Criopreservação de formas de cultura do Trypanosoma cruzi

Formas de cultura de diferentes cepas do T.cruzi foram submetidas a vários processos de criopreservação. As percentagens de recuperação, avaliadas pela motilidade dos parasitas, foram consideradas como adequadas com algumas das técnicas empregadas, variando entre 60 a 80%. A estabilidade das características biológicas do material criopreservado foi investigada através do estudo das curvas de crescimento e diferenciação em meio acelular, infectividade para celulas de cultura de tecido ("Vero"), diferenciação intracelular em cultura de tecido assim como infectividade e curso da infecção em animais de laboratório. De um modo geral essas características nao foram significativamente alteradas no material congelado e estocado por diferentes períodos de tempo.

Criopreservação e embriogênese somática de calos de Dimocarpus longan

Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos de crioprotetores na criopreservação e da sacarose na embriogênise somática de calos de Dimocarpus longan. Após degelo os calos foram cultivados em meio de multiplicação, e a massa da matéria fresca foi determinada. Para se obter os embriões somáticos, calos e massas pro-embriônicas foram transferidos para meio de cultura contendo diferentes concentrações de sacarose. Entre os crioprotetores, a mistura de 5% de glicerol + 5% de dimetilsulfóxido proporcionou a maior quantidade de massa fresca dos calos. O maior número de embriões foi obtido no meio de cultura com 50 g L-1 de sacarose. Os resultados mostram que calos de Dimocarpus longan podem ser criopreservados e plântulas podem ser obtidas.

Tolerância de sementes de dendezeiro à criopreservação

O objetivo deste trabalho foi avaliar a tolerância de sementes de dendezeiro (Elaeis guineensis) à criopreservação. Cinco genótipos - CM589, C7201, C2528, C2001, C2501 - foram avaliados quanto à exposição ao nitrogênio líquido por sete dias. Os tratamentos foram repetidos três vezes e cada repetição foi formada por dez sementes. Cortes anatômicos foram realizados para comparação do efeito dos tratamentos nos embriões durante a germinação. A exposição ao nitrogênio líquido acelerou a germinação das sementes do genótipo CM589 e aumentou o potencial de germinação das sementes do genótipo C2528. A exposição ao nitrogênio líquido não teve efeito no genótipo C2501 e reduziu a germinação das sementes do genótipo C7201. A exposição ao nitrogênio líquido não interferiu na diferenciação e no desenvolvimento dos tecidos embrionários durante a germinação.

Aspectos histológicos do ovário de coelhas após criopreservação

OBJETIVO: avaliar a preservação folicular e as características celulares do tecido ovariano criopreservado, em coelhas. MÉTODOS: fez-se, sob anestesia, a ooforectomia direita de dez coelhas brancas, adultas. Dissecou-se o ovário mantendo-se o córtex com espessura de 1,5 milímetros. Fragmentou-se o tecido em pequenas secções, algumas para o estudo histológico de controle e outras destinadas à criopreservação pelo protocolo de congelamento lento. Passadas seis semanas efetuou-se o descongelamento e fez-se a avaliação histológica. As amostras do controle e do experimento, após processamento, foram coradas pela hematoxilina-eosina para identificação dos aspectos histológicos e submetidas à técnica imuno-histoquímica utilizando-se o PCNA (proliferating cell nuclear antigen) para a avaliação da viabilidade celular. Utilizaram-se os testes não paramétricos "comparação entre duas proporções" e Mann-Whitney e o teste paramétrico t de Student. RESULTADOS: observou-se que no tecido criopreservado só persistiram oócitos primordiais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se: vacuolização citoplasmática em todas as amostras (p=0,039), lise estromal em 50% (p=0,648) e oócitos com contornos irregulares em 80% (p=0,007). Encontraram-se alterações irreversíveis como degeneração hialina e picnose em 30% das amostras (p=0,210). A análise imuno-histoquímica demonstrou os folículos, em diferentes estágios de desenvolvimento, no tecido não congelado e folículos primordiais no tecido criopreservado com positividade para o PCNA, indicando a presença de DNA ativo. CONCLUSÃO: no tecido ovariano criopreservado sobrevivem apenas os folículos primordiais; existem alterações histológicas reversíveis (vacuolização citoplasmática, lise estromal, fragmentação das células da granulosa e oócitos com contornos irregulares); alterações irreversíveis, em níveis não significantes (degeneração hialina e picnose) e presença de PCNA positivo em todos os folículos.

Criopreservação de sêmen humano: comparação entre métodos de congelação e tipos de envase

OBJETIVOS: comparar duas diferentes técnicas de congelação e dois tipos de envase do sêmen humano durante processo de criopreservação. MÉTODOS: estudo experimental, no qual foi analisada a criopreservação de 18 amostras de sêmen de 18 voluntários. Após a adição de meio crioprotetor, "Test-yolk buffer" , as amostras de sêmen foram envasadas em palhetas com capacidade de 0,25 mL ou em criotubos de 2 mL e submetidas à criopreservação por dois métodos, um lento e outro rápido, totalizando quatro tratamentos distintos: RP (congelação pelo método rápido e envasado em palheta), RT (rápido-criotubo), LP (lento-palheta) e LT (lento-criotubo). As amostras, após 24 horas, foram descongeladas em temperatura ambiente e mantidas a 37ºC. Os dados coletados foram analisados através do teste t de Student, com p<0,05, utilizando o programa de computador SPSS for Windows® versão 11.0.0. RESULTADOS: houve redução da motilidade espermática após o processo de criopreservação. A taxa de motilidade inicial foi 58,1% e as motilidades após os diferentes métodos de criopreservação foram: 19,2% (RP), 27% (RT), 21,1% (LP) e 30,3% (LT). Houve redução significativa na morfologia normal. A taxa de morfologia normal inicial foi 14,2% e as morfologias após os diferentes métodos de criopreservação foram: 12,8% (RP), 12,6% (RT), 12,6% (LP) e 12,4% (LT). CONCLUSÕES: o método de criopreservação lento com envase em criotubo esteve associado à melhor motilidade espermática após o descongelamento. Não houve diferença entre os métodos quando avaliada a morfologia espermática.

Fertilização in vitro com injeção intracitoplasmática de espermatozóide em ciclos naturais

OBJETIVO: avaliar a eficácia da fertilização in vitro (FIV) com injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) em ciclo natural (CN). MÉTODOS: estudo clínico retrospectivo que avaliou 70 ciclos de tratamento em 60 casais que se submeteram ao tratamento de FIV com auxílio da técnica de ICSI em CN em clínica privada de 1999 a 2003. Foi realizada monitorização ultra-sonográfica diária ou em dias alternados, e dosagem de LH urinário a partir de 16 mm de diâmetro folicular. Programada captação oocitária quando o folículo atingiu 18 mm de diâmetro e 36 horas após a administração de gonadotrofina coriônica humana (hCG - 5000UI) quando o teste de LH era negativo. A transferência embrionária foi realizada 48 a 52 horas depois do ICSI. RESULTADOS: foram realizados 70 ciclos de ICSI em 60 pacientes com as seguintes indicações: fator masculino (47,1%), fator tubo-peritoneal (37,1%), fatores associados (8,7%) e infertilidade sem causa aparente (7,1%). Do total de 70 ciclos, 18 foram cancelados (25,7% de taxa cancelamento). Das 52 pacientes que se submeteram à punção ovariana, oócitos maduros foram encontrados em 77% das vezes (40 ciclos). A taxa de fertilização foi de 70% e as taxas de transferência embrionária por punção e por oócito maduro foram de 52 e 67,5%, respectivamente. As taxas de gestação por ciclo iniciado, ciclo puncionado e transferência embrionária foram 11,4, 15,4 e 29,6%, respectivamente. Das oito gestações, sete foram diagnosticadas em pacientes com idade inferior a 37 anos. A única gestação conseguida em pacientes com idade entre 37 e 43 anos evoluiu para abortamento. CONCLUSÕES: ICSI em ciclos naturais parece ser uma opção satisfatória de tratamento, com custos e índice de complicações (gestação múltipla e síndrome de hiperestímulo ovariano) reduzidos. Os resultados são melhores em pacientes mais jovens, com idade inferior a 37 anos.

Obtenção de gametas seguros por meio de associação de técnicas de processamento seminal para casais sorodiscordantes para HIV

RESUMO OBJETIVO: o objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros laboratoriais e clínicos de pacientes submetidos à reprodução humana assistida, associando técnicas de processamento seminal para eliminação de partículas virais da amostra de sêmen em casais nos quais o homem é infectado pelo vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV). MÉTODOS: foram avaliados 11 ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) realizados em casais nos quais os homens eram infectados pelo HIV (Grupo HIV), e 35 ciclos de ICSI nos quais se utilizaram espermatozóides doados (Grupo Controle). As amostras de sêmen dos doadores foram submetidas à análise seminal completa, processamento seminal (lavagem) e criopreservação. Os homens do Grupo HIV receberam antibioticoterapia prévia e realizou-se análise seminal, lavagem e gradiente descontínuo de densidade antes da criopreservação. As amostras foram avaliadas para carga viral e a ICSI foi realizada quando não houve detecção do HIV. RESULTADOS: quanto aos resultados da análise seminal, os grupos se mostraram comparáveis em relação à concentração e motilidade progressiva dos espermatozóides. Entretanto, a porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais foi maior no Grupo Controle (14,3%) comparado ao HIV (5,8%; p=0,002). Na avaliação dos parâmetros embrionários, as taxas de fertilização normal (Controle: 74,7% e HIV: 71,7; p=0,838) e de bons embriões (Controle: 42,4% e HIV: 65,1%; p=0,312) foram semelhantes. Por outro lado, o Grupo Controle apresentou melhores resultados clínicos que o HIV (gestação continuada: 52,9 e 12,5%; p=0,054; implantação: 42,6 e 10,4%; p=0,059, respectivamente), apesar de as diferenças não serem estatisticamente significantes. Após o nascimento, não houve soroconversão das mães e das crianças nascidas. CONCLUSÕES: a associação de técnicas de processamento seminal para eliminação do HIV de amostras seminais não interferiu nos parâmetros laboratoriais de ciclos de reprodução humana assistida. Por outro lado, demonstrou excelentes resultados na obtenção de gametas seguros para casais sorodiscordantes.

Comparação entre duas concentrações de glicerol para a criopreservação de sêmen de suçuarana (Puma concolor)

O desenvolvimento de biotécnicas de reprodução é uma importante ferramenta para a conservação de animais silvestres ameaçados de extinção. Procedimentos de reprodução assistida em suçuarana, no entanto, são escassos na literatura, em especial aqueles relacionados à criopreservação de sêmen. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a congelabilidade do sêmen de suçuaranas adultas mantidas em cativeiro, por meio da comparação entre duas concentrações de glicerol no meio de congelamento. Foram usados cinco machos adultos de suçuarana, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). As amostras foram coletadas por eletroejaculação e avaliadas quanto ao seu aspecto físico, volume, vigor, motilidade, concentração e índice espermático. De cada ejaculado duas alíquotas foram diluídas em meio Tris-citrato-gema de ovo, em concentrações finais de 5 e 7,5% de glicerol, resfriadas a uma taxa de -0,55ºC/min e congeladas a uma taxa de -5,8ºC/min. Depois de descongeladas, as amostras foram reavaliadas e submetidas aos testes de termorresistência e hiposmótico. O protocolo de criopreservação e descongelamento de sêmen proposto se mostrou eficiente em ambas as concentrações de glicerol testadas, não havendo diferença (p>0,05) entre estas.

Conservação de grãos de pólen de mamoneira a baixas temperaturas

A finalidade do armazenamento do grão de pólen é conservar material para futura utilização, proporcionando-lhe condições ótimas, de forma a manter seu poder germinativo, vigor e integridade genética originais. O objetivo deste trabalho foi verificar o poder germinativo dos grãos de pólen de mamoneira (Ricinus communis L.), após armazenamento a baixas temperaturas. Para tanto, grãos de pólen dos cultivares IAC 80 e AL Guarany 2002 foram utilizados e armazenados em quatro temperaturas: -196, -72, -18 e 4 ºC, durante um período de oito semanas. A avaliação da viabilidade deste pólen foi realizada semanalmente, até completar cinco semanas, sendo realizada uma última avaliação após a oitava semana de armazenamento, por meio do teste de germinação in vitro. Meio de cultura, contendo 10 gL-1 de ágar, 100 gL-1 de sacarose, 0,004 gL-1 de ácido bórico e pH 6,0, foi preparado e depositado em placas de lâmina escavada, onde o pólen foi distribuído sobre a superfície do meio. As placas foram incubadas a 20 ºC em BOD. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2 x 4 (2 cultivares x 4 temperaturas) para cada tempo de armazenamento, sendo analisados 100 grãos de pólen por repetição, totalizando seis de cada tratamento. Verificou-se diferença significativa entre os tratamentos para a interação cultivar x temperatura na quinta semana de observação (p < 0,05). Demais interações foram altamente significativas em todas as épocas de observação (p < 0,01). Portanto, a utilização de ultrabaixas temperaturas permite a manutenção da viabilidade de grãos de pólen de mamoneira, até a quinta semana de armazenamento.

Aspectos da espermatogênese de tucunaré, Cichla ocellaris Schneider, 1801 (TELEOSTEI, CICHLIDAE).

São descritos os eventos citológicos sequenciais da espermatogênese de Cichla ocellaris (tucunaré) desde o espermatócito primário até o espermatozóide maduro. Verificou-se que a espermiogenese compreende cinco diferentes estágios de maturação das espermátides, caracterizadas por transformações da cromatina nuclear e das estruturas citoplasmáticas. O esperatozóide da espécie é do tipo primitivo, apresentando uma cabeça sem acrossomo e uma cauda.

Aspectos morfológicos e ultraestruturais do Espermatozóide de Curimata Inornata Vari, 1989 (Pisces, Teleostei) do Rio Amazonas

Estão descritos aspectos morfológicos e ultraestruturais do espermatozóide de Curimata inornata Vavi, 1989 (Pisces,Teleostei) observados com microsopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão. O espermatozóide é constituído de cabeça, contendo um núcleo ovoide com cromatina granular densa, uma peça intermediária curta e uma cauda com a constituição axonêmica clássica de microtúbulos de 9p+2.

Avaliação espermática pós-descongelamento em tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier, 1818)

Este estudo testa procedimentos de congelamento do sêmen de tambaqui, Colossoma macropomum , e eficiência na fertilização de ovócitos. Sêmen de um reprodutor induzido hormonalmente foi amostrado e armazenado em tubos de ensaio. O material foi diluído em soluções crioprotetoras (dimetilacetamida [DMA], dimetilsulfóxido [DMSO], metanol, propilenoglicol e etilenoglicol) (proporção de 1:3; sêmen:diluente), e submetido a procedimentos de rotina de congelamento. A motilidade foi avaliada antes e depois deste procedimento. Testes de fertilização foram feitos com o sêmen criopreservado. A motilidade pré-congelamento foi de 80% e após o congelamento foi de 20-25% para propilenoglicol e etilenoglicol, 5-10% para DMSO e 5% para DMA e metanol. A fertilização foi de 76% e 88% para propilenoglicol e etilenoglicol, respectivamente.

Espermiogênese em Eupemphix nattereri (Anura, Leiuperidae): aspectos ultra-estruturais

A maturação dos espermatozóides envolve um extenso e complexo processo que começa com a proliferação e diferenciação das espermatogônias, passa pela meiose e finaliza com a espermiogênese. Nessa fase, eventos envolvendo alterações morfológicas e bioquímicas transformam espermátides em espermatozóides. Aspectos ultra-estruturais da espermiogênese e do espermatozóide do anuro Eupemphix nattereri (Steindachner, 1863) foram analisados através de microscopia eletrônica de transmissão. A espermiogênese envolve condensação da cromatina e alongamento nuclear, com visível eliminação de citoplasma. Nesse estágio, grande quantidade de microtúbulos e glicogênio podem ser visualizados no citoplasma das células de Sertoli, rodeando cada espermátide. O espermatozóide é fusiforme e o acrossomo forma uma capa na região anterior do núcleo. A bainha mitocondrial é encontrada ao redor da porção proximal da cauda. A cauda apresenta o axonema com o modelo 9+2, uma fibra axonemal, a membrana ondulante e ausência de bastão axial. Esta organização apresenta algumas similaridades com espécies do gênero Physalaemus (Leiuperidae) como P. biligonigerus (Cope, 1861), P. gracilis (Boulenger, 1883) e P. fuscomaculatus (Steindachner, 1864).