Caracterização de uma nova estirpe do Tomato mosaic virus isolada de tomateiro no Estado de São Paulo

Um vírus isolado em Guaratinguetá, SP, de tomateiro (Lycoporsicon esculentum) 'Santa Clara' com sintomas característicos de virose, foi estudado por meio de plantas indicadoras e de hospedeiras diferenciais pertencentes a linhagens homozigotas de tomateiro, ensaios de estabilidade in vitro, purificação, contrastação negativa, testes sorológicos de ELISA-PTA e imunomicroscopia eletrônica, utilizando-se anti-soros contra diferentes vírus do gênero Tobamovirus. O isolado infetou plantas de espécies de amarantáceas, quenopodiáceas e solanáceas. Plantas de Chenopodium amaranticolor reagiram com sintomas locais e sistêmicos; Nicotiana sylvestris e N. rustica reagiram com lesões locais e a linhagem homozigota de tomateiro Tm-2 mostrou-se imune ao vírus. Nas preparações purificadas de contrastação negativa, foram observadas partículas rígidas e alongadas com cerca de 300 nm. O isolado foi identificado como um tobamovírus, com anti-soros contra o Tomato mosaic virus (ToMV) e Tobacco mosaic virus (TMV). As hospedeiras diferenciais indicaram se tratar de ToMV. Por meio de RT-PCR, com oligonucleotídeos para o gene da capa protéica de espécies do gênero Tobamovirus do subgrupo 1, amplificaram-se fragmentos com 850 pb que foram clonados e seqüenciados. A similaridade de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos variou entre 85 e 91% quando a seqüência do ToMV-SP foi comparada com outras sequências de ToMV, 75 e 83% quando comparada com as do TMV e 67 e 72% quando comparada com a do Odontoglossum ringspot virus (ORSV). As comparações com outras espécies de tobamovírus apresentaram valores de similaridade inferiores a 65%. Confirmou-se a identidade dos vírus como sendo uma nova estirpe do ToMV.

Expressão em Escherichia coli da proteína capsidial do Watermelon mosaic virus e produção de anti-soro

Um anti-soro policlonal específico para Watermelon mosaic virus (WMV) foi produzido por meio da imunização de coelhos com proteína capsidial purificada, expressa in vitro em células de Escherichia coli. O gene cp foi amplificado via RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos, a partir de RNA viral extraído de preparações virais concentradas. O fragmento amplificado foi clonado em pBLUESCRIPT KS+ e completamente seqüenciado para confirmação de sua identidade e integridade. Em seguida, o fragmento foi subclonado no vetor de expressão pRSET-A. Plasmídeos recombinantes foram utilizados para a expressão da proteína capsidial em E. coli BL21::DE3. A proteína foi purificada por meio de cromatografia de afinidade em coluna de Ni+-NTA, a partir de proteínas totais extraídas de E. coli. Uma vez purificada, a proteína foi quantificada e utilizada para imunização dos coelhos. O anti-soro foi testado quanto a sua especificidade e sensibilidade em testes de Western blot, DAS-ELISA, imunodifusão e ELISA indireto. Todos os testes demonstraram que o anti-soro produzido a partir da expressão in vitro da proteína capsidial é altamente específico para a detecção do WMV em extratos foliares, não tendo sido observada nenhuma reação heteróloga interespecífica.

Caracterização da região 5'-terminal de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

O presente trabalho caracteriza a região 5'-terminal de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar cerca de 590 nt da região 5'-terminal do RNA viral. Foi obtido um fragmento de tamanho esperado que, após clonagem e seqüenciamento, mostrou a existência de uma região não codificadora com 92 nt e a primeira ORF, começando no primeiro AUG (posição 93) e terminando no códon UGA na posição 534. Na região não codificadora foi detectado um segmento parcialmente complementar ao RNA ribossomal 18S. A ORF1 codifica uma proteína de 147 aminoácidos com massa molecular estimada de 17080 Da. A extremidade 3' da ORF1 sobrepõe a extremidade 5' da ORF2 em 34 nucleotídeos. Os resultados obtidos indicam que a região 5'-terminal do RNA do SBMV-SP é similar ao isolado Arkansas (SBMV-ARK) descrito na América do Norte.

Distinct features of Pepper yellow mosaic virus isolates from tomato and sweetpepper

Determination of virus diversity in the field is vital to support a sustainable breeding program for virus resistance of horticultural crops. The present study aimed to characterize four field potyvirus isolates found naturally infecting sweet pepper (Capsicum annuum) (Sa66 and Sa115) and tomato (Lycopersicon esculentum) (IAC3 and Sa21) plants. Their biological characteristics revealed differences among the isolates in their ability to infect distinct Capsicum spp. and tomato genotypes, and in the severity of symptoms caused by these isolates compared to the infection caused by an isolate of Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Absence of cross-reaction was found among the studied isolates with antiserum against Potato virus Y (PVY). However, all isolates reacted, at different intensities, with antiserum against PepYMV. All isolates showed high identity percentage (97 to 99%) of the amino acid sequence of the coat protein with PepYMV (accession AF348610) and low (69 to 80%) with other potyvirus species. The comparison of the 3' untranslated region also confirmed this finding with 97 to 98% identity with PepYMV, and of 47 to 71% with other potyviruses. The results showed that PepYMV isolates were easily differentiated from PVY by serology and that the host response of each isolate could be variable. In addition, the nucleotide sequence of the coat protein and 3' untranslated region was highly conserved among the isolates.

Identificação sorológica de espécies de potyvirus em melancia, no estado de Roraima

No período de maio de 2003 a março de 2004, foram coletadas amostras foliares de plantas de melancia (Citrullus lanatus) de 21 campos de cultivo de cucurbitáceas, no Estado de Roraima. As amostras exibiam diferentes sintomas de vírus e foram levadas para o Laboratório de Virologia Vegetal da Universidade Federal do Ceará para serem testadas por "enzyme linked immunosorbent assay" (Elisa)-indireto, contra anti-soros específicos para Cucumber mosaic virus (CMV), Papaya ringspot virus estirpe melancia (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). Nos testes de Elisa, utilizou-se o conjugado universal, anti-imunoglobulina (IgG) de coelho produzida em cabra conjugada à enzima fosfatase alcalina. Todas as amostras foram testadas, também, por dupla difusão contra o anti-soro para Squash mosaic virus (SqMV). Os resultados indicaram a presença do PRSV-W em 84,2% das amostras coletadas em maio de 2003, em 7,1% das amostras coletadas em dezembro de 2003 e em 55,6% das amostras coletadas em março de 2004. A presença do ZYMV foi observada em 10,5% das amostras coletadas em maio de 2003, 21,4% das amostras coletadas em dezembro de 2003 e em 25,9% das amostras de março de 2004. O WMV foi detectado somente em oito das amostras coletadas em março de 2004 (29,6%). Os resultados desta pesquisa confirmam a ampla dispersão do PRSV-W em cultivos de cucurbitáceas no território brasileiro e a preocupante expansão do ZYMV em razão dos elevados prejuízos que o mesmo tem causado em outras partes do mundo.

Transgenic passionfruit expressing RNA derived from Cowpea aphid-borne mosaic virus is resistant to passionfruit woodiness disease

Sixteen transgenic yellow passionfruit (Passiflora spp.) plants (R0) were obtained which express a non-translatable transgenic RNA corresponding to the 3' region of the NIb gene and the 5' region of the CP gene, derived from the genome of a Brazilian isolate of Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV). The transgenic plants were propagated by stem cuttings and challenged by sap inoculation with isolates CABMV-MG1 and CABMV-PE1. One transgenic plant (TE5-10) was resistant to the isolate CABMV-MG1, but susceptible to CABMV-PE1. The remaining transgenic plants developed systemic symptoms, equal to non-transformed plants, when inoculated with either isolate. The absence of virus in TE5-10 plants was confirmed by indirect ELISA. Transcription analysis of the transgene demonstrated that the TE5-10 plant did not accumulate transgenic mRNA, even before inoculation. After inoculation, viral RNA was only detected in plants inoculated with CABMV-PE1. These results confirm that the transgenic plant TE5-10 is resistant to isolate CABMV-MG1, and suggest that the resistance mechanism is post-transcriptional gene silencing, which is already activated in the transgenic plants before virus inoculation.

Detecção do Southern bean mosaic virus no Paraná, e separação do Bean rugose mosaic virus em feijoeiro

Em lavouras de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) da cultivar Carioca Comum, no município de Londrina, Estado do Paraná, foram encontradas plantas com sintomas de necrose da haste, mosaico clorótico leve e porte reduzido, semelhantes aos sintomas causados por infecção viral. Exames de microscopia eletrônica revelaram a presença de partículas isométricas. Em testes de imunodifusão dupla em gel de ágar os extratos foliares de plantas infetadas reagiram positivamente com anti-soro específico para o Southern bean mosaic virus (SBMV). O vírus foi purificado e a massa molecular de sua proteína capsidial foi estimada em 30 kDa, valor esperado para proteínas do capsídeo de vírus do gênero Sobemovirus. A gama de hospedeiras do SBMV isolado no Paraná foi restrita ao feijoeiro e a algumas cultivares de soja (Glycine max). A separação de dois vírus isométricos comuns em infecções mistas no feijoeiro foi possível através da reação de imunidade ao SBMV apresentada por Crotalaria sp, Chenopodium quinoa e Mucuna deeringiana, e da reação de susceptibilidade dessas mesmas hospedeiras ao Bean rugose mosaic virus (BRMV).

Genes diferentes podem conferir resistência ao Cowpea severe mosaic virus em caupi

O caupi (Vigna unguiculata) é uma importante leguminosa cultivada principlamente por pequenos agricultores da região Nordeste. Doenças ocasionadas por vírus podem constituir o principal fator limitante da produção do caupi, destacando-se, nesse aspecto, o mosaico severo, causado pelo Cowpea severe mosaic virus (CpSMV), família Comoviridae, gênero Comovirus. A resistência tem sido considerada como a melhor alternativa no controle dessa virose e diversas fontes promissoras têm sido relatadas, como as cultivares Macaibo e CNC 0434, e a linhagem L254.008. As investigações sobre a base genética da resistência ao CpSMV nesses materiais têm conduzido a resultados semelhantes, sendo a resistência herdada como uma característica monogênica recessiva. No entanto, até então, nenhum trabalho havia investigado o alelismo dos genes de resistência dessas fontes. No presente trabalho foram realizados estudos visando esclarecer essa questão nas três fontes de resistência; 'Macaibo', 'CNC0434' e L254.008. Plantas dos referidos genótipos foram cruzadas de maneira direta e recíproca originando seis populações F1 e F2. Inoculações controladas dessas populações com o isolado CpSMV-Re1 permitiram concluir que o gene de resistência de 'Macaibo' é o mesmo de 'CNC-0434', distinto daquele encontrado na linhagem L254.008.

Seleção de progênies de feijoeiro F4 resistentes ao Bean golden mosaic virus

O objetivo deste trabalho foi identificar progênies de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) na geração F4 provenientes do cruzamento entre cultivares resistentes ao Bean golden mosaic virus (BGMV). Os parentais foram as cultivares Carioca-MG (suscetível) e IAPAR-57, IAPAR-72 e IAPAR-65 (resistentes). A população de 480 progênies foi obtida pelo modelo dialélico completo. Estas foram semeadas em campo sob inoculação natural e estudada ao nível de plantas individuais para cálculo do índice de doença de BGMV (I.D.) Em relação ao I.D. médio, as progênies foram mais resistentes do que seus parentais (2,62 e 2,87), respectivamente. O processo de seleção foi realizado pelo I.D. (sigmag² = 0,2729 e h a² = 0,3953), onde foram obtidas famílias com grãos do tipo carioca e com I.D. inferior aos parentais resistentes. Segundo o GS% estimado, não serão necessárias muitas progênies ou famílias para se obter progresso com seleção para BGMV. O genótipo IAPAR-72 foi o parental superior na obtenção de progênies de maior resistência (menores I.D.). Possivelmente o mecanismo de resistência é do tipo resistência parcial.

Seleção de acessos e progênies de Citrullus spp. para resistência a três potyvirus

Visando selecionar acessos e progênies de melancia (Citrullus spp.) como fontes de resistência aos potyvirus: Papaya ringspot virus tipo watermelon (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), oito genótipos foram avaliados, sendo seis dos acessos (87-019, 87-029, 91-080, PI-244018, 91-043 e PI-195927) e dois do acesso PI-244019 (PI-244019A e PI-244019B) do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de cucurbitáceas do Nordeste brasileiro, da Embrapa Semi-Árido em Petrolina-PE. Também foram avaliadas progênies endogâmicas e de polinização livre derivadas desses acessos. As avaliações foram realizadas em de casa de vegetação, mediante inoculações mecânicas, e avaliação por Elisa, no Laboratório de Virologia Vegetal da UFC. As plantas não infetadas foram selecionadas e cultivadas na Estação Experimental de Bebedouro na Embrapa Semi-Árido em Petrolina-PE, onde ocorreram inoculações naturais de vírus por vetores. Foram constatadas plantas não infetadas com o PRSV-W nos acessos 87-019, PI-244019A, 91-080, PI-244018, PI-244019B e PI-195927; plantas não infetadas com o WMV nos acessos 87-019 e 87-029 e plantas não infetadas com o ZYMV nos acessos PI-244019A, 87-029, 91-080, 91-043, PI-244019B e PI-195927. As progênies apresentaram comportamento diferenciado, com percentagem de plantas selecionadas variando de 20 a 100% nas progênies avaliadas para resistência a PRSV-W e 60 a 100% nas progênies avaliadas para resistência a WMV. Nenhuma das progênies testadas apresentou resistência ao ZYMV, evidenciando possível diferença entre a resistência ao PRSV-W e ao WMV apresentada nas progênies e a resistência apresentada ao ZYMV, visto que as progênies foram submetidas ao mesmo número de autofecundações.

Efeito do Soil-borne wheat mosaic virus sobre o metabolismo de cinco genótipos de trigo com diferentes níveis de resistência à doença

Com o objetivo de conhecer as alterações metabólicas promovidas pelo Soil-borne wheat mosaic virus (SBWMV), um dos vírus economicamente mais importantes da cultura do trigo (Triticum aestivum), foram analisados os níveis de proteínas solúveis e determinadas as atividades da peroxidase e da protease em quatro cultivares (BRS Guabiju, BRS 194, BRS 179, BR 23) e uma linhagem (PF 980524) de trigo com diferentes níveis de resistência ao vírus. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, comparando-se as médias, pelo Teste de Duncan a 5%. Os níveis de proteínas solúveis foram mais elevados nas plantas sem sintomas, enquanto que as atividades da peroxidase e da protease foram maiores em plantas com sintoma de mosaico do que em plantas assintomáticas. Além disso, pode-se constatar que quanto maior a suscetibilidade do genótipo, maior o nível de atividade da protease. Estes resultados são promissores para estudos de inibição da protease para controle de viroses.

Crotalaria paulinea, novo hospedeiro natural do vírus do mosaico severo do caupi

Amostras foliares de Crotalaria paulinea apresentando mosaico foram coletadas em São Luiz, MA, e enviadas ao Laboratório de Virologia Vegetal da UFC. As amostras foram testadas por Elisa indireto, contra anti-soros para Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) e Cucumber mosaic virus (CMV) e por dupla difusão em àgar contra anti-soro para Cowpea severe mosaic virus (CPSMV). As amostras reagiram somente com o anti-soro para CPSMV, indicando ser C. paulinea mais um hospedeiro natural do vírus. Extratos das folhas de C. paulinea foram inoculados em plantas de caupi (Vigna unguiculata subsp. unguiculata) mantidas em casa de vegetação. Dez dias após a inoculação, as plantas passaram a exibir sintomas de mosaico e a presença do CPSMV foi confirmada por sorologia. Nos estudos de gama de hospedeiros, envolvendo oito espécies botânicas, o isolado de CPSMV obtido de C. paulinea (CPSMV-Cp) infetou sistemicamente somente cultivares de caupi. Estudos de reações de RT-PCR revelaram a presença de uma banda no gel de agarose de 594 pb para o CPSNV-Cp semelhante às de outros isolados de CPSMV. O CPSMV-Cp foi multiplicado em caupi cv. Pitiúba e purificado por clarificação com n-butanol, precipitação viral com PEG e ultracentrifugação. A preparação purificada apresentou um espectro de absorção ultravioleta típico de núcleoproteína com uma razão A260/A280 de 1,7. Coelho da raça Nova Zelândia Branca imunizado com a preparação viral purificada, produziu anti-soro policlonal reativo com CPSMV em dupla difusão em àgar. Este é o primeiro relato sobre a infecção natural de CPSMV em C. paulinea.

Caracterização da região 3'-terminal do genoma de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

O presente trabalho caracteriza a região 3'-terminal do genoma de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar 972 nt da região 3'-terminal do RNA viral. Foi obtido fragmento de tamanho esperado que inclui o gene da proteína capsidial e a região 3'-terminal não codificadora. O gene da proteína capsidial (ORF4) contém 801 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UGA, com seqüência deduzida de 266 aminoácidos e massa molecular estimada de 28.800 Da. Sessenta e um aminoácidos terminais da ORF2 estão sobrepostos na ORF4. O "sinal de localização nuclear", encontrado dentro do "Domínio R" na região 5'-terminal da ORF4 de alguns sobemovírus, não foi identificado no SBMV-SP. Esse dado pode explicar a ausência de partículas virais do SBMV-SP no núcleo celular. A seqüência do SBMV-SP apresentou identidade de nucleotídeos e aminoácidos de, respectivamente, 91% e 93% com o isolado "Arkansas" (SBMV-ARK) descrito nos EUA. Os resultados obtidos indicam que o SBMV-SP e o SBMV-ARK são isolados muito proximamente relacionados.