oxidação, favoreceu o alongamento e mostrou-se imprescindível para o desenvolvimento inicial das plântulas. Concentrações de sais entre 50 e 75% da concentração original do meio MS proporcionaram menores níveis de oxidação. A concentração de 75 % da concentração original de sais do meio MS proporcionou maior enraizamento.