Genital immunization of heifers with a glycoprotein Edeleted, recombinant bovine herpesvirus 1 strain confers protection upon challenge with a virulent isolate

Venereal infection of seronegative heifers and cows with bovine herpesvirus type 1.2 (BoHV-1.2) frequently results in vulvovaginitis and transient infertility. Parenteral immunization with inactivated or modified live BoHV-1 vaccines often fails in conferring protection upon genital challenge. We herein report an evaluation of the immune response and protection conferred by genital vaccination of heifers with a glycoprotein E-deleted recombinant virus (SV265gE-). A group of six seronegative heifers was vaccinated with SV265gE- (0,2mL containing 10(6.9)TCID50) in the vulva submucosa (group IV); four heifers were vaccinated intramuscularly (group IM, 1mL containing 10(7.6)TCID50) and four heifers remained as non-vaccinated controls. Heifers vaccinated IV developed mild, transient local edema and hyperemia and shed low amounts of virus for a few days after vaccination, yet a sentinel heifer maintained in close contact did not seroconvert. Attempts to reactivate the vaccine virus in two IV vaccinated heifers by intravenous administration of dexamethasone (0.5mg/kg) at day 70 pv failed since no virus shedding, recrudescence of genital signs or seroconversion were observed. At day 70 pv, all vaccinated and control heifers were challenged by genital inoculation of a highly virulent BoHV-1.2 isolate (SV56/90, 10(7.1)TCID50/animal). After challenge, virus shedding was detected in genital secretions of control animals for 8.2 days (8-9); in the IM group for 6.2 days (4-8 days) and during 5.2 days (5-6 days) in the IV group. Control non-vaccinated heifers developed moderate (2/4) or severe (2/4) vulvovaginitis lasting 9 to 13 days (x: 10.7 days). The disease was characterized by vulvar edema, vulvo-vestibular congestion, vesicles progressing to coalescence and erosions, fibrino-necrotic plaques and fibrinopurulent exudate. IM vaccinated heifers developed mild (1/3) or moderate (3/4) genital lesions, lasting 10 to 12 days (x: 10.7 days); and IV vaccinated heifers developed mild and transient vulvovaginitis (3/4) or mild to moderate genital lesions (1/4). In the IV group, the clinical signs lasted 4 to 8 days (x: 5.5 days). Clinical examination of the animals after challenge revealed that vaccination by both routes conferred some degree of protection, yet IV vaccination was clearly more effective in reducing the severity and duration of clinical disease. Furthermore, IV vaccination reduced the period of virus shedding in comparison with both groups. Taken together, these results demonstrate that SV265gE- is sufficiently attenuated upon IV vaccination in a low-titer dosis, is not readily reactivated after corticosteroid treatment and lastly, and more importantly, confers local protection upon challenge with a high titer of a virulent heterologous BoHV-1 isolate. Therefore, the use of this recombinant for genital immunization may be considered for prevention of BoHV-1-associated genital disease in the field.

Antimicrobial resistance of Staphylococcus spp. from small ruminant mastitis in Brazil

The study aimed to determine the antimicrobial resistance patterns and to identify molecular resistance markers in Staphylococcus spp. (n=210) isolated from small ruminant mastitis in Brazil. The antimicrobial resistance patterns were evaluated by the disk diffusion test and by detection of the presence of mecA, blaZ, ermA, ermB, ermC and msrA genes by PCR. The efflux pump test was performed using ethidium bromide and biofilm production was determined by Congo red agar test along with PCR for detection of the icaD gene. The isolates were most resistant to amoxicillin (50.0%), streptomycin (42.8%), tetracycline (40.4%), lincomycin (39.0%) and erythromycin (33.8%). Pan-susceptibility to all tested drugs was observed in 71 (33.8%) isolates and 41 Staphylococcus isolates were positive for the efflux pump. Although phenotypic resistance to oxacillin was observed in 12.8% of the isolates, none harbored the mecA gene. However, 45.7% of the isolates harbored blaZ indicating that beta-lactamase production was the main mechanism associated with staphylococci resistance to beta-lactams in the present study. The other determinants of resistance to antimicrobial agents ermA, ermB, ermC, and msrA were observed in 1.4%, 10.4%, 16.2%, and 0.9% of the isolates, respectively. In addition, the icaD gen was detected in 32.9% of the isolates. Seventy three isolates (54 from goats and 19 from sheep) were negative for all resistance genes tested and 69 isolates presented two or more resistance genes. Association among blaZ, ermA, ermB, ermC and efflux pump were observed in 17 isolates, 14 of which originated from goats and three from sheep. The data obtained in this study show the resistance of the isolates to beta-lactamics, which may be associated with the use of antimicrobial drugs without veterinary control.

Comportamento do girassol quando cultivado em área tratada com o herbicida 2,4-D¹

Com o objetivo de determinar o período adequado de semeadura da cultura do girassol (Helianthus annuus), em relação à aplicação de 2,4-D, foi realizado um experimento em condições de campo da área experimental da Embrapa Soja, Londrina-PR, durante o ano agrícola 1995/96. Os tratamentos estabelecidos foram doses do herbicida 2,4-D (0,0, 536 e 1.005 g e.a. ha-1 ) e épocas de semeadura da cultura. Dessa forma, a semeadura foi realizada um dia antes da aplicação do produto (-1 dia), no dia da aplicação (0 dia) e a 1, 4, 7, 10 e 13 dias depois da aplicação do herbicida. Os resultados indicaram que o girassol sofreu injúrias mais severas nas três primeiras épocas de semeadura (-1, 0 e 1). Aumentando o tempo entre a aplicação das doses do herbicida e a semeadura do girassol, observaram-se menores danos causados à cultura. O experimento permitiu concluir que áreas tratadas com o 2,4-D nas doses de 536 e 1.005 g e.a. ha-1 podem ser cultivadas com girassol, desde que se mantenha um intervalo mínimo de quatro dias entre a aplicação do herbicida e a sua semeadura.

Interferência de caruru-de-mancha sobre características de crescimento e produção da beterraba

A beterraba (Beta vulgaris), importante hortaliça cultivada no Brasil, é muito suscetível à interferência de plantas daninhas, sendo Amaranthus viridis uma das principais espécies encontradas em áreas de horticultura. O objetivo deste trabalho foi estudar a resposta da beterraba à competição com diferentes densidades de A. viridis, por meio da avaliação de características de crescimento e produção da cultura. Um experimento em caixas, com área útil de 0,25 m², foi conduzido em Jaboticabal-SP, Brasil, mantendo-se constante oito plantas por caixa de beterraba em convivência com 0, 1, 2, 3, 4 e 6 plantas por caixa de A. viridis. A cultura da beterraba foi muito suscetível à interferência imposta por plantas de A. viridis, tendo sua área foliar, número de folhas, massa seca de folhas, diâmetro médio da raiz e massa fresca de raízes significativamente reduzidos mesmo em baixas densidades populacionais da planta daninha; a massa fresca de raízes foi a mais sensível à interferência.

Sulfated bromophenols from Osmundaria obtusiloba (C. Agardh) R. E. Norris (Rhodophyta, Ceramiales)

Two new sulfated oligobromophenols from the marine red algae Osmundaria obtusiloba, 4-(1'-potassium sulfate, 2,3-dibromo, 1',4,5-trihydroxybenzyl) - 4''-(1'''-potassium sulfate, 2'',3''-dibromo, 1''',4'',5''-trihydroxybenzyl) sulfate and 1'-(2, 3-dibromo, 4-potassium sulfate, 1', 4, 5-trihydroxybenzyl) - 4''-(1''' potassium sulfate, 2'', 3''-dibromo, 1''', 4'', 5'' trihydroxybenzyl) sulfate, are herein reported. Besides them it was obtained 2, 2', 3, 3'-tetrabromo-4, 4', 5, 5'-tetrahydroxydiphenylmethane, 2, 3-dibromo-p-hydroxybenzyl methyl ether (methyl lanosol), dipotassium 2,3-dibromo-5-hydroxybenzyl 1',4-disulfate, 24-methylenecolest-5-en-3-beta-ol and alpha-D-mannopyranosyl-(1->2')-glycerate (digeneaside). The structures were determined by analysis of the spectroscopic data (IR, NMR and MS) and comparison with the literature. The 13CNMR data for dipotassium 2,3-dibromo-5hydroxybenzyl-1',4-disulfate are described here for the first time. The present study also suggests a mild method to isolate and to purify sulfated compounds.

Specific fluorogenic substrates for neprilysin (neutral endopeptidase, EC 3.4.24.11) which are highly resistant to serine- and metalloproteases

Two intramolecularly quenched fluorogenic peptides containing o-aminobenzoyl (Abz) and ethylenediamine 2,4-dinitrophenyl (EDDnp) groups at amino- and carboxyl-terminal amino acid residues, Abz-DArg-Arg-Leu-EDDnp (Abz-DRRL-EDDnp) and Abz-DArg-Arg-Phe-EDDnp (Abz-DRRF-EDDnp), were selectively hydrolyzed by neutral endopeptidase (NEP, enkephalinase, neprilysin, EC 3.4.24.11) at the Arg-Leu and Arg-Phe bonds, respectively. The kinetic parameters for the NEP-catalyzed hydrolysis of Abz-DRRL-EDDnp and Abz-DRRF-EDDnp were Km = 2.8 µM, kcat = 5.3 min-1, kcat/Km = 2 min-1 µM-1 and Km = 5.0 µM, kcat = 7.0 min-1, kcat/Km = 1.4 min-1 µM-1, respectively. The high specificity of these substrates was demonstrated by their resistance to hydrolysis by metalloproteases [thermolysin (EC 3.4.24.2), angiotensin-converting enzyme (ACE; EC 3.4.24.15)], serineproteases [trypsin (EC 3.4.21.4), a-chymotrypsin (EC 3.4.21.1)] and proteases present in tissue homogenates from kidney, lung, brain and testis. The blocked amino- and carboxyl-terminal amino acids protected these substrates against the action of aminopeptidases, carboxypeptidases and ACE. Furthermore, DR amino acids ensured total protection of Abz-DRRL-EDDnp and Abz-DRRF-EDDnp against the action of thermolysin and trypsin. Leu-EDDnp and Phe-EDDnp were resistant to hydrolysis by a-chymotrypsin. The high specifity of these substrates suggests their use for specific NEP assays in crude enzyme preparations

Inotropic effect of Citrus sinensis (L.) Osbeck leaf extracts on the guinea pig atrium

The objective of the present investigation was to determine the contractile effect of crude and acetone leaf extracts of Citrus sinensis (L.) Osb. on mammalian myocardium. Crude leaf extracts have been used in folk medicine to treat neurological disorders. Some flavonoids isolated from this plant presented a positive inotropic effect on myocardium. This motivated us to test the extracts on the atria of guinea pigs of both sexes (300-500 g) and surprisingly we observed inotropic depression instead of an increase in force. The maximum effect of the crude extract was 79.4 ± 8.1% of the control force amplitude (N = 5 hearts, 10 trials, 27 ± 0.1ºC, stimulus: 2 Hz, 400 V, 0.5 ms). The EC50 for crude, ethanol, acetic, aqueous, and acetone extracts was 300, 300, 600, 1000, and 140 µg/ml, respectively, with a Hill constant of 1.8, 2.0, 2.5, 2.0, and 1.4, respectively. Blockade of cholinergic, beta-adrenergic, or opioid membrane receptors with 1.5 µM atropine sulfate, 1 µM propranolol, and 10 µM naloxone, respectively, did not change the effect of the crude extract. The acetone extract abolished the Bowditch positive staircase phenomenon (N = 5 hearts, 10 trials, 27 ± 0.1ºC), suggesting a possible reduction of the calcium inward current, and also promoted the so-called Woodworth phenomenon. The effect was concentration-dependent and indicated the existence of another inhibitory contractile mechanism such as the simultaneous activation of some of the membrane potassium channels reducing the myocardial action potential duration and further decreasing the cellular calcium entry.

Expression of beta 2 integrin (CD18) in embryonic mouse and chicken heart

Integrins are heterodimeric receptors composed of α and β transmembrane subunits that mediate attachment of cells to the extracellular matrix and counter-ligands such as ICAM-1 on adjacent cells. β2 integrin (CD18) associates with four different α (CD11) subunits to form an integrin subfamily, which has been reported to be expressed exclusively on leukocytes. However, recent studies indicate that β2 integrin is also expressed by other types of cells. Since the gene for β2 integrin is located in the region of human chromosome 21 associated with congenital heart defects, we postulated that it may be expressed in the developing heart. Here, we show the results from several different techniques used to test this hypothesis. PCR analyses indicated that β2 integrin and the αL, αM, and αX subunits are expressed during heart development. Immunohistochemical studies in both embryonic mouse and chicken hearts, using antibodies directed against the N- or C-terminal of β2 integrin or against its α subunit partners, showed that β2 integrin, as well as the αL, αM, and αX subunits, are expressed by the endothelial and mesenchymal cells of the atrioventricular canal and in the epicardium and myocardium during cardiogenesis. In situ hybridization studies further confirmed the presence of β2 integrin in these various locations in the embryonic heart. These results indicate that the β2 integrin subfamily may have other activities in addition to leukocyte adhesion, such as modulating the migration and differentiation of cells during the morphogenesis of the cardiac valves and myocardial walls of the heart.

Purificação de três diferentes beta-galactosidades microbianas por partição em sistemas de duas fases aquosas

Este trabalho tratou da investigação do efeito do peso molecular de polietilenoglicol (PEG) sobre a partição de enzimas beta-galactosidases de diferentes origens microbianas: Escherichia coli, Klueveromyces lactis e Aspergillus orizae em sistemas de duas fases aquosas (SDFA).Foi observado que os melhores sistemas para purificação da enzima de E. coli foram os formados por PEG 4000, 6000 e 8000/fosfato, fornecendo os mais elevados fatores de purificação da enzima. As enzimas de Klueveromyces lactis e Aspergillus orizae não foram eficientemente purificadas nestes sistemas sendo insensíveis à alterações do peso molecular do PEG. Portanto, um outro sistema de duas fases aquosas foi desenvolvido contendo um ligante específico, p-aminofenil 1-tio-beta-D-galactopiranosídeo (APGP), acoplado ao PEG para purificar a enzima de Klueveromyces lactis. Uma etapa simples de partição no SDFA formado por 6% APGP-PEG4000 + 12% dextrana T505.000 foi capaz de recuperar 83% da enzima na fase superior do sistema e de aumentar 1,6 vezes o fator de purificação.

Avaliação da metodologia analítica para determinação de beta-caroteno em macarrão fortificado

O beta-caroteno sintético pode ser adicionado tecnologicamente ao macarrão na forma de solução oleosa, emulsões dispersíveis em água ou sob a forma de esferas coloidais, com a finalidade de melhorar a sua cor e valor vitamínico. Todavia, a inexistência de uma metodologia confiável e especificamente testada para a extração e dosagem do beta-caroteno em macarrão enriquecido dificulta a avaliação da possível relevância nutricional da medida. O presente trabalho compara dois métodos de extração para produtos secos (LIVINGSTON, 1986 [método I] e RITTER & PURCELL, 1981 [método II]) e um para verduras e frutas (RODRIGUEZ-AMAYA et al., 1976 [método III]), quanto à eficiência de extração do beta-caroteno no macarrão cru e cozido. A matéria-prima utilizada foi um lote de macarrão produzido com quantidade conhecida de beta-caroteno, na forma de suspensão oleosa a 30%. Os resultados mostraram uma taxa de recuperação para beta-caroteno de 89 e 84% pelos métodos III e I, respectivamente, enquanto que o método II apresentou recuperação de apenas 44%. Conclue-se que, tanto os métodos I e III podem ser usados para quantificar o beta-caroteno em macarrão enriquecido. Por outro lado, a separação dos produtos de degradação do caroteno permite calcular o valor vitamínico real do macarrão cru e cozido. A superestimação dos valores vitamínicos, quando tais produtos não foram excluídos, foi de 24% para o macarrão cru e 25% para o cozido.

Atividade antioxidante do beta-caroteno e da vitamina A. Estudo comparativo com antioxidante sintético

Foi avaliada a atividade antioxidante da vitamina A na forma de acetato de retinol e de seu principal precursor, o beta-caroteno, adicionados a um sistema de óleo de soja previamente sensibilizado à oxidação. Os parâmetros utilizados como grau de atividade oxidativa foram: índice de peróxidos, teores de malonaldeído durante os intervalos de 24 a 72 horas, e perfil dos ácidos linoléico e linolênico após 144 horas de oxidação. Pelos resultados pode-se verificar que o retinol apresentou atividade antioxidante superior ao beta-caroteno. As determinações das atividades antioxidantes foram comparadas à do butilhidroxitolueno (BHT). A eficiência antioxidante da vitamina A e do beta-caroteno foram proporcionais às suas resistências à decomposição no sistema oxidativo. O acetato de retinol, a exemplo do BHT, mostrou uma rápida interação com os radicais ativos, pois já no início de sua adição ao óleo de soja, reduziu o nível da oxidação em relação ao respectivo controle.

Identificação de compostos voláteis da cúrcuma empregando microextração por fase sólida e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

Compostos voláteis da cúrcuma (Curcuma longa L.) cultivada no Brasil foram isolados por microextração por fase sólida. Os rizomas foram cozidos em solução de bicarbonato de sódio 0,1%, fatiados, secos e triturados. Visando estabelecer o sistema ideal para a microextração, fibras de polidimetilsiloxano de 100µm de espessura foram expostas ao headspace de frascos de 10mL. Estudou-se a influência das seguintes variáveis sobre o rendimento dos compostos voláteis obtidos: amostras em pó (0,1 a 1,0g) e em solução (40mg/L), diferentes temperaturas (40 a 70ºC) e tempos (2 a 20min) de partição. O efeito da temperatura (210 a 240ºC) e do tempo (3 e 5min) de dessorção também foi avaliado. As melhores condições para a partição dos compostos voláteis foram 0,1g do pó, 70ºC e 5min. A temperatura de 220ºC e o tempo de 5 minutos foram os de maior eficiência para a dessorção. A cromatografia gasosa foi conduzida em coluna capilar, detecção por ionização de chama e identificação por espectrometria de massas. A análise dos espectros de massas obtidos para os nove compostos voláteis predominantes indicou a presença de ar-curcúmeno, ar-turmerona, zingibereno, beta-sesquifelandreno, sabineno, 1,8-cineol e 1,4-terpineol.

Pró-vitaminas A em hortaliças comercializadas no mercado formal e informal de Viçosa (MG), em três estações do ano

Para fornecer dados sobre a influência climática e a forma de comercialização sobre carotenóides de vegetais, este estudo pesquisou o conteúdo de alfa e beta-caroteno e o valor de vitamina A de sete hortaliças (batata-doce, cenoura, moranga, pimentão, quiabo, tomate e vagem), na cidade de Viçosa (MG), utilizando a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Compararam-se hortaliças comercializadas nos mercados formal (mercados locais) e informal (feira livre) durante primavera, verão e outono. A cenoura apresentou os teores mais elevados de alfa e beta-caroteno (31,17 e 58,18 µg/g, respectivamente), seguida pela moranga (4,33 e 23,16 µg/g, respectivamente), enquanto a batata-doce apresentou o teor mais reduzido de beta-caroteno (0,51 µg/g). O valor de vitamina A variou conforme o perfil de alfa e beta-caroteno. Com exceção da cenoura e do quiabo, não houve influência significativa do local de comercialização sobre o conteúdo de carotenóides. A variação do conteúdo de carotenos nas estações do ano foi inexpressiva, sendo que apenas o pimentão apresentou valores significativamente diferentes. Porções de 100 g das hortaliças analisadas fornecem entre 3 e 78% da recomendação de vitamina A.

Avaliação de diferentes híbridos suínos submetidos à insensibilização elétrica e gasosa (CO2). Parte 1: mensuração de indicadores sanguíneos de estresse

Suínos provenientes de três linhagens genéticas A, B e C comercializadas no Brasil, com peso vivo de 100 a 120 kg foram submetidos ao insensibilizador elétrico manual (Karl Schermer 220-230/250 volts, 45-60 Hz e 1,4 -1,5 A) e ao sistema gasoso coletivo (COMBI-BUTINA 90% CO2). Alíquotas sanguíneas, para determinação dos níveis de creatina fosfoquinase (CPK), lactato e cortisol, assim como amostras do músculo semimembranosus (10 g) para a determinação do gene halotano, foram coletadas. Comparando-se os sistemas de insensibilização elétrico e gasoso (CO2), o elétrico demonstrou ser mais estressante, proporcionando maiores concentrações plasmáticas de cortisol (p < 0,001) e lactato (p < 0,001) para as linhagens genéticas A e C, nas condições estudadas, porém não se observou diferenças significativas para os indicadores sanguíneos e sistemas de insensibilização em questão quando a linhagem B foi considerada. Diferenças significativas entre as linhagens genéticas A, B e C foram obtidas comparando-se os valores plasmáticos de creatina fosfoquinase (p < 0,001), lactato (p < 0,001) e cortisol (p < 0,001) quando atordoados com o sistema gasoso, entretanto, quando o sistema elétrico foi utilizado, somente os valores de cortisol apresentaram diferenças significativas (p < 0,001). A presença do gene halotano (Nn) foi observada somente na linhagem B.

Teores de carotenóides em mamão e pêssego determinados por cromatografia líquida de alta eficiência

Os carotenóides são pigmentos naturais, responsáveis pela cor em muitos alimentos como frutas e vegetais, gema de ovo, pele e músculo de alguns peixes. Porém, sua importância também está relacionada a funções ou ações biológicas nos seres humanos, como atividade pró-vitamínica A, fortalecimento do sistema imunológico, diminuição do risco de doenças degenerativas como câncer, doenças cardiovasculares, degeneração macular e catarata. A determinação da composição de carotenóides em alimentos, portanto, é considerada prioritária mundialmente. O objetivo do presente estudo foi analisar quantitativamente, por cromatografia líquida de alta eficiência, os principais carotenóides presentes em três cultivares de mamão (Formosa, Golden e Sunrise) e três cultivares de pêssego (Xiripá, Coral e Diamante). Para cada cultivar, foram analisados cinco lotes durante o ano para mamão e durante a safra para pêssego. Os três cultivares de mamão apresentaram composição parecida com as médias dos conteúdos totais de licopeno, beta-criptoxantina e beta-caroteno variando de 18,5 a 23,9, 8,2 a 11,7 e 0,5 a 1,2 µg.g -1, respectivamente. Em relação ao pêssego, os cultivares Coral e Xiripá tiveram níveis muito baixos de carotenóides. O cultivar Diamante teve um teor total médio de 6,4 µg.g -1 de beta-criptoxantina, o carotenóide principal.