Aflatoxinas: conceitos sobre mecanismos de toxicidade e seu envolvimento na etiologia do câncer hepático celular

Foram revistos os conceitos de maior relevância sobre mecanismos de toxicidade e evidências do envolvimento das aflatoxinas na etiologia do câncer hepático humano. A aflatoxina B1 (AFB1), principal metabólito produzido por fungos do gênero Aspergillus, manifesta seus efeitos tóxicos após conversão hepática em AFB1-epóxido, o qual reage com macromoléculas celulares, incluindo proteínas, RNA (ácido ribonucléico) e DNA (ácido desoxirribonucléico). A reação com o DNA ocorre através da ligação com guaninas, ao nível do códon 249, do gene supressor de tumores p53. Em seres humanos, estudos de biomonitoramento individual de derivados AFB1-N7-guanina tem demonstrado que as aflatoxinas constituem importantes fatores de risco, com uma provável interação sinergística com o vírus da hepatite B, para o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular em populações expostas. Considerando-se a ocorrência freqüente das aflatoxinas em produtos alimentícios, no Brasil, ressalta-se a necessidade de estudos que avaliem criteriosamente o impacto dos níveis de exposição a estas toxinas sobre a saúde humana.

Aflatoxinas e ocratoxina A em alimentos e riscos para a saúde humana

OBJETIVOS: A presença de micotoxinas em alimentos tem sido correlacionada a várias patologias humanas, e as autoridades de saúde no mundo todo têm implementado ações para diminuir a ingestão desses compostos pela dieta. Realizou-se pesquisa para analisar os níveis de aflatoxinas e ocratoxina A de alimentos para consumo e avaliar o potencial de risco da exposição humana a essas micotoxinas. MÉTODOS: Foram analisadas 366 amostras de alimentos consumidos no Distrito Federal, no período de julho de 1998 a dezembro de 2001, como amendoim e derivados, castanhas, milho, produtos de trigo e/ou aveia, arroz e feijão. As amostras foram processadas, e as micotoxinas extraídas, detectadas e quantificadas por fluorescência após separação em cromatografia camada delgada. RESULTADOS: Foram detectadas aflatoxinas em 19,6% das amostras, em amendoim cru e derivados, milho de pipoca, milho em grão e castanha-do-pará (>2 mig/kg). Amendoim e derivados apresentaram maior incidência de contaminação por aflatoxinas (34,7%) com amostras contendo até 1.280 mig/kg de AFB1+AFG1 e 1.706 mig/kg de aflatoxinas totais. Das amostras positivas, AFB1 estava presente em 98,5%, AFB2 em 93%, AFG1 em 66,7% e AFG2 em 65,4%. A ocratoxina A não foi detectada (<25 mig/kg) em nenhuma amostra analisada. CONCLUSÃO: Os níveis de contaminação encontrados em amendoim e derivados ultrapassaram os níveis máximos permitidos pela legislação brasileira, podendo significar fator de risco para a população que os consome regularmente. A conscientização dos produtores de alimentos e as ações de vigilância sanitária permanentes são essenciais para diminuir a exposição humana a esses compostos e prevenir doenças crônicas advindas dessa exposição.

Photometric procedure for quantitative analysis of Aflatoxin B1 in peanuts by thin-layer chromatography using charge coupled device detector

A photometric procedure was developed for determination of aflatoxin B1 in peanuts by TLC-CCD technique. The quantification and detection limit were 1.2 μg kg-1 and 0.4 ng per spot, respectively, with mean recovery of 98%. The CCD camera is sufficiently sensitive to detect small changes in spots fluorescence intensity and the results for performance confirmed the efficiency of the method. Another important property of CCD detector is its linearity for a wide range of luminous stimulus determined by analysis of five-point calibration curves using the intensity of AFB1 fluorescence versus AFB1 concentration (0.8 to 4.8 ng per spot). The method was applied to the analysis of thirty nine peanut samples and aflatoxin B1 levels ranged from 16 to 115 μg kg-1. The TLC-CCD and the photometric procedure developed in this study demonstrated to be a simple and efficient tool for quantitative analyses of AFB1 in peanut samples.

Intoxicação experimental por aflatoxina em bezerros

Foram realizados dois experimentos para determinar os efeitos tóxicos de diferentes doses de aflatoxinas em bezerros, considerando-se aspectos clínicos, produtivos e patológicos. No primeiro experimento, nove bezerros, Holandês, com 2-4 meses de idade, receberam ração contendo 500±100 ppb de aflatoxina, na quantidade equivalente a 1,5% do peso vivo/dia, durante dois meses. Três bezerros de idade e peso semelhantes foram usados como controle e, exceto por terem recebido ração livre de aflatoxinas, foram mantidos nas mesmas condições. No segundo experimento, três bezerros, Holandês, com 4-5 meses de idade, receberam, por via oral, pequenas porções diárias de um concentrado de aflatoxinas, diluídas em 500ml de água, correspondendo a doses de 1.250, 2.500 e 5.000 ppb de aflatoxina B1 (AFB1). Um bezerro, Holandês, 4 meses, macho, foi usado como controle. No primeiro experimento, o ganho de peso dos bezerros recebendo AFB1 foi equivalente ao do grupo controle durante todo período experimental. Nesse experimento não foram observadas alterações na atividade sérica da enzima aspartato transaminase (AST), nos níveis da albumina sérica (AS), da proteína total (PT) e no hematócrito, quando comparados os resultados semanais do grupo tratamento e controle. No entanto, observou-se diferença significativa nas atividades séricas das enzimas fosfatase alcalina (FA) e gama glutamil transferase (GGT) entre o grupo tratamento e o grupo controle, na coleta do 63º dia do experimento. Durante o período experimental, e três semanas após o término desse período, não foram observados sinais clínicos e alterações histopatológicas associadas ao consumo de aflatoxinas, em qualquer dos bezerros do grupo tratamento do primeiro experimento. No segundo experimento, sinais clínicos observados nos três bezerros intoxicados incluíram perda de apetite, diminuição do ganho de peso e emagrecimento. Icterícia, diarreia intermitente, tenesmo e apatia severa, foram observadas apenas no bezerro que recebia 5.000 ppb de AFB1. Esses sinais clínicos foram a razão para eutanásia desse bezerro. Níveis alterados da atividade sérica de FA e GGT foram observados em todos os bezerros do grupo tratamento durante grande parte do período experimental. Queda acentuada do nível da AS sérica foi observada na coleta do 49º dia do experimento no bezerro que recebia a maior dose de aflatoxina. Não foram observadas variações no hematócrito e na atividade sérica da AST, nem nos níveis séricos de proteína total, bilirrubina total e bilirrubina direta em qualquer dos bezerros desse experimento. Alterações histopatológicas nos bezerros intoxicados incluíram proliferação de ductos biliares, degeneração citoplasmática vacuolar consistente com acumulação hepatocelular de lipídios, fibrose periportal, ou em ponte, megalocitose, fibrose subendotelial das veias hepáticas terminais e edema. Achados de necropsia do bezerro recebendo a maior dose de AFB1 incluíram fígado levemente aumentado de tamanho, difusamente amarelo-claro e firme, discreta ascite, edema de mesentério e submucosa do abomaso. Os dados obtidos nesses experimentos permitem afirmar que doses de 500±100 ppb de AFB1 não causam alterações patológicas e produtivas em bezerros em condições experimentais, mas podem estar associadas à mínimas alterações bioquímicas, enquanto doses de 1.250, 2.500 e 5.000 ppb de aflatoxina B1 causam doença hepática crônica em bezerros em condições experimentais.

Estudo sobre a ocorrência de fungos e aflatoxina B1 na dieta de bovinos leiteiros em São Paulo

A qualidade da dieta ofertada às vacas em lactação é uma preocupação dos agentes de saúde devido à possibilidade da detecção de micotoxinas prejudiciais a saúde humana e animal. Os objetivos do trabalho foram avaliar o perfil da micobiota, determinar a atividade de água (Aa) e a ocorrência natural de aflatoxina B1 (AFB1) em dietas ofertadas a vacas em lactação de fazendas leiteiras no estado de São Paulo, Brasil. As amostragens das dietas foram realizadas diretamente dos cochos de lote de 15 vacas, em dois dias consecutivos com intervalos de 24h e a cada 15 dias, perfazendo um período de 45 dias de amostragens por fazenda. A purificação e determinação de AFB1 foram realizadas em colunas de imunoafinidade e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). O estudo da micobiota presente nas amostras das dietas (288) revelou que as leveduras foram predominantes em todas as dietas (83,97 a 99,98%). Foram isolados 15 gêneros de fungos filamentosos, com os gêneros Aspergillus spp (20,09%), Fusarium spp (14,16%) e Penicillium spp (11,48%) os mais prevalentes. As contagens de Unidades Formadoras de Colônias por grama de alimento (UFC. g-1) variaram de 102 a 1011. A atividade de água das amostras variou entre 0,91 a 0,98. Foi detectada a presença de AFB1 em 31,44% das amostras com teores entre 1,68 a 194,51μg.kg-1. Medidas de boas práticas de produção, estocagem e utilização devem ser tomadas para diminuir a ocorrência de AFB1 nas dietas ofertadas às vacas em lactação.

Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric quantification

A method for determining aflatoxins B1 (AFB1), B2 (AFB2),G1 (AFG1) andG2 (AFG2) in maize with florisil clean up was optimised aiming at one-dimensional thin layer chromatography (TLC) analysis with visual and densitometric quantification. Aflatoxins were extracted with chloroform: water (30:1, v/v), purified through florisil cartridges, separated on TLC plate, detected and quantified by visual and densitometric analysis. The in-house method performance characteristics were determined by using spiked, naturally contaminated maize samples, and certified reference material. The mean recoveries for aflatoxins were 94.2, 81.9, 93.5 and 97.3% in the range of 1.0 to 242 µg/kg for AFB1, 0.3 to 85mg/kg for AFB2, 0.6 to 148mg/kg for AFG1 and 0.6 to 140mg/kg for AFG2, respectively. The correlation values between visual and densitometric analysis for spiked samples were higher than 0.99 for AFB1, AFB2, AFG1 and 0.98 for AFG2. The mean relative standard deviations (RSD) for spiked samples were 16.2, 20.6, 12.8 and 16.9% for AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2, respectively. The RSD of the method for naturally contaminated sample (n = 5) was 16.8% for AFB1 and 27.2% for AFB2. The limits of detection of the method (LD) were 0.2, 0.1, 0.1 and 0.1mg/kg and the limits of quantification (LQ) were 1.0, 0.3, 0.6 and 0.6mg/kg for AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2, respectively.

Comparison of methods by TLC and HPTLC for determination of aflatoxin M1 in milk and B1 in eggs

Milk and egg matrixes were assayed for aflatoxin M1 (AFM1) and B1 (AFB1) respectively, by AOAC official and modified methods with detection and quantification by thin layer chromatography (TLC) and high performance thin layer chromatography (HPTLC). The modified methods: Blanc followed by Romer, showed to be most appropriate for AFM1 analysis in milk. Both methods reduced emulsion formation, produced cleaner extracts, no streaking spots, precision and accuracy improved, especially when quantification was performed by HPTLC. The use of ternary mixture in the Blanc Method was advantageous as the solvent could extract AFM1 directly from the first stage (extraction), leaving other compounds in the binary mixture layer, avoiding emulsion formation, thus reducing toxin loss. The relative standard deviation (RSD%) values were low, 16 and 7% when TLC and HPTLC were used, with a mean recovery of 94 and 97%, respectively. As far as egg matrix and final extract are concerned, both methods evaluated for AFB1 need further studies. Although that matrix leads to emulsion with consequent loss of toxin, the Romer modified presented a reasonable clean extract (mean recovery of 92 and 96% for TLC and HPTLC, respectively). Most of the methods studied did not performed as expected mainly due to the matrixes high content of triglicerides (rich on saturated fatty acids), cholesterol, carotene and proteins. Although nowadays most methodology for AFM1 is based on HPLC, TLC determination (Blanc and Romer modified) for AFM1 and AFB1 is particularly recommended to those, inexperienced in food and feed mycotoxins analysis and especially who cannot afford to purchase sophisticated (HPLC,HPTLC) instrumentation.

Aflatoxinas em produtos à base de milho comercializados no Brasil e riscos para a saúde humana

As aflatoxinas são metabólitos secundários tóxicos, produzidos por fungos do gênero Aspergillus. As técnicas de ensaio imunoenzimático (ELISA) e cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas na determinação de aflatoxina total, em produtos alimentícios à base de milho comercializados em Maringá e Marialva, Paraná, Brasil, entre abril de 2003 e março de 2004. Foram analisadas 123 amostras, das quais sete apresentaram-se positivas na CCD e 16 no ELISA. O valor médio de aflatoxina total encontrado nas amostras utilizando-se a CCD foi 0,62 µg/kg, enquanto que pela técnica ELISA foi encontrado o valor de 0,78 µg/kg. Os resultados apresentaram diferenças significativas entre ELISA e CCD (T=12, p=0,0469). Os dados demonstraram baixa ocorrência de aflatoxinas nos produtos à base de milho analisados. Entretanto, a Ingestão Diária Provável Média (IDP M) de AFB1 foi acima da Ingestão Diária Tolerável (IDT), indicando um risco de hepatocarcinogenicidade na população brasileira da Região Sul do Brasil, devido ao consumo de produtos à base de milho. O método ELISA mostrou-se simples, rápido e com menor uso de solventes orgânicos, porém apresentou resultados presuntivos positivos e negativos, tornando necessária a confirmação da identidade das micotoxinas pesquisadas por CCD.

Determinação de aflatoxina B1 em rações e aflatoxina M1 no leite de propriedades do Estado de São Paulo

A ocorrência de aflatoxina B1 (AFB1) em rações e aflatoxina M1 (AFM1) no leite cru foi avaliada em propriedades leiteiras situadas na região nordeste do Estado de São Paulo, Brasil, de outubro de 2005 a fevereiro de 2006. A análise de aflatoxinas foi efetuada utilizando-se colunas de imunoafinidade para purificação dos extratos, sendo a quantificação realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência. A AFB1 foi detectada em 40% das rações em níveis de 1,0 a 19,5 μg.kg-1. A concentração de AFM1 em 36,7% de amostras de leite positivas variou de 0,010 a 0,645 μg.L-1. Somente uma amostra de leite estava acima do limite de tolerância adotado no Brasil (0,5 μg.L-1) para AFM1. Concluiu-se que as concentrações de aflatoxinas na ração e no leite foram relativamente baixas, embora a alta frequência das aflatoxinas nas amostras analisadas indique a necessidade de contínuo monitoramento a fim de prevenir a contaminação de ingredientes e rações destinadas ao gado leiteiro.

Ability of a Lactobacillus rhamnosus strain cultured in milk whey based medium to bind aflatoxin B1

This study aimed to compare Lactobacillus rhamnosus growth in MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) broth and a culture medium containing milk whey (MMW) and to evaluate aflatoxin B1 (AFB1) adsorption capacity by bacterial cells produced in both culture media. L. rhamnosus cells were cultivated in MRS broth and MMW (37 °C, 24 hours), and bacterial cell concentration was determined spectrophotometrically at 600 nm. AFB1 (1 µg/ml) adsorption assays were conducted using 1 x 10(10) non-viable L. rhamnosus cells (121 °C, 15 minutes) at pHs 3.0 and 6.0 and contact time of 60 minutes. AFB1 quantification was performed by High Performance Liquid Chromatography. Bacterial cell concentration in MMW was higher (9.84 log CFU/ml) than that in MRS broth (9.63 log CFU/ml). There were no significant differences between AFB1 binding results at the same pH value (3.0 or 6.0) for the cells cultivated in MRS broth (46.0% and 35.8%, respectively) and in MMW (43.7% and 25.8%, respectively), showing that MMW can adequately replace the MRS broth. Therefore, it can be concluded that the use of L. rhamnosus cells cultivated in MMW offers advantages such as reduction in large scale production costs, improvement of environmental sustainability, and being a practicable alternative for decontamination of food products susceptible to aflatoxin contamination.

Antimutagenic, antiproliferative, and antioxidant effect of extracts obtained from octopus (Paraoctopus limaculatus)

Abstract The search for chemopreventive/chemoprotective compounds in marine organism has been extensively reported; however, the presence of these compounds in octopus has been incipiently explored. In this research, the antimutagenic, antiproliferative, and antioxidant potential of three crude extracts (methanolic, acetonic, and hexanic) from Paroctopus limaculatus was investigated. Antimutagenic activity against aflatoxin B1 (AFB1) was evaluated through the Ames test using Salmonella typhimurium tester strains TA98 and 100. Antiproliferative activity was assessed using the standard MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide) assay on M12.C3.F6 murine cell line. Antioxidant activity was assessed using the DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) and ABTS (2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) methods. Hexanic extract showed the highest antimutagenic and antiproliverative activities inhibiting 80 and 43% of mutagenicity induced by AFB1 for TA98 and TA100, respectively, and showing a high antiproliferative activity at 200 and 100 µg/mL. However, when the antioxidant activity was evaluated at a concentration of 50 mg/mL, the methanolic fraction exerted inhibition of 98 and 96 % ABTS and DPPH radicals, respectively. RP-HPLC and 1H-RMN analyses suggested the presence of double bonds with extended conjugation and oxygenated compounds such as alcohols, esters, ethers or ketones. These results suggested that hexanic and methanolic extract form octopus contained compounds with chemoprotective and antioxidant properties.