Transferência de blastocisto após descongelamento de embriões em mórula resultando em gestação gemelar: relato de caso

A criopreservação de embriões em estágios mais tardios do desenvolvimento parece apresentar resultados satisfatórios. Com o objetivo de melhor testar a sobrevivência e o desenvolvimento de embriões, os mesmos foram criopreservados e descongelados em estadio de mórula ou blastocisto e deixados em cultura para que pudesse ser avaliada sua evolução natural. Dos 2 blastocistos e 5 mórulas congelados, 4 mórulas sobreviveram ao descongelamento, tendo sido transferidas em estadio de blastocisto, 24 horas depois. A transferência, realizada em paciente jovem, segundo casamento de homem vasectomizado há dez anos, resultou em gestação gemelar. O descongelamento de embriões em estadio de mórula e a observação in vitro da retomada de seu desenvolvimento até o estadio de blastocisto fornecem um parâmetro adicional na avaliação da qualidade do embrião e, provavelmente, melhore as taxas de gravidez.

Criopreservação de formas de cultura do Trypanosoma cruzi

Formas de cultura de diferentes cepas do T.cruzi foram submetidas a vários processos de criopreservação. As percentagens de recuperação, avaliadas pela motilidade dos parasitas, foram consideradas como adequadas com algumas das técnicas empregadas, variando entre 60 a 80%. A estabilidade das características biológicas do material criopreservado foi investigada através do estudo das curvas de crescimento e diferenciação em meio acelular, infectividade para celulas de cultura de tecido ("Vero"), diferenciação intracelular em cultura de tecido assim como infectividade e curso da infecção em animais de laboratório. De um modo geral essas características nao foram significativamente alteradas no material congelado e estocado por diferentes períodos de tempo.

Criopreservação e embriogênese somática de calos de Dimocarpus longan

Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos de crioprotetores na criopreservação e da sacarose na embriogênise somática de calos de Dimocarpus longan. Após degelo os calos foram cultivados em meio de multiplicação, e a massa da matéria fresca foi determinada. Para se obter os embriões somáticos, calos e massas pro-embriônicas foram transferidos para meio de cultura contendo diferentes concentrações de sacarose. Entre os crioprotetores, a mistura de 5% de glicerol + 5% de dimetilsulfóxido proporcionou a maior quantidade de massa fresca dos calos. O maior número de embriões foi obtido no meio de cultura com 50 g L-1 de sacarose. Os resultados mostram que calos de Dimocarpus longan podem ser criopreservados e plântulas podem ser obtidas.

Tolerância de sementes de dendezeiro à criopreservação

O objetivo deste trabalho foi avaliar a tolerância de sementes de dendezeiro (Elaeis guineensis) à criopreservação. Cinco genótipos - CM589, C7201, C2528, C2001, C2501 - foram avaliados quanto à exposição ao nitrogênio líquido por sete dias. Os tratamentos foram repetidos três vezes e cada repetição foi formada por dez sementes. Cortes anatômicos foram realizados para comparação do efeito dos tratamentos nos embriões durante a germinação. A exposição ao nitrogênio líquido acelerou a germinação das sementes do genótipo CM589 e aumentou o potencial de germinação das sementes do genótipo C2528. A exposição ao nitrogênio líquido não teve efeito no genótipo C2501 e reduziu a germinação das sementes do genótipo C7201. A exposição ao nitrogênio líquido não interferiu na diferenciação e no desenvolvimento dos tecidos embrionários durante a germinação.

Co-cultura de embriões humanos em células vero e transferência em fase de blastocisto

Objetivos: determinar se o dia da transferência ou o estágio em que o embrião é transferido interferem nas taxas de gravidez e implantação. Métodos: cento e sete pacientes tiveram seus oócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Os embriões foram co-cultivados em células Vero e transferidos no dia 3 ou dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica. Resultados: a taxa de implantação dos embriões transferidos no dia 5 foi significativamente maior que quando os embriões eram transferidos no dia 3, mas as taxas de gravidez não variaram. Observou-se uma diferença significativa nas taxas de gravidez quando se comparou o estágio em que o embrião era transferido, obtendo-se 70,6% de gravidez quando se transferiam blastocistos expandidos e 20,0% e 10,5% quando eram transferidos blastocistos iniciais ou mórulas, respectivamente. Conclusões: as taxas de implantação e gravidez são significativamente aumentadas quando se transferem embriões em estágio de blastocisto expandido, mas os meios e condições de cultura de que dispomos no momento ainda são insuficientes para nos fornecer uma taxa satisfatória de embriões neste estágio.

Cultura de Embriões até o Estágio de Blastocisto: Comparação entre o Uso de Meios Seqüenciais e de Co-Cultura

Objetivos: comparar o desenvolvimento embrionário com o uso de dois métodos diferentes de cultura (meio seqüencial ou co-cultura em células Vero). Métodos: foram incluídas 110 pacientes que tiveram ovócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Metade das pacientes teve seus embriões cultivados juntamente com células Vero e a outra metade em meio seqüencial G1:2/G2:2. Os embriões foram transferidos no dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica, verificando-se a taxa de blastulação. A gravidez foi definida por meio de ultra-sonografia, verificando-se batimento cardíaco após a 13ª semana pós-transferência. Resultados: a taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9% e 14% com células Vero e G1:2/G2:2, respectivamente. Com células Vero 36,0% das pacientes engravidaram com taxa de implantação de 18,9%. Quando se utilizou G1:2/G2:2 as taxas de gravidez e implantação foram 28,9% e 14,9%, respectivamente. Em apenas 17 casos obtiveram-se blastocistos após co-cultivo em células Vero, apresentando 76,5% de taxa de gravidez e 63,0% de implantação. Quando o cultivo foi em G1/G2 21 pacientes apresentaram blastocistos e as taxas de gravidez e implantação foram de 57,1 e 76,0%, respectivamente. Conclusão: não houve diferença significativa entre as taxas de gravidez ou implantação nos 2 tipos de cultivo. Nos casos em que blastocistos expandidos foram transferidos, as taxas de implantação e gravidez aumentaram com ambos os tipos de cultivo. Nestas pacientes, independente do tipo de cultivo utilizado, um número maior de ovócitos foi obtido, o que nos leva a pensar que não apenas as condições de cultura influenciam as taxas de implantação e gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as "boas respondedoras" tiveram melhores resultados.

Aspectos histológicos do ovário de coelhas após criopreservação

OBJETIVO: avaliar a preservação folicular e as características celulares do tecido ovariano criopreservado, em coelhas. MÉTODOS: fez-se, sob anestesia, a ooforectomia direita de dez coelhas brancas, adultas. Dissecou-se o ovário mantendo-se o córtex com espessura de 1,5 milímetros. Fragmentou-se o tecido em pequenas secções, algumas para o estudo histológico de controle e outras destinadas à criopreservação pelo protocolo de congelamento lento. Passadas seis semanas efetuou-se o descongelamento e fez-se a avaliação histológica. As amostras do controle e do experimento, após processamento, foram coradas pela hematoxilina-eosina para identificação dos aspectos histológicos e submetidas à técnica imuno-histoquímica utilizando-se o PCNA (proliferating cell nuclear antigen) para a avaliação da viabilidade celular. Utilizaram-se os testes não paramétricos "comparação entre duas proporções" e Mann-Whitney e o teste paramétrico t de Student. RESULTADOS: observou-se que no tecido criopreservado só persistiram oócitos primordiais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se: vacuolização citoplasmática em todas as amostras (p=0,039), lise estromal em 50% (p=0,648) e oócitos com contornos irregulares em 80% (p=0,007). Encontraram-se alterações irreversíveis como degeneração hialina e picnose em 30% das amostras (p=0,210). A análise imuno-histoquímica demonstrou os folículos, em diferentes estágios de desenvolvimento, no tecido não congelado e folículos primordiais no tecido criopreservado com positividade para o PCNA, indicando a presença de DNA ativo. CONCLUSÃO: no tecido ovariano criopreservado sobrevivem apenas os folículos primordiais; existem alterações histológicas reversíveis (vacuolização citoplasmática, lise estromal, fragmentação das células da granulosa e oócitos com contornos irregulares); alterações irreversíveis, em níveis não significantes (degeneração hialina e picnose) e presença de PCNA positivo em todos os folículos.

Criopreservação de sêmen humano: comparação entre métodos de congelação e tipos de envase

OBJETIVOS: comparar duas diferentes técnicas de congelação e dois tipos de envase do sêmen humano durante processo de criopreservação. MÉTODOS: estudo experimental, no qual foi analisada a criopreservação de 18 amostras de sêmen de 18 voluntários. Após a adição de meio crioprotetor, "Test-yolk buffer" , as amostras de sêmen foram envasadas em palhetas com capacidade de 0,25 mL ou em criotubos de 2 mL e submetidas à criopreservação por dois métodos, um lento e outro rápido, totalizando quatro tratamentos distintos: RP (congelação pelo método rápido e envasado em palheta), RT (rápido-criotubo), LP (lento-palheta) e LT (lento-criotubo). As amostras, após 24 horas, foram descongeladas em temperatura ambiente e mantidas a 37ºC. Os dados coletados foram analisados através do teste t de Student, com p<0,05, utilizando o programa de computador SPSS for Windows® versão 11.0.0. RESULTADOS: houve redução da motilidade espermática após o processo de criopreservação. A taxa de motilidade inicial foi 58,1% e as motilidades após os diferentes métodos de criopreservação foram: 19,2% (RP), 27% (RT), 21,1% (LP) e 30,3% (LT). Houve redução significativa na morfologia normal. A taxa de morfologia normal inicial foi 14,2% e as morfologias após os diferentes métodos de criopreservação foram: 12,8% (RP), 12,6% (RT), 12,6% (LP) e 12,4% (LT). CONCLUSÕES: o método de criopreservação lento com envase em criotubo esteve associado à melhor motilidade espermática após o descongelamento. Não houve diferença entre os métodos quando avaliada a morfologia espermática.

Comparação entre duas concentrações de glicerol para a criopreservação de sêmen de suçuarana (Puma concolor)

O desenvolvimento de biotécnicas de reprodução é uma importante ferramenta para a conservação de animais silvestres ameaçados de extinção. Procedimentos de reprodução assistida em suçuarana, no entanto, são escassos na literatura, em especial aqueles relacionados à criopreservação de sêmen. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a congelabilidade do sêmen de suçuaranas adultas mantidas em cativeiro, por meio da comparação entre duas concentrações de glicerol no meio de congelamento. Foram usados cinco machos adultos de suçuarana, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). As amostras foram coletadas por eletroejaculação e avaliadas quanto ao seu aspecto físico, volume, vigor, motilidade, concentração e índice espermático. De cada ejaculado duas alíquotas foram diluídas em meio Tris-citrato-gema de ovo, em concentrações finais de 5 e 7,5% de glicerol, resfriadas a uma taxa de -0,55ºC/min e congeladas a uma taxa de -5,8ºC/min. Depois de descongeladas, as amostras foram reavaliadas e submetidas aos testes de termorresistência e hiposmótico. O protocolo de criopreservação e descongelamento de sêmen proposto se mostrou eficiente em ambas as concentrações de glicerol testadas, não havendo diferença (p>0,05) entre estas.

Conservação de grãos de pólen de mamoneira a baixas temperaturas

A finalidade do armazenamento do grão de pólen é conservar material para futura utilização, proporcionando-lhe condições ótimas, de forma a manter seu poder germinativo, vigor e integridade genética originais. O objetivo deste trabalho foi verificar o poder germinativo dos grãos de pólen de mamoneira (Ricinus communis L.), após armazenamento a baixas temperaturas. Para tanto, grãos de pólen dos cultivares IAC 80 e AL Guarany 2002 foram utilizados e armazenados em quatro temperaturas: -196, -72, -18 e 4 ºC, durante um período de oito semanas. A avaliação da viabilidade deste pólen foi realizada semanalmente, até completar cinco semanas, sendo realizada uma última avaliação após a oitava semana de armazenamento, por meio do teste de germinação in vitro. Meio de cultura, contendo 10 gL-1 de ágar, 100 gL-1 de sacarose, 0,004 gL-1 de ácido bórico e pH 6,0, foi preparado e depositado em placas de lâmina escavada, onde o pólen foi distribuído sobre a superfície do meio. As placas foram incubadas a 20 ºC em BOD. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2 x 4 (2 cultivares x 4 temperaturas) para cada tempo de armazenamento, sendo analisados 100 grãos de pólen por repetição, totalizando seis de cada tratamento. Verificou-se diferença significativa entre os tratamentos para a interação cultivar x temperatura na quinta semana de observação (p < 0,05). Demais interações foram altamente significativas em todas as épocas de observação (p < 0,01). Portanto, a utilização de ultrabaixas temperaturas permite a manutenção da viabilidade de grãos de pólen de mamoneira, até a quinta semana de armazenamento.

Avaliação espermática pós-descongelamento em tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier, 1818)

Este estudo testa procedimentos de congelamento do sêmen de tambaqui, Colossoma macropomum , e eficiência na fertilização de ovócitos. Sêmen de um reprodutor induzido hormonalmente foi amostrado e armazenado em tubos de ensaio. O material foi diluído em soluções crioprotetoras (dimetilacetamida [DMA], dimetilsulfóxido [DMSO], metanol, propilenoglicol e etilenoglicol) (proporção de 1:3; sêmen:diluente), e submetido a procedimentos de rotina de congelamento. A motilidade foi avaliada antes e depois deste procedimento. Testes de fertilização foram feitos com o sêmen criopreservado. A motilidade pré-congelamento foi de 80% e após o congelamento foi de 20-25% para propilenoglicol e etilenoglicol, 5-10% para DMSO e 5% para DMA e metanol. A fertilização foi de 76% e 88% para propilenoglicol e etilenoglicol, respectivamente.

Comportamento das cepas Y e Peruana do Trypanosoma cruzi no camundongo, após passagem em diferentes meios

Com o objetivo de verificar se o comportamento morfobiológico e histopalógico de cerpa do Trypanosoma cruzi é mantido após modificações no seu meio de manutenção e multiplicação, foram estudados oito grupos de infecção experimental em camundongos com as cepas Y e Peruana, após manutenção nas seguintes condições cultura acelular em meio de Warren, criopreservação em Nitrogênio líquido durante trinta dias, passagem em triatomíneos e passagem em camundongos. Os parâmetros avaliados foram: parasitemia, mortalidade, sobrevida, morfologiaq dos parasitos no sangue periférico, tropismo tíssular e lesões histopatológicoas. Tanto com a cepa Y como Peruana, cada grupo experimental foi dividido em dois subgrupos de acordo com a dose de inóculo, sendo um inoculado com 10.000 e outro com 50.000 formas tripomastigotas, menos o inoculado com formas de triatomíneos em que o inóculo foi apenas com 10.000 tripomastigotas. Observou-se na infecção pela cepa Y, retardo na evolução da parasitemia nos inoculados com formas de cultura e atenuação de virulência com o inóculo de 10.000 formas. Os caracteres básicos da cepa foram mantidos com predominância de macrofagotropismo na fase inicial da infecção e miotropismo nas fases tardias,predominância de forma delgadas e elevada patogenicidade, com 100% de mortalidade embora com variação nos periodos de sobrevida. Na infecção pela cepa Peruana observou-se também retardo da evolução da parasitemia com o inóculo de 10.000 formas provenientes de triatomíneos, de cultura e de criopreservação. Entretanto, as características morfológicas, o tropismo tissular e a patogenicidade foram mantidos.

Padrão isoenzimático da cepa Y do Trypanosoma cruzi após quimioterapia específica

Foi estudado o perfil isoenzimático da cepa Y do Trypanosoma cruzi isolada de camundongos tratados e não curados com o Nufurtimox (Bay 2502) ou com o Benzonidazol (Ro 7.1051), submetida à passagens em camundongos recém-nascidos e a seguir inoculada nos seguintes grupos experimentais: I - camundongos inoculados com a cepa Y resistente ao Nifurtimox e tratados com esta mesma droga; II - camundongos inoculdado com a cepa Y resistente ao Nifurtimox e tratados com o Benzonidazol e III - camundognos resistentes ao tratamento com o Benzonidazol e tratados com esta mesma droga. Os inóculos foram de 15 x 10 [elevado a 4 ] tripomastigotas sanguícolas. Houve aumento de resistência em relação a cepa original com a mesma droga e resistência cruzada. A cepa Y isolada dos animais não curados foi passada em cultura em meio Warren e preparados os extratos enzimáticos para a eletroforese das seguintes enzimas: GPI, PGM, ALAT e ASAT. Como controle isoenzimático foram utilizadas as cepas Peruana (Tipo I), 21 SF (Tipo II) e Colombiana (Tipo III) e duas amostras da cepa Y mantidas por diferentes período em cultura e em criopreservação dos extraidos enzimáticos. Não houve modificações do perfil isoenzimático da cepa Y, que Tipo I (Peruana) e ao padrão das amostras da cepa Y com diferentes períodos de manutenção.