Avaliação da eficácia de diferentes protocolos de preparo do Plasma Rico em Plaquetas para uso em Medicina Equina

O Plasma Rico em Plaquetas (PRP) é um preparado do sangue total que contém diversos fatores de crescimento responsáveis pela proliferação e diferenciação celular, angiogênese, como também pelo aumento da produção da matriz extracelular. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi testar 10 protocolos diferentes de centrifugação para obtenção de PRP a partir do sangue total de equinos hígidos. Para isso foram utilizadas 10 amostras de 27mL de sangue total de cinco animais, as quais foram centrifugadas conforme cada protocolo proposto. Os resultados revelaram que os protocolos com menor força de centrifugação relativa resultaram em maior (p<0,05) concentração de plaquetas e, que não houve (p>0,05) influência do tempo de centrifugação em relação a essa variável. A influência do tempo foi observada apenas no número de leucócitos em protocolos com menor força de centrifugação relativa (FCR). Os quatro melhores protocolos, que obtiveram as maiores concentrações de plaquetas, foram submetidos à análise pelo teste de ELISA para dosar a quantidade de TGF-β que não revelou diferença (p>0,05) entre os protocolos.

Pre-and post-puberty physiological plasma oxytocin concentrations in male domestic cats (Felis silvestris catus)

The hormone oxytocin is released by the neuropituitary gland through stimulation of the neurons of the supraoptic and paraventricular nuclei of the hypothalamus. In order to determine the physiological concentrations of this hormone in domestic cats, blood samples were collected from 15 male animals (Felis silvestris catus) during the pre- and post-puberty periods (at four and eight months of age, respectively). Oxytocin determination was accomplished by radioimmunoassay. The average oxytocin concentrations measured in the pre- and post-puberty periods were 2.54±0.24 (μg/dL) and 2.53±0.28 (μg/dL), respectively, and there were no statistical differences between these measurements. Because there are few literature on the analysis of this hormone, especially in the case of male Felis silvestris catus, more studies on the influence of oxytocin on the physiology and reproduction of this species should be conducted under maintenance and situations of stress (such as transportation), and other routine events.

Expressão gênica do colágeno em ferida cutânea de equinos tratada com plasma rico em plaquetas

O plasma rico em plaquetas (PRP) é um produto derivado da centrifugação do sangue total, cuja utilização concentra-se em melhorar a reparação de diferentes tecidos, tendo em vista os fatores de crescimento nele contido. Entretanto, os benefícios da terapia no contexto clínico ainda não estão totalmente esclarecidos. Objetivou-se avaliar a expressão dos genes dos colágenos tipos I e III durante diferentes fases do processo de cicatrização da pele tratada com PRP. Foram utilizados oito equinos machos castrados, mestiços, hígidos, com idade entre 16 e 17 (16,37±0,52) anos. Três feridas em formato quadrangular (6,25cm²) foram confeccionadas nas regiões glúteas direita e esquerda de todos os animais. Doze horas após indução das lesões, 0,5mL do PRP foi administrado em cada uma das quatro extremidades das feridas (T=grupo tratado), de uma das regiões glúteas, escolhida aleatoriamente. A região contralateral foi utilizada como controle (NT=grupo não tratado). As feridas foram submetidas à limpeza diária com água Milli Q, e amostras foram obtidas com biópsias utilizando-se Punch de 6mm de diâmetro. Seis biópsias de pele foram obtidas a primeira no dia de indução das lesões (T0), e as demais com 1 (T1) 2 (T2) 7 (T3) e 14 (T4) dias após a realização das feridas. A sexta biópsia (T5) foi realizada após o completo fechamento da pele. A avaliação da expressão dos genes dos colágenos tipos I e III foi realizada pela técnica qRT-PCR e os dados analisados pelo teste de Bonferroni, t de Student, t pareado e análise de regressão (p<0,05). Diferenças (p<0,05), entre grupos, foram observadas para a expressão de ambos os colágenos nos T1 a T4, sendo maior nos animais do grupo T. O pico de expressão dos colágenos tipos I e III ocorreu no T5 para ambos os grupos, mas a maior expressão foi diferente (p<0,05) do tempo zero a partir do T3. Nos animais do grupo tratado a expressão dos colágenos começou a estabilizar no T5, enquanto que nos equinos do NT os valores permaneceram elevados. A administração local de uma única dose do PRP em ferida cutânea na região glútea de equinos, resulta em maior expressão gênica local dos colágenos tipos I e III. Entretanto, essa expressão não altera o tempo máximo de fechamento macroscópico da ferida.

Quantificação de fatores de crescimento na pele de equinos tratada com plasma rico em plaquetas

O plasma rico em plaquetas (PRP) é um produto derivado da centrifugação do sangue total, sendo rico em fatores bioativos, como os de crescimento. Apesar da ampla utilização em processos cicatriciais, há controvérsia sobre a eficácia da terapia na cicatrização cutânea. O objetivo desse estudo foi quantificar e comparar a concentração dos fatores TGF-β1 e PDGF-BB no PRP, plasma sanguíneo e pele, durante diferentes fases do processo de cicatrização da pele tratada ou não com PRP. Foram utilizados sete equinos machos castrados, mestiços, hígidos, com idade entre 16 e 17 (16,14±0,63) anos. Três lesões em formato quadrangular (6,25cm²) foram produzidas cirurgicamente nas regiões glúteas direita e esquerda de todos os animais. Doze horas após indução das feridas, 0,5mL do PRP foi administrado em cada uma das quatro extremidades das feridas de uma das regiões glúteas (Grupo tratado = GT), escolhida aleatoriamente. A região contralateral foi utilizada como controle (GC). As feridas foram submetidas à limpeza diária com água Milli Q, e amostras foram obtidas mediante biópsias realizadas com Punch de 6mm. Foram obtidas seis biópsias de pele, sendo a primeira realizada logo após a produção da ferida (T0), e as demais com 1 (T1) 2 (T2) 7 (T3) e 14 (T4) dias após a indução da lesão. A sexta biópsia (T5) foi obtida após completo fechamento da pele, que ocorreu aproximadamente aos 37 dias (36,85±7,45, GC; 38,85±6,46, GT). Também foram obtidas amostras de sangue com EDTA em todos os tempos mencionados. A quantificação dos fatores de crescimento TGF-β1 e PDGF-BB na pele, PRP e plasma sanguíneo foi realizada pela técnica ELISA. Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste t, correlação de Pearson e regressão, utilizando nível de significância de 5%. Não houve diferença entre os grupos, nos valores dos dois fatores de crescimento mensurados na pele, nos diferentes tempos. Também não houve correlação entre a quantidade dos fatores de crescimento presentes na pele e no plasma. Por outro lado, correlação positiva foi observada entre PRP e pele no grupo tratado, para os fatores de crescimento TGF-β1 (r=0,31) e PDGF-BB (r=0,38), bem como entre ambos os fatores de crescimento presentes no PRP (r=0,81). Considerando as concentrações dos fatores de crescimento no T0, os maiores valores cutâneos (p<0,05) do TGF-β1, em ambos os grupos, ocorreram nos tempos T3 e T5. Valores mais elevados (p<0,05) do PDGF-BB ocorreram no T4 (GT) e T5 (GC). No plasma não houve alteração nas concentrações desses fatores em relação ao T0, o que sugere que o PRP não acarreta efeito sistêmico, quando os procedimentos adotados na presente pesquisa são utilizados. A administração local de PRP no volume estudado, 12 h após indução cirúrgica de ferida cutânea na região glútea de equinos não ocasiona maiores concentrações dos fatores de crescimento TGF-β1 e PDGF-BB no plasma sanguíneo e pele, durante o processo de cicatrização.

Babesia bovis: expression of adhesion molecules in bovine umbilical endothelial cells stimulated with plasma from infected cattle

Ten male, 12-month-old Jersey with intact spleens, serologically and parasitologically free from Babesia were housed individually in an arthropod-free isolation system from birth and throughout entire experiment. The animals were randomly divided into two groups. Five animals (group A) were intravenously inoculated with 6.6 X10(7) red blood cells parasitized with pathogenic sample of Babesia bovis (passage 7 BboUFV-1), for the subsequent "ex vivo" determination of the expression of adhesion molecules. Five non-inoculated animals (group B) were used as the negative control. The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM, PECAM-1 E-selectin and thrombospondin (TSP) was measured in bovine umbilical vein endothelial cells (BUVECs). The endothelial cells stimulated with a pool of plasma from animals infected with the BboUFV-1 7th passage sample had a much more intense immunostaining of ICAM-1, VCAM, PECAM-1 E-selectin and TSP, compared to the cells which did not received the stimulus. The results suggest that proinflammatory cytokines released in the acute phase of babesiosis may be involved in the expression of adhesion molecules thereby implicating them in the pathophysiology of babesiosis caused by B. bovis.

Padronização de técnica manual para obtenção de plasma rico em plaquetas de bovino

Resumo: Para padronização de uma técnica manual para a obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP) autólogo em bovinos com custo reduzido (método manual) e de boa qualidade (capacidade de concentrar plaquetas, alta concentração de fatores de crescimento e contaminação reduzida com leucócitos e eritrócitos), que poderá ser utilizado como um agente modulador da resposta imune de vacas com diferentes enfermidades, 450 ml de sangue total de nove vacas clinicamente saudáveis e com perfil hematológico normal foi coletado em bolsas de sangue CPDA-1 e processado dentro de quatro horas após a coleta. O sangue foi separado em alíquotas para avaliar 8 protocolos (P) de centrifugação dupla que variaram quanto a velocidade e o tempo de centrifugação. A contagem de plaquetas, eritrócitos e leucócitos na suspensão obtida (PRP) foi realizada pelo método manual em câmara de Neubauer: P5 (400g e 800g ambos durante 10 min) foi o protocolo com maior número de plaquetas, seguido por P3 (120g e 473g ambos durante 10 min), P4 (300g e 640g durante 10 min cada), P6 (640g durante 10 min e 640g durante 5 min), P8 (640g durante 5 min e 120g durante 10 min) e P7 (720g e 720g durante 5 min) e diferentes (p<0,05) dos menores valores encontrados em P1 (120g e 240g, ambos por 5 minutos) e P2 (120g e 473g ambos por 5 min). Em relação aos eritrócitos, P8, P7, P6, P5 e P4 apresentaram menores concentrações e maiores valores (p<0,05) foram observados em P3 e P2. Menores quantidades de leucócitos foram observadas em P5, P6, P8 e P7 com o maior valor obtido em P2 (p<0,05). Todos os protocolos (P1 a P8) foram eficientes em concentrar plaquetas sendo o valor mais baixo (3,65±0,79) observado em P1. Em relação aos fatores de crescimento ao se mensurar TGF- 1, os protocolos P1 e P8 evidenciaram valores mais elevados. De acordo com os resultados obtidos os protocolos P5 e P8 apresentaram os melhores resultados para confecção de PRP bovino.

Clinical, hematological, total plasma protein and fibrinogen parameters of magellanic penguins ( Spheniscus magellanicus ) pre- and post-rehabilitation

Abstract: Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) usually arrive in poor body conditions at Brazilian beaches during the winter. Hematology provides valuable information about clinical and immunity status of the animals. The aims of this study were to determine the hematologic, total plasma protein (TPP) and fibrinogen profiles of young and adult magellanic penguins in PROAMAR and CETAS-SC, relating these results with the state of health and survival possibility of the animals. In Paraná 14 animals were evaluated in pre and eight in post-rehabilitation and 29 animals were evaluated in Santa Catarina after rehabilitation. Before rehabilitation, all animals showed weakness. In hematological exams of these animals, we found that anemia was present in 83% of the penguins that died and 50% of those which survived. The heterophils/lymphocytes (H/L) ratio was 3.87±0.57 in animals that died, significantly higher than the average of 2.20±0.30 for animals that survived. These two parameters are useful to assess the survival possibility of animals to rehabilitation. The body condition score was positively correlated with hematocrit and TPP, and negatively correlated with H/L ratio. After rehabilitation, the values were similar to other animals of the family Spheniscidae, with averages ranging from 1.64 to 1.90x106 erythrocytes/μL; 43.38 to 48.80% of hematocrit; 12.45 to 13.52g/dL of hemoglobin; 8,684 to 14,011 leukocytes/μL; 4,767 to 8,041 heterophils/μL; 3,215 to 4,951 lymphocytes/μL; 95 to 655 eosinophils/μl; 179.8 to 277.9 monocytes/μL; 141 to 184.9 basophils/μL; and 1.26 to 1.74 of H/L ratio. These parameters can therefore be used as reference values and release parameters for young and adult Magellanic penguins in captivity on the rehabilitation centers.

Relation between the level of self-mutilation and theconcentration of fecal metabolites of glucocorticoids incaptive chimpanzees (Pan troglodytes)

The influence of stress in an environment, according with the behavioral and endocrine variables of primates, are increasingly being studied by a diversity of authors, and have shown that abnormal behaviors associated with increased glucocorticoids may be directly related with the impairment of their well-being. In this work were used 22 adult chimpanzees (Pan troglodytes), 11 males and 11 females, kept in captivity in three different institutions. All animals had their behavior registered by focal session using a 30 seconds sample interval, during six months, totaling 4,800 registries per each animal. During this period, fecal samples were collected 3 times a week for the extraction and measurement of the concentration of fecal metabolites of glucocorticoid by radioimmunoassay. Of the total observed, stereotypical behaviors represented 13,45±2.76%, and among them, self-mutilation represented 38.28±3.98 %. The animals were classified into three different scores, according with the percentage of body surface with alopecia due to self-mutilation. It was found a positive correlation of high intensity between the scores of alopecia due to the observed mutilation and the average concentrations of fecal metabolites of glucocorticoids. This result strongly suggests that this measurement of self-mutilation in a chimpanzee can be used as an important auxiliary tool to evaluate de conditions of adaptation of an animal in captivity, functioning as a direct indicator of the presence of chronic stress.

Fecal cortisol metabolites as indicators of stress in crab-eating-fox (Cerdocyoun thous) in captivity

Abstract: Blood samples collection is a common method in biological research using domestic animals. However, most blood sampling techniques are complicated and highly invasive and may therefore not be appropriate for wildlife animals in research concerning stress. Thus, a non-invasive method to measure steroid hormones is critically needed. The first goal of this study was to determine how glucocorticoids concentrations are impacted by translocation and reproductive activity in crab-eating-fox (Cerdocyoun thous) in captivity. The physiological relevance of fecal glucocorticoid metabolites was further validated by demonstrating: (1) The translocation of a male to a females enclosure resulted in a 3.5-fold increase compared to baseline concentrations, (2) changes in adrenocortical activity, as reflected in concentrations of fecal cortisol metabolites during reproduction, gestation and lactation in females foxes, indicating that social interactions resulted in large increases of fecal glucocorticoids metabolites during the reproductive season. From these findings we conclude that fecal samples can be used for the non-invasive assessment of adrenocortical status in crab-eating-fox.

Method to obtain platelet-rich plasma from rabbits (Oryctolagus cuniculus )

Abstract: Platelet-rich plasma (PRP) is a product easy and inxpesnsive, and stands out to for its growth factors in tissue repair. To obtain PRP, centrifugation of whole blood is made with specific time and gravitational forces. Thus, the present work aimed to study a method of double centrifugation to obtain PRP in order to evaluate the effective increase of platelet concentration in the final product, the preparation of PRP gel, and to optimize preparation time of the final sample. Fifteen female White New Zealand rabbits underwent blood sampling for the preparation of PRP. Samples were separated in two sterile tubes containing sodium citrate. Tubes were submitted to the double centrifugation protocol, with lid closed and 1600 revolutions per minute (rpm) for 10 minutes, resulting in the separation of red blood cells, plasma with platelets and leucocytes. After were opened and plasma was pipetted and transferred into another sterile tube. Plasma was centrifuged again at 2000rpm for 10 minutes; as a result it was split into two parts: on the top, consisting of platelet-poor plasma (PPP) and at the bottom of the platelet button. Part of the PPP was discarded so that only 1ml remained in the tube along with the platelet button. This material was gently agitated to promote platelets resuspension and activated when added 0.3ml of calcium gluconate, resulting in PRP gel. Double centrifugation protocol was able to make platelet concentration 3 times higher in relation to the initial blood sample. The volume of calcium gluconate used for platelet activation was 0.3ml, and was sufficient to coagulate the sample. Coagulation time ranged from 8 to 20 minutes, with an average of 17.6 minutes. Therefore, time of blood centrifugation until to obtain PRP gel took only 40 minutes. It was concluded that PRP was successfully obtained by double centrifugation protocol, which is able to increase the platelet concentration in the sample compared with whole blood, allowing its use in surgical procedures. Furthermore, the preparation time is appropriate to obtain PRP in just 40 minutes, and calcium gluconate is able to promote the activation of platelets.

Utilização de plasma rico em plaquetas para estimulação da angiogênese em flape de padrão axial toracodorsal em coelhos (Oryctolagus cuniculus)

Resumo: Feridas de grandes extensões, com perda da viabilidade tecidual e retardo na cicatrização por segunda intenção são casos que se faz necessário o emprego de técnicas cirúrgicas reconstrutivas. O plasma rico em plaquetas (PRP) é um produto com maior concentração plaquetária, adjuvante no processo cicatricial de cirurgias reconstrutivas, auxiliando nos processos de hemostasia e estimulação da angiogênese. Dessa forma, delineou-se um estudo a fim de avaliar a eficácia do uso do gel produzido a partir do plasma rico em plaquetas (PRP) em flapes de avanço de padrão axial toracodorsal em coelhos, para avaliar a possibilidade de favorecer a integração do retalho no leito receptor. Utilizaram-se 30 coelhos da raça Nova Zelândia branco, separados em dois grupos de 15 animais, compreendendo os grupos plasma rico em plaquetas (GPRP), na qual empregou-se o gel antes da síntese da ferida cirúrgica, e controle (GC), na qual utilizou-se apenas solução fisiológica. Para obtenção do PRP, coletou-se sangue dos animais, e determinou-se a contagem plaquetária antes da preparação do gel. No início e término do experimento os animais foram pesados para posterior análise de ganho peso médio. Após o procedimento cirúrgico iniciou-se as avaliações macroscópicas no 3º, 7º e 14º dia, e avaliou-se presença ou ausência de exsudato, integridade da pele, edema, rubor e necrose. Após esta etapa, coletou-se o material da ferida cirúrgica para confecção das lâminas histológicas e posterior avaliação microscópica. Avaliou-se a proliferação vascular, presença de células mononucleares e polimorfonucleares, proliferação fibroblástica, colagenização, reepitelização e hemorragia. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística (Teste t Student, t emparalhado, e Kruskall Walis, sendo p<0,05). O ganho de peso médio não foi significativo entre os grupos; a concentração plaquetária da amostra final do PRP foi significativamente maior quando comparada com a inicial; exsudato e necrose foram significativamente maior no grupo controle quando comparado ao grupo PRP; proliferação vascular e reepitelização foram significativamente maior no grupo PRP, enquanto que a presença de mononucleares, polimorfonucleares, proliferação de fibroblastos, colagenização e hemorragia não foram significativas entre os grupos. Obteve-se no terceiro dia, diferença significativamente maior quanto à variável exsudato no grupo controle quando comparado ao grupo PRP, no sétimo dia exsudato e rubor foram significativamente maior no grupo controle, e ao décimo quarto dia exsudato e integridade da pele foram significativamente maior no grupo controle. Os resultados obtidos neste estudo evidenciaram que a utilização do plasma rico em plaquetas na forma de gel em cirurgia reconstrutiva foi capaz de estimular a angiogênese na ferida favorecendo o processo de cicatrização.

Comparative allelopathic potential of metabolites of two Alternanthera species against germination and seedling growth of rice

A laboratory study was conducted to investigate the allelopathic effect of aqueous extracts of plant parts of Alternanthera philoxeroides and A. sessilis and soil incorporated residues on germination and seedling growth of rice (Oryza sativa). Aqueous extracts prepared from different plant parts of Alternanthera species delayed rice germination. Alternanthera philoxeroides and A. sessilis inhibited rice germination by 9-100% and 4-49%, respectively. Germination of rice seeds was reduced with increasing concentration of aqueous leaf extracts of both weed species. Early seedling growth (root and shoot lengths) and seedling vigor index were significantly reduced by 5% aqueous leaf extract compared with distilled water treated control. Germination, root and shoot lengths, root and shoot dry weights and seedling vigor index of rice were drastically reduced by 3 and 4% in residue infested soil compared with residue free soil. The inhibitory effect of A. philoxeroides in terms of germination and seedling growth of rice was greater than that of A. sessilis. Five percent aqueous leaf extract and 4% residue infested soil of A. philoxeroides caused complete failure of rice seed germination. Alternanthera philoxeroides contained water soluble phenolics, namely 4 hydroxy-3-methoxy benzoic acid (16.19 mg L-1) and m-coumaric acid (1.48 mg L-1), whereas Alternanthera sessilis was rich in chlorogenic acid (17.85 mg L-1), gallic acid (11.03 mg L-1) and vanillic acid (9.88 mg L-1). The study indicates that the allelopathic potential of Alternanthera species may play an important role in enhancing the invasiveness of these species and may suppress rice plants in the vicinity.

Chromosome damage in underground coal miners: detection by conventional cytogenetic techniques and by submitting lymphocytes of unexposed individuals to plasma from at-risk groups

Chromosome abnormalities and the mitotic index in lymphocyte cultures and micronuclei in buccal mucosa cells were investigated in a sample of underground mineral coal miners from Southern Brazil. A decreased mitotic index, an excess of micronuclei and a higher frequency of chromosome abnormalities (fragments, polyploidy and overall chromosome alterations) were observed in the miners when compared to age-paired normal controls from the same area. An alternative assay for clastogenesis in occupational exposition was tested by submitting lymphocytes from non-exposed individuals to a pool of plasmas from the exposed population. This assay proved to be very convenient, as the lymphocytes obtained from the same individuals can be used as target as well as control cells. Also, it yielded a larger number of metaphases and of successful cultures than with common lymphocyte cultures from miners. A significantly higher frequency of chromatid gaps, fragments and overall alterations were observed when lymphocytes from control subjects were exposed to miner plasma pools. Control plasma pools did not significantly induce any type of chromosome alterations in the cultures of normal subjects, thus indicating that the results are not due to the effect of the addition of plasma pools per se.

In vitro and in vivo studies demonstrate non-mutagenicity of the herbicide metolachlor

The herbicide metolachlor was evaluated for genotoxic potential. Metolachlor did not induce micronuclei in mice, however at 40 mg/kg it significantly decreased the percentage of polychromatic erythrocytes, which is a cytotoxic effect. Metolachlor did not induce chromosomal aberrations in human lymphocytes in vitro, but 2.0 mug/ml culture medium resulted in cytotoxicity, decreasing the mitotic index significantly. The indirect exposure test was carried out by adding plasma from metolachlor-pretreated rats to the human lymphocyte cultures. There was no indication of clastogenicity by metolachlor metabolites. On the other hand, plasma of cyclophosphamide-pretreated rats had a significant clastogenic effect

Correlations between ANP concentrations in atria, plasma and cerebral structures and sodium chloride preference in Wistar rats

We determined whether ANP (atrial natriuretic peptide) concentrations, measured by radioimmunoassay, in the ANPergic cerebral regions involved in regulation of sodium intake and excretion and pituitary gland correlated with differences in sodium preference among 40 Wistar male rats (180-220 g). Sodium preference was measured as mean spontaneous ingestion of 1.5% NaCl solution during a test period of 12 days. The relevant tissues included the olfactory bulb (OB), the posterior and anterior lobes of the pituitary gland (PP and AP, respectively), the median eminence (ME), the medial basal hypothalamus (MBH), and the region anteroventral to the third ventricle (AV3V). We also measured ANP content in the right (RA) and left atrium (LA) and plasma. The concentrations of ANP in the OB and the AP were correlated with sodium ingestion during the preceding 24 h, since an increase of ANP in these structures was associated with a reduced ingestion and vice-versa (OB: r = -0.3649, P<0.05; AP: r = -0.3291, P<0.05). Moreover, the AP exhibited a correlation between ANP concentration and mean NaCl intake (r = -0.4165, P<0.05), but this was not the case for the OB (r = 0.2422). This suggests that differences in sodium preference among individual male rats can be related to variations of AP ANP level. Earlier studies indicated that the OB is involved in the control of NaCl ingestion. Our data suggest that the OB ANP level may play a role mainly in day-to-day variations of sodium ingestion in the individual rat