Desenvolvimento e avaliação de novas estratégias de imunização contra colibacilose suína

Colibacilose suína causada por Escherichia coli enterotoxigênica continua sendo um dos principais problemas sanitários na criação de suínos. A tecnologia do DNA recombinante proporciona a possibilidade de desenvolvimento de novas estratégias de imunização. Neste trabalho é descrito o desenvolvimento de uma vacina de subunidade através da produção e purificação da proteína FaeC da fímbria de E. coli K88. O gene que codifica este antígeno foi amplificado por PCR e clonado em um vetor de expressão em E. coli, fusionado a uma cauda de histidinas. A proteína recombinante expressa por esta bactéria foi purificada, e depois de quantificada foi utilizada para imunizar camundongos. Paralelamente a isso, o mesmo gene foi clonado no vetor de expressão em célula eucariótica, introduzindo a seqüência de Kozak para favorecer a tradução deste gene em células musculares. O plasmídio resultante, denominado pUP310, foi produzido em larga escala e também utilizado na imunização de camundongos. A resposta imune induzida por ambas formas de imunizações foi monitorada por ELISA, onde o antígeno utilizado foi a proteína FaeC purificada. Houve indução de resposta imune nos camundongos inoculados com pUP310 e FaeC purificada. Foi possível detectar anticorpos anti-FaeC 42 dias após a primeira inoculação e este título foi aumentando, sendo ainda detectável 7 meses após a primeira inoculação. Conclui-se que pUP310 e FaeC recombinante são candidatos potenciais para imunização de suínos contra E. coli K88.

Teste intradérmico com proteínas recombinantes de Mycobacterium bovis como antígenos em Cavia porcellus

O teste intradérmico para o diagnóstico da tuberculose bovina utiliza derivados proteicos purificados (PPD) de Mycobacterium bovis que são capazes de induzir reações de hipersensibilidade em animais infectados. No entanto, apresenta baixa especificidade devido à ocorrência de reações cruzadas com outras micobactérias. Neste sentido, o objetivo desse trabalho foi produzir proteínas recombinantes (ESAT-6, PE13, PE5 e ESX-1) de Mycobacterium bovis e avaliá-las como antígenos em teste intradérmico utilizando Cavia porcellus como modelo, e verificar se as condições empregadas na purificação (nativa ou desnaturante) interferem no desempenho antigênico dessas proteínas. As proteínas foram testadas em Cavia porcellus previamente sensibilizados com cepa M. bovis AN5 inativada, individualmente (160 µg) ou combinadas na forma de um coquetel (40 µg cada). O coquetel de proteínas induziu reações de hipersensibilidade nos animais sensibilizados significativamente superiores (p=0,002) as observadas nos animais não sensibilizados, possibilitando diferenciação. No entanto, as proteínas isoladamente não foram capazes de promover essa diferenciação. As condições de solubilização e purificação influenciaram o desempenho antigênico da proteína ESAT-6, pois, quando produzida em condição desnaturante desencadeou reações inespecíficas nos animais não sensibilizados, enquanto que aquela produzida em condições nativas e aplicada em concentrações de 6, 12, 24 e 48µg induziu reações significativas apenas nos animais sensibilizados, confirmando o seu potencial como antígeno.

Atividade da acetolactato sintase de plantas de milho e de amendoim-bravo (Euphorbia heterophylla) resistentes e suscetíveis ao imazaquin

O amendoim-bravo, (Euphorbia heterophylla) é uma importante planta daninha em mais de 56 países, inclusive no Brasil, onde tem sido relatado o aparecimento de populações resistentes aos herbicidas inibidores da acetolactato sintase (ALS). O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do herbicida imazaquin na atividade da ALS extraída das plantas de milho e amendoim-bravo, resistentes e suscetíveis ao produto. Sementes de dois genótipos de milho e vários biótipos de amendoim-bravo provenientes de diferentes regiões agrícolas brasileiras foram cultivadas em casa de vegetação por 21 dias. A atividade da ALS extraída das folhas das plantas foi determinada na presença de doses de imazaquin. A etapa de purificação da enzima foi substituída por uma centrifugação de 2.800 rpm por dois minutos. Equações de regressão linear para absorbância em função do log da concentração de imazaquin foram ajustadas para cada população, visando obtenção do I50. A dose de imazaquin necessária para inibir 50% da atividade da ALS (I50) na variedade de milho Pioneer 3162 IR (I50 260 µM) foi 4.333 vezes maior que a dose requerida pela BRS 473 (0,06 µM), a qual é suscetível ao imazaquin. Os biótipos de amendoim-bravo provenientes do Rio Grande do Sul apresentaram valores de I50 de 1.961,3 e 13,8 mM para os biótipos resistentes e suscetíveis, respectivamente. Os biótipos provenientes de Cafelândia e Maringá (PR) e Viçosa (MG) apresentaram valores de I50 maiores que 5.000 mM para os biótipos resistentes e maiores que 1.000 mM para os suscetíveis. O amendoim-bravo coletado na Embrapa Milho e Sorgo, em área que nunca foi tratada com herbicidas inibidores da ALS, apresentou I50 de 12,2 mM. Conclui-se que a medida in vitro da atividade da ALS é um método sensível para determinação da presença de biótipos resistentes à ação do herbicida imazaquin. A etapa de purificação da ALS pode ser substituída por um método que envolve uma rápida centrifugação.

Sistemas primários de transporte de prótons integram os mecanismos de desintoxicação do mesotrione em plantas de milho

O mesotrione é um dos mais efetivos herbicidas desenvolvidos para o controle de uma ampla gama de plantas daninhas que infestam campos de milho (Zea mays). Todavia, as bases bioquímicas e moleculares da tolerância das plantas de milho a esse herbicida ainda não foram estabelecidas. Para compreender os mecanismos de desintoxicação do mesotrione em plantas de milho, foram analisadas as atividades dos principais sistemas primários de transporte de prótons (íons H+) das membranas plasmática e vacuolar (H+-ATPases do tipo P e V e H+-PPases) de células de diferentes tecidos de plantas tratadas após aplicação do herbicida em pós-emergência. Para isso, foram realizados procedimentos de fracionamento celular, de tecidos radiculares, foliares e do caule, por centrifugação diferencial e purificação de vesículas membranares em gradiente de densidade de sacarose. Os ensaios enzimáticos das atividades hidrolíticas das três bombas de H+ foram realizados aplicando-se um método colorimétrico para medir o fosfato liberado das hidrólises dos substratos: adenosina-5'-trifosfato (ATP) e pirofosfato (PPi). Parâmetros fotossintéticos foram analisados como marcadores fisiológicos dos diferentes estádios da desintoxicação das plantas. Essa análise demonstrou que o tratamento com mesotrione promoveu uma redução na taxa fotossintética e na relação Fv/Fm no terceiro dia após aplicação (DAA), mas não afetou significativamente a fotossíntese a partir do quinto DAA. Nos três tecidos analisados, raiz, folha e caule, aos 3 DAA, foi observado forte estímulo da atividade da H+-PPase vacuolar, a qual variou de cerca de 100 a 600%. Essa forte ativação foi reduzida significativamente aos 7 DAA, mas permaneceu pelo menos duas vezes maior com relação ao controle. Por sua vez, as H+-ATPases das membranas plasmática e vacuolar foram bem menos moduladas pelo tratamento com o herbicida, apresentando estimulações e inibições que não variaram mais do que 20 a 60% das atividades obtidas em vesículas de membranas oriundas de plantas não tratadas (controle). Os resultados demonstraram que o mesotrione promove uma ativação diferencial dos principais sistemas primários de transporte de H+, indicando que essas bombas iônicas são enzimas transportadoras essenciais aos mecanismos relacionados com o processo de desintoxicação das plantas de milho, possivelmente ao energizar a compartimentalização das moléculas do herbicida mesotrione no vacúolo ou a exceção celular através das membranas plasmáticas.

Quantificação de sorgoleone em extratos e raízes de sorgo sob diferentes períodos de armazenamento

Neste trabalho, foi realizada a purificação, a obtenção do padrão de sorgoleone (2 - hidroxi - 5 - metoxi - 3 - [(8'Z,11'Z)-8',11',14'-pentadecatrieno]-p-benzoquinona) e a quantificação desse marcador em raízes primárias de sorgo. As sementes de sorgo foram desinfectadas, colocadas em placas gerbox opacas e acondicionadas em câmara de germinação a 30 ºC durante sete dias no escuro. Posteriormente, a extração foi feita mergulhando-se as raízes por 5 min em solução de ácido acético glacial em diclorometano 0,0025% v/v. A quantificação de sorgoleone nos extratos obtidos foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), utilizando-se uma curva de calibração. Foi avaliado o efeito do armazenamento de extratos e de raízes, utilizando-se três repetições para cada tratamento. Os extratos de raízes recém-coletadas foram armazenados a -20 ºC por 0, 1, 3, 5, 7, 14 e 21 dias. As raízes foram coletadas e imediatamente congeladas (20 ºC) e armazenadas pelo mesmo período, quando foram submetidas à extração. Não foi observada diferença significativa entre a quantidade de sorgoleone em extratos armazenados e a de não armazenados, sendo observado o mesmo resultado em extratos obtidos de raízes frescas e armazenadas. Os resultados obtidos mostram que o armazenamento por até 21 dias não altera o conteúdo de sorgoleone nos extratos.

Isolamento de oligossacarídeos de xiloglucano de dicotiledôneas através de hidrólise enzimática e cromatografia de exclusão molecular

Oligossacarídeos derivados do xiloglucano, um polissacarídeo constituinte da parede celular vegetal, vêm sendo considerados como moléculas capazes de sinalizar e/ou regular eventos relacionados ao crescimento e à expansão celular. A purificação desses oligossacarídeos é imprescindível para a realização de ensaios relativos à sua atividade biológica. Neste trabalho, xiloglucanos foram extraídos a partir de sementes de copaíba (Copaifera langsdorffii Desf.) e suspensões celulares de feijão (Phaseolus vulgaris L.) e hidrolisados com celulase (endo-glucanase) para obtenção dos oligossacarídeos de xiloglucano, os OXGs. Os resultados obtidos mostram que a técnica de cromatografia dupla em gel de exclusão molecular foi eficiente para purificação dos oligossacarídeos, apresentando OXGs dos tipos XLLG e XXXG com grau de pureza próximo a 90%, e do tipo XXFG próximo de 80%.

Toca de Assis em crise: uma análise dos discursos dos que permaneceram na comunidade

Fundada em 1994 em Campinas, a "Toca de Assis" se destacava como grupo católico que atraía jovens para uma vida de pobreza radical, consagrada à adoração do Santíssimo Sacramento e ao cuidado com a população de rua. Em 2009, o líder-fundador, Pe. Roberto Lettieri, é afastado e uma crise se instala com a saída da maioria dos membros. Realizado em 2010-11 numa casa masculina, esse estudo analisa os discursos dos membros remanescentes buscando identificar os sentidos atribuídos à referida crise. Valorizando a Igreja Católica, os entrevistados confiam nas decisões de sua hierarquia e acionam os conceitos de "maturidade", "humildade", "Providência Divina" e "purificação" para dar coerência às mudanças identificando nelas continuidade a proposta inicial do próprio fundador.

O corrência natural de desoxinivalenol e toxina T-2 em milho pós-colheita

Foi verificada a incidência natural de desoxinivalenol (DON) e toxina T-2 em 115 amostras de milho em grão, pós-colheita, procedentes de diferentes localidades do Brasil, Argentina e Paraguai, safra 1994/1995. Os grãos de milho foram obtidos da Associação Brasileira de Milho. DON foi extraído do grão com acetonitrila-água (84+16) e o extrato foi submetido a uma purificação em coluna de carvão ativo, alumina e Celite. A detecção foi feita por cromatografia em camada delgada, impregnando a placa com solução de cloreto de alumínio, aquecida após desenvolvimento e visualização em luz ultravioleta (366 nm). Para a toxina T-2, um método direto e competitivo de ELISA foi utilizado, após extração da amostra com metanol a 70%. As recuperações médias para o DON e toxina T-2 foram superiores a 70%. O limite de detecção foi cerca de 90 ng/g e 50 ng/g, para DON e toxina T-2, respectivamente. DON foi detectado em 7 das amostras (102-542 ng/g) e a toxina T-2 em uma amostra (104 ng/g).

Benzo(a)pireno em óleos de milho produzidos e comercializados no Brasil

Óleos de milho de diferentes marcas, produzidos e comercializados no Brasil, foram analisados quanto à presença de benzo(a)pireno (B(a)P). A metodologia utilizada envolveu extração com ciclohexano, purificação em coluna de silica gel e determinação por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência. Todas amostras analisadas mostraram-se contaminadas por B(a)P e os níveis determinados variaram entre as diferentes marcas analisadas e entre diferentes lotes de mesma marca, dentro da faixa de 0,85 a 25,17 µg/kg. Entre 49 amostras analisadas no período de dois anos, apenas uma apresentou nível de contaminação por B(a)P abaixo do limite referencial de 1 µg/kg.

Ocorrência de aflatoxina M1 em leite consumido na cidade de Belo Horizonte - Minas Gerais / Brasil - agosto/98 à abril/99

Foi verificada a incidência de aflatoxina M1 (AFM1) em 61 amostras de leite coletadas em Belo Horizonte / Minas Gerais - Brasil, no período de Agosto/ 98 - Abril/ 99. A quantificação foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) usando coluna de imunoafinidade como técnica de purificação. O limite de quantificação observado foi 6ng/L. As recuperações médias e coeficientes de variação foram superiores a 88,9% e inferiores a 22,4%, respectivamente. AFM1 foi encontrada em 50 (82%) das amostras analisadas, mas em níveis inferiores a 500ng/L, que é o limite máximo permitido no Brasil.

Identificação e quantificação das antocianinas do fruto do açaizeiro (Euterpe oleracea) Mart

Do extrato aquoso, congelado e liofilizado dos frutos do açaizeiro, foram extraídas as antocianinas e após purificação e separação das duas principais frações as mesmas foram identificadas usando métodos químicos, espectroscópicos e CLAE. As antocianinas foram identificadas como cianidina-3- arabinosídeo e cianidina-3-arabinosil-arabinosídeo. O teor de antocianinas totais no caso do fruto do açaizeiro foi determinado e o valor encontrado foi de 263mg/100g casca.

Determinação de resíduos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina em tecidos de origem animal

Foi padronizado e validado um método analítico para determinação de resíduos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina em tecido muscular empregando-se extração com acetonitrila, purificação com cartuchos de sílica e C18 e detecção e quantificação por CLAE/UV. Nos ensaios com amostras fortificadas entre 5 e 200mg/kg as recuperações médias obtidas variaram de 73,6 a 95,6% com valores de C.V. entre 4,8 e 26,4%. O limite de detecção e quantificação do método foi de 5mg/kg, para cada um dos três resíduos estudados.

Determinação de resíduos de avermectinas em fígado bovino por cromatografia líquida de alta eficiência

Foi padronizado e validado um método analítico para determinação de resíduos de abamectin, doramectin e ivermectin em fígado bovino empregando extração com acetonitrila, purificação com cartucho de C18 , derivatização, detecção e quantificação por CLAE/FL. Nos ensaios com amostras adicionadas de solução padrão em níveis entre 5 e 100mg/kg as recuperações médias obtidas variaram de 69,0 a 101,4% com valores de coeficiente de variação entre 5,5 e 28,1%. O limite de detecção e quantificação do método, para os três resíduos estudados, foi 5µg/kg.

Validação intralaboratorial de método para determinação de aflatoxina M1 em leite por cromatografia em camada delgada

Um método para determinação de aflatoxina M1 em leite empregando cromatografia em camada delgada foi otimizado e validado por procedimentos intralaboratoriais. Foram realizados testes para otimização das etapas de extração, purificação, detecção e quantificação por análise visual e densitométrica. Para validação do método foram realizados ensaios de recuperação com soluções padrões e amostras artificialmente contaminadas em níveis entre 0,027µg/L e 0,970µg/L. Foram avaliados linearidade, especificidade, exatidão, precisão, limites de detecção e quantificação. Os valores de porcentagem de recuperação na faixa de quantificação do método variaram de 84,2% a 99,0% na análise visual e de 85,2% a 105,2% na análise densitométrica, com coeficientes de variação de 2,3% a 9,8% e de 3,6% a 13,9%, respectivamente. O limite de detecção foi de 0,036µg/L e o de quantificação de 0,045µg/L, contemplando os níveis de tolerância estabelecidos na legislação nacional e internacional para aflatoxina M1 em leite.

Obtenção de cristais de licopeno a partir de descarte de tomate

As pesquisas com licopeno têm sido intensificadas uma vez que o consumo de alimentos ricos neste caroteno, como tomate e seus produtos, tem sido associado com o menor risco de desenvolvimento de câncer de próstata. Os objetivos deste trabalho foram (1) desenvolver e otimizar um método para extração de licopeno a partir de descarte de tomate, (2) utilizar este método na obtenção de licopeno a partir de diferentes coletas de tomate, (3) obter cristais de licopeno puro e (4) acompanhar o processo de purificação de licopeno por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna C30. O método desenvolvido e otimizado através de planejamento experimental fatorial para a obtenção de licopeno consistiu de uma etapa preliminar para retirada de água do tomate, com 4 extrações de 30 minutos, cada uma com 30mL de etanol, seguido por 4 extrações de 120 minutos com acetato de etila e relação massa/volume de 1:0,7. O teor de carotenóides médio (calculado como licopeno) obtido de 6 lotes de tomate foi de 59,2 ± 21,8µg/g. Através de duas cristalizações sucessivas obteve-se licopeno com 98% de pureza. A análise por CLAE mostrou a presença de traços dos isômeros 5-cis, 5-cis, 5'-cis- e 13-cis-licopeno no cristal de licopeno.