Seleção de genótipos de aceroleira assistida por marcadores isoenzimáticos visando à resistência a Meloidogyne incognita raça 2

A cultura da aceroleira despertou um grande interesse do mercado consumidor, tendo em vista o alto teor de vitamina C (ácido ascórbico), que varia entre 1.325 a 2.250 mg por 100 mL de suco. Com a expansão da cultura, surgiram problemas fitossanitários, entre os quais a infecção das raízes da aceroleira por nematóides. Os produtos químicos utilizados no controle dos nematóides são agressivos ao meio ambiente, e a seleção de genótipos resistentes e tolerantes constitui-se na melhor alternativa para a solução do problema. O trabalho foi desenvolvido em casa de vegetação com 18 genótipos de aceroleira, com o objetivo de encontrar genótipos resistentes e tolerantes a Meloidogyne incognita raça 2 assistida por marcadores isoenzimáticos, para indicar plantas destinadas a porta-enxerto. A avaliação foi realizada 60 dias após a inoculação mediante análise das variáveis: número de ovos por planta e por grama de raiz, índice de galhas e massa de ovos, biomassa fresca relativa do sistema radicular e biomassa fresca relativa da parte aérea. Os resultados permitiram identificar o genótipo 023-CMF como menos suscetível, e os genótipos 027-CMF e 035-CMF, como mais suscetíveis. Estudos realizados através da eletroforese isoenzimática com os sistemas α esterase, fosfatase ácida e peroxidase, 20; 40 e 60 dias após a inoculação com ovos de M. incognita raça 2, possibilitaram relacionar a expressão de proteínas com a suscetibilidade. Os genótipos mais próximos geneticamente, com índice de similaridade 0,941, foram 027-CMF e 026-CMF, 046-CMF e 026-CMF, e 041-CMF e 026-CMF. O menor índice de similaridade genética (0,115) foi observado entre os genótipos 002-SPE e 036-CMF.

Caracterização de genes diferencialmente expressos na interação entre maçã 'Fuji' e Botryosphaeria dothidea

O objetivo deste estudo foi investigar a interação entre o fungo Botryosphaeria dothidea e maçãs cv. Fuji por meio da técnica de Differential Display RT-PCR. O cDNA de frutos infectados e não infectados pelo fungo foi amplificado com uma combinação de 15 oligonucleotídeos iniciadores. Foram isolados 400 fragmentos de cDNA diferencialmente expressos, dos quais 120 foram sequenciados e comparados com sequências disponíveis no GenBank, por meio do programa BLASTX. As sequências obtidas foram similares à metalotioninas, profilina alergênica, proteína de resistência e fosfatase.

Estudo comparativo de isolados de Colletotrichum graminicola através da análise eletroforética de padrões protéicos e isoenzimáticos

Colletotrichum graminicola, agente causal da antracnose ou podridão do colmo do milho (Zea mays), é um importante patógeno com alta variabilidade genética. Nove isolados desta espécie foram comparados através do uso da análise eletroforética em gel de poliacrilamida, utilizando três sistemas: proteínas totais, esterase e fosfatase ácida. A análise mostrou variação no número e posição das bandas no gel, dentro de cada sistema estudado. Com relação a proteínas totais, foi observado maior polimorfismo, embora os isolados Cgr8 e Cgr9 tenham mostrado idêntico perfil com seis bandas protéicas de mesma mobilidade relativa. Na atividade esterásica, esses mesmos isolados apresentaram um comportamento monomórfico, enquanto os demais revelaram polimorfismo. Na análise fosfatase ácida, todos os isolados mostraram-se semelhantes quanto à presença de duas bandas, porém diferentes em relação a mobilidade das moléculas no gel. Igualdade de comportamento, quanto à mobilidade relativa das bandas de fosfatase ácida, foi observada entre Cgr1 e Cgr2, como também entre Cgr6 , Cgr7 e Cgr8. Em geral, nos três sistemas testados, os isolados de C. graminicola apresentaram bandas em comum, indicando a relação existente entre eles, e que a variação fenotípica observada seja provavelmente decorrente da condição nuclear, homozigótica ou heterozigótica, de cada isolado do fitopatógeno.

Caracterização isoenzimática de espécies de Oidium

Isolados de Oidium oriundos de eucalipto (Eucalyptus urophylla) roseira (Rosa sp), dália (Dhalia sp.), feijoeiro (Phaseolus vulgaris) e urucunzeiro (Bixa orellana) foram comparados mediante écnicas de extração e eletroforese de isoenzimas, em gel de amido. Dentre 19 enzimas testadas, fosfatase ácida, enzima málica, alfa-esterase, 6-fosfoglucanato desidrogenase, fosfoglucose isomerase, hexoquinase e malato desidrogenase ofereceram atividade e resolução satisfatórias. Os isolados do patógeno oriundos de eucalipto e de roseira apresentaram um mesmo padrão de bandas com coeficiente de similaridade igual a 100%. Os demais isolados diferiram entre si e exibiram coeficiente de similaridade inferior a 43%. Os isolados obtidos de eucalipto e de roseira, além de morfologicamente similares, apresentaram um mesmo padrão isoenzimático sendo, portanto, anamorfos de Sphaerotheca pannosa.

Caracterização de uma nova estirpe do Tomato mosaic virus isolada de tomateiro no Estado de São Paulo

Um vírus isolado em Guaratinguetá, SP, de tomateiro (Lycoporsicon esculentum) 'Santa Clara' com sintomas característicos de virose, foi estudado por meio de plantas indicadoras e de hospedeiras diferenciais pertencentes a linhagens homozigotas de tomateiro, ensaios de estabilidade in vitro, purificação, contrastação negativa, testes sorológicos de ELISA-PTA e imunomicroscopia eletrônica, utilizando-se anti-soros contra diferentes vírus do gênero Tobamovirus. O isolado infetou plantas de espécies de amarantáceas, quenopodiáceas e solanáceas. Plantas de Chenopodium amaranticolor reagiram com sintomas locais e sistêmicos; Nicotiana sylvestris e N. rustica reagiram com lesões locais e a linhagem homozigota de tomateiro Tm-2 mostrou-se imune ao vírus. Nas preparações purificadas de contrastação negativa, foram observadas partículas rígidas e alongadas com cerca de 300 nm. O isolado foi identificado como um tobamovírus, com anti-soros contra o Tomato mosaic virus (ToMV) e Tobacco mosaic virus (TMV). As hospedeiras diferenciais indicaram se tratar de ToMV. Por meio de RT-PCR, com oligonucleotídeos para o gene da capa protéica de espécies do gênero Tobamovirus do subgrupo 1, amplificaram-se fragmentos com 850 pb que foram clonados e seqüenciados. A similaridade de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos variou entre 85 e 91% quando a seqüência do ToMV-SP foi comparada com outras sequências de ToMV, 75 e 83% quando comparada com as do TMV e 67 e 72% quando comparada com a do Odontoglossum ringspot virus (ORSV). As comparações com outras espécies de tobamovírus apresentaram valores de similaridade inferiores a 65%. Confirmou-se a identidade dos vírus como sendo uma nova estirpe do ToMV.

Caracterização enzimática e patogenicidade cruzada de Colletotrichum spp. associados a doenças de pós-colheita

A antracnose, causada por Colletotrichum spp., pode ocasionar grandes perdas a nível de campo e em pós-colheita sobre diversas culturas e seus produtos. O presente trabalho teve por objetivos testar a patogenicidade cruzada de isolados de C. gloeosporioides do caju (Anacardium occidentale) (CAJ), manga (Mangifera indica) (MG), mamão (Carica papaya) (MM), maracujá (Passiflora edulis) (MR) e C. musae da banana (Musa spp.) (BAJ); avaliar a produção de enzimas extracelulares (amilolítica, celulolítica, lipolítica e proteolítica) produzidas pelos isolados em substratos sólidos específicos; e detectar padrões eletroforéticos de proteínas totais e isoenzimas (alfa-esterase, beta-esterase, fosfatase ácida e leucina aminopeptidase). Na análise da patogenicidade cruzada, todos os isolados de Colletotrichum spp. induziram lesões necróticas, deprimidas sobre os frutos, exceto em maracujá que foi suscetível tão somente ao isolado MR. Quanto à produção de enzimas extracelulares hidrolíticas, os isolados de C. gloeosporioides produziram amilase, lipase, protease e celulase, sendo que esta última enzima não foi detectada em C. musae. Com relação à análise eletroforética de proteínas totais e isoenzimas, os isolados apresentaram variações no número e posição das bandas no gel de poliacrilamida em todos os sistemas, com exceção de leucina aminopeptidase, onde bandas monomórficas foram formadas, sem variação na intensidade e pouca variação na mobilidade relativa.

Marcadores morfofisiológicos e isoenzimáticos na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum

Os fungos Acremonium strictum e Fusarium verticillioides normalmente apresentam algumas similaridades morfológicas. Este fator dificulta sua diferenciação em sementes, particularmente quando ocorrem simultaneamente. A análise de isoenzimas tem possibilitado o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos no diagnóstico de fitopatógenos em complemento à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de dez isolados de A. strictum obtidos de sementes de milho (Zea mays), provenientes de diferentes regiões produtoras brasileiras por meio da análise de nove marcadores morfofisiológicos e de cinco sistemas isoenzimáticos (aldolase, esterase, fosfatase ácida, fosfatase alcalina e malato desidrogenase). Objetivou-se ainda diferenciar os isolados de A. strictum de F. verticillioides por meio das técnicas citadas. A eletroforese de isoenzimas forneceu um total de 28 bandas polimórficas. Aspectos como pigmentação da colônia, velocidade e taxa de crescimento, produção de massa e densidade miceliais, e a análise isoenzimática tornaram possível e seguro o agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de F. verticillioides. Os isolados de A. strictum apresentaram variabilidade intraespecífica entre 0% e 89,5%. Para a maioria dos casos não foi possível correlacionar a similaridade fenotípica com a origem geográfica dos isolados de A. strictum.

Especificidade de anti-soro policlonal à Leifsonia xyli subsp. xyli

Detectar a presença da bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli em material de propagação da cana-de-açúcar (Saccharum sp.) é importante para direcionar o controle do raquitismo-da-soqueira. Neste trabalho, objetivou-se produzir anticorpo policlonal específico contra Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), visando utilizá-lo em método sorológico para detecção do patógeno. Para isso, o antígeno foi preparado a partir de células intactas, após lavagem por centrifugação de cultura-pura em tampão fosfato salino 0,01 M (PBS) e diálise em glutaraldeido 2% em PBS. O plano de imunização em coelho consistiu de duas injeções intramusculares da mistura 1:1 do antígeno com adjuvante Freund (completo e incompleto, a intervalos de 21 dias) e duas injeções subcutâneas do antígeno puro, a intervalos de dez dias. O anti-soro foi testado pelo método de Dot Blot com revelação por peroxidase para se determinar: (i) título do anticorpo e (ii) reação contra Lxx, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria e bactérias endofíticas de cana-de-açúcar (Azospirillum brasilense, A. lipoferum, Herbaspirillum rubrisubalbicans, H. seropedicae e Gluconacetobacter diazotrophicus). A maior diluição analisada do anti-soro 1:20.000 mostrou reação fortemente positiva e específica contra Lxx e ausência de reação contra as demais bactérias. A purificação da fração IgG (Imunoglobulina G) não resultou em melhoria na reatividade e especificidade do anti-soro. Estimou-se o nível de detecção do método a partir de suspensão bacteriana em 2x10(6) células/ml.

Identificação sorológica de espécies de potyvirus em melancia, no estado de Roraima

No período de maio de 2003 a março de 2004, foram coletadas amostras foliares de plantas de melancia (Citrullus lanatus) de 21 campos de cultivo de cucurbitáceas, no Estado de Roraima. As amostras exibiam diferentes sintomas de vírus e foram levadas para o Laboratório de Virologia Vegetal da Universidade Federal do Ceará para serem testadas por "enzyme linked immunosorbent assay" (Elisa)-indireto, contra anti-soros específicos para Cucumber mosaic virus (CMV), Papaya ringspot virus estirpe melancia (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). Nos testes de Elisa, utilizou-se o conjugado universal, anti-imunoglobulina (IgG) de coelho produzida em cabra conjugada à enzima fosfatase alcalina. Todas as amostras foram testadas, também, por dupla difusão contra o anti-soro para Squash mosaic virus (SqMV). Os resultados indicaram a presença do PRSV-W em 84,2% das amostras coletadas em maio de 2003, em 7,1% das amostras coletadas em dezembro de 2003 e em 55,6% das amostras coletadas em março de 2004. A presença do ZYMV foi observada em 10,5% das amostras coletadas em maio de 2003, 21,4% das amostras coletadas em dezembro de 2003 e em 25,9% das amostras de março de 2004. O WMV foi detectado somente em oito das amostras coletadas em março de 2004 (29,6%). Os resultados desta pesquisa confirmam a ampla dispersão do PRSV-W em cultivos de cucurbitáceas no território brasileiro e a preocupante expansão do ZYMV em razão dos elevados prejuízos que o mesmo tem causado em outras partes do mundo.

Produção de enzimas extracelulares por Crinipellis perniciosa

Isolados de Crinipellis perniciosa, obtidos a partir de cacaueiro (Theobromae cacao), cupuaçuzeiro (T. grandiflorum) e solanáceas silvestres foram testados quanto à capacidade de produzirem enzimas extracelulares que degradam celulose, amido, lipídios e lignina. A produção de todas as enzimas foi determinada em meios sólidos e representada por uma estimativa, baseada na intensidade de cor, ou pela avaliação do diâmetro dos halos formado nos meios. Foi detectada variabilidade entre os isolados na capacidade de produzir enzimas celulolíticas, amilases, lipases, polifenol-oxidases, peroxidases e esterases. Quanto às enzimas proteolíticas, todos os isolados apresentaram alto nível de atividade, não sendo observada diferença no comportamento entre eles. Por outro lado, nenhum dos isolados produziu pectinase, urease e fosfatase-ácida. Os papéis das enzimas líticas produzidas pelos isolados de C. perniciosa na patogênese e na produção de basidiomas são discutidos

Caracterização de um isolado do Bean rugose mosaic virus (BRMV) de Minas Gerais e estimativa de perdas em feijoeiro em infecção simples ou em conjunto com o BCMV

Plantas de feijão-vagem do cultivar Novirex apresentando mosaico e enrolamento de vagens, sem deformação foliar evidente, foram coletadas em 2002 em Cordisburgo, MG. Estudos preliminares identificaram o vírus como um isolado do Bean rugose mosaic virus (BRMV). Este trabalho relata a caracterização do isolado, por meio de produção e avaliação de anti-soro, determinação da gama de hospedeiros, estudo da transmissão do vírus por besouros crisomelídeos e estimativa de perdas em feijoeiro como resultado de infecção isolada ou em conjunto com o Bean common mosaic virus (BCMV). O roteiro adotado para purificação possibilitou a obtenção de vírus purificado em rendimento satisfatório para a produção de anti-soro. A titulação dos anti-soros foi realizada por ELISA indireto, obtendo-se reações positivas com a diluição máxima testada (1:70.000). Das 22 espécies vegetais utilizadas na gama de hospedeiros, foram infectadas plantas de Chenopodium quinoa e alguns cultivares de feijão e soja, conforme esperado para o BRMV. O isolado de BRMV foi transmitido pelo besouro crisomelídeo Cerotoma arcuata a uma taxa de 33,3%. A infecção simples de feijão 'Ouro Negro' e de feijão-vagem 'Novirex' levou a uma redução do peso das vagens por planta de 3,4% e 84,9%, respectivamente. Infecção mista do BRMV com o BCMV levou a uma redução do peso de vagens por planta de até 70,1% para 'Novirex' e de até 90,8% para 'Ouro Negro'.

Peroxidases ativadas por frações protéicas de extrato biológico eficaz na proteção do tomateiro contra a mancha bacteriana

Uma formulação natural (VLAF) obtida da extração aquosa a frio de pó de tecido necrótico de lobeira (Solanum lycocarpum), infectado por Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, promoveu redução significativa no progresso da mancha foliar bacteriana (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), quando previamente pulverizado em folhas de tomateiro. Duas frações obtidas por precipitação salina, F0/30 e F30/60, apresentaram a maior parte das proteínas do extrato VLAF e foram submetidas à cromatografia de troca catiônica para separação das proteínas contidas nas frações. Os picos não retidos dessa cromatografia foram então submetidos à cromatografia de troca aniônica. Todos os picos, retidos e não retidos das duas cromatografias, foram amostrados e pulverizados sobre plantas de tomate cv. Santa Cruz Kada. Respostas diferenciais de atividade de peroxidases foram obtidas 14 horas após pulverizações. As amostras que induziram os maiores aumentos na atividade de peroxidases nas plantas foram o pico retido em CM-celulose da F0/30 (F0-30CMR) e o pico retido em DEAE-celulose da F30/60 (F30-60DEAER). Os resultados deste estudo indicaram a viabilidade da purificação e da caracterização de proteínas ou carboidratos eliciadores provenientes de VLAF.

Distribuição de Cr, Ni, Cu, Cd e Pb em frações húmicas de diferentes tamanhos moleculares extraídas de amostras de água e de sedimentos do reservatório de captação de água superficial Anhumas - Araraquara-SP

Estudou-se a distribuição de Cr, Ni, Cu, Cd e Pb em frações de substâncias húmicas (SH) de diferentes tamanhos moleculares. As SH foram extraídas de amostras de água (SHA) e de sedimentos de superfície (SHSS), interface/água (SHSI) e fundo (SHSF) coletados no reservatório de captação de água superficial Anhumas, localizado no município de Araraquara-SP. Para a extração das SH utilizaram-se os procedimentos recomendados pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas. Após purificação por diálise, as SH foram fracionadas com base no tamanho molecular utilizando-se sistema de fracionamento seqüencial por ultrafiltração e fluxo tangencial. O fracionamento das amostras de SHA permitiu caracterizar uma distribuição de massa relativamente uniforme dentre as frações de diferentes tamanhos moleculares, com valores maiores nas frações F2 (20,8%) e F4 (23,8%). Exceto para os íons Pb(II) e Cu(II) os quais apresentaram concentrações relativamente mais altas nas frações F2 e F4, respectivamente, de maneira geral, crômio, níquel, cádmio e chumbo têm distribuições similares nas cinco frações com tamanhos moleculares maiores e médios (F1 a F5). Quanto às distribuições de massa nas diferentes frações de substâncias húmicas extraídas de amostras de sedimento de superfície (SHSS), sedimento interface/água (SHSI) e sedimento de fundo (SHSF), as três amostras apresentaram 42-48% das SH nas frações com maiores tamanhos moleculares (F1 e F2), 29-31% nas frações intermediárias (F3 e F4) e 13-20% nas frações com menores tamanhos moleculares (F5 e F6). De modo geral, caracterizaram-se para os íons metálicos, distribuições similares dentre as respectivas frações F1 a F6. Exceções para Pb(II) e Ni(II) em sedimento de superfície com concentrações relativamente menores nas frações F2 e F4, respectivamente.

Síntese, caracterização e estudos de transferencia de energia do complexo dimérico constituído por Zn e Mn porfirina

Muitos compostos modelo contendo porfirinas têm sido preparados num esforço para entender o sistema de fotossíntese e os processos de aproveitamento de energia solar. Sistemas doadores-receptores contendo porfirinas têm sido freqüentemente estudados para testar várias descrições teóricas sobre transferência de elétrons. O estudo de parâmetros fotoquímicos e fotofísicos como a distância para transferência de energia, geometria molecular e a diferença de potencial eletrônico, tem se mostrado importante para a definição da transferência eletrônica em porfirinas. Neste trabalho apresentamos a síntese, purificação e caracterização por espectroscopia UV/Vis, ¹H e 19F RMN, luminescência e tempos de vida de novos modelos moleculares de porfirinas, que permitam investigar esses parâmetros. Utilizou-se o dímero Zn,Mn(TPPF4)2pip e seus monômeros ZnTPPF4pipH e MnF5TPP. A caracterização do ZnMn(TPPF4)2pip, foi dificultada devido a presença de Mn+3, devido ao forte acoplamento dos orbitais dpi do manganês e o sistema pi da porfirina, que aumenta a interação manganês-porfirina mudando o espectro eletrônico UV/Vis e distorcendo os sinais de ¹H e 19F RMN do dímero. A presença de Mn+3 desloca E1/2 do anel porfirínico para valores mais negativos, o que resulta em reduções mais difíceis, impedindo a transferência de energia da Znporfirina para a Mnporfirina.

Obtenção de oligossacarídeos N-ligados às glicoproteínas dos líquens Sticta tomentosa e Sticta damaecornis

As glicoproteínas dos líquens Sticta tomentosa e Sticta damaecornis foram extraídas utilizando-se tampão específico e fracionadas pela adição crescente de sulfato de amônio. Dentre os diferentes cortes de saturação obtidos, as frações 30-80% de ambos os líquens foram eleitas objeto de estudo desta pesquisa. Métodos químicos e enzimáticos foram aplicados para a obtenção de oligossacarídeos N-ligados, que em seguida, foram derivatizados resultando em tirosinamida-oligossacarídeos. Após inserção do grupo cromóforo nas estruturas oligossacarídicas, os mesmos foram purificados por HPLC com detecção em 280 nm. Em relação ao líquen Sticta tomentosa, os cromatogramas revelaram a presença de dois picos com tempos de retenção de aproximadamente 11 e 18 minutos sugerindo a presença de dois diferentes oligossacarídeos N-ligados. O líquen Sticta damaecornis, seguindo as mesmas condições de purificação, apresentou em cromatografia quatro picos distintos com tempos de 11, 13, 18,2 e 18,4 minutos, respectivamente, sugerindo por sua vez a presença de quatro oligossacarídeos N-ligados diferentes.