Polimorfismo do gene do receptor de progesterona (PROGINS) em mulheres com câncer de mama: estudo caso-controle

OBJETIVOS: analisar a correlação entre o polimorfismo PROGINS e o câncer de mama. MÉTODOS: estudo caso-controle desenvolvido entre abril e outubro de 2004 com o pareamento de 50 mulheres com diagnóstico histopatológico de carcinoma de mama e 49 mulheres saudáveis. A inserção Alu de 306 pares de base no intron G do gene do receptor da progesterona denominada PROGINS foi detectada por meio de reação em cadeia da polimerase e analisada em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio. Os grupos controle e experimental foram comparados, por meio de programa estatístico Epi-Info 6.0, quanto aos genótipos e às freqüências alélicas, utilizando-se o teste do chi2. RESULTADOS: em relação ao PROGINS encontramos uma prevalência na população estudada de 62 (62,6%) indivíduos homozigotos selvagens, 35 (35,3%) de heterozigotos e dois (2,1%) casos com a presença da mutação. Não foi evidenciada diferença significante em relação ao polimorfismo PROGINS, quando comparados os casos e controles, seja com relação à homozigose (62 vs 65,3%), heterozigose (36 vs 34,6%) ou à presença de mutação (2,0 vs 2,1%), com p de 0,920 (OR=1,01), 0,891 (OR=1,06) e 0,988 (OR=1,10), respectivamente. CONCLUSÕES: os resultados mostraram que o polimorfismo PROGINS não conferiu risco substancial de câncer de mama em seus portadores.

Relação entre polimorfismo do gene do receptor de progesterona, raça, paridade e ocorrência de leiomioma uterino

OBJETIVOS: analisamos raça, paridade e presença do polimorfismo do gene do receptor de progesterona, denominado PROGINS, como fatores relacionados à ocorrência de leiomioma uterino em mulheres brasileiras. MÉTODOS: realizamos estudo caso-controle, no qual foram incluídas 122 pacientes com diagnóstico de leiomioma e 125 mulheres sem a doença. Após registro dos dados clínicos, coletamos material biológico para extração de DNA, reação em cadeia da polimerase e eletroforese em gel de agarose, a fim de identificar a presença do polimorfismo PROGINS. A análise estatística foi feita pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney ou pelo teste do chi2, a depender da variável estudada. O risco para ocorrência da doença foi calculado pelo modelo de regressão logística, com obtenção da odds ratio (OR) (razão de chances). O nível de significância adotado foi de 5% (p<0,05) e o intervalo de confiança foi de 95% (IC 95%). RESULTADOS: observamos maior prevalência de "não-brancas"- pardas e negras - (50 vs 22,4%) e de nulíparas (23,8 vs 11,2%) nos casos, ao passo que o genótipo do receptor de progesterona foi mais freqüentemente PROGINS positivo - heterozigoto ou homozigoto mutante - entre os controles (21,6 vs 10,7%). A razão de chances indicou elevação do risco para leiomioma relacionada à raça "não branca"(OR=3,46; IC 95%: 2,0-6,0) e à nuliparidade (OR=3,30; IC 95%: 1,9-5,6), com redução na presença de genótipos PROGINS positivo (OR=0,43; IC 95%: 0,2-0,9). CONCLUSÕES: a raça "não branca"e a nuliparidade foram consideradas fatores de risco para a ocorrência de leiomioma uterino em mulheres da população estudada, ao passo que o polimorfismo PROGINS demonstrou ser fator protetor.

Polimorfismo do gene dos receptores de progesterona e o aborto espontâneo de repetição

OBJETIVO: investigar se polimorfismos dos genes que codificam o receptor de progesterona (PROGINS) estão relacionados à ocorrência de aborto espontâneo de repetição (AER). MÉTODOS: em estudo caso-controle, foram selecionados 85 pacientes com antecedente de pelo menos três abortos precoces sem etiologia definida (Grupo Caso) e 157 mulheres com história de pelo menos duas gestações de termo sem intercorrências e sem passado de abortamento (Grupo Controle). Realizada coleta de 10 mL de sangue por punção venosa periférica e extração de DNA pela técnica DTAB/CTAB. As genotipagens foram feitas por reação em cadeia de polimerase (PCR), nas condições de ciclagem específica para o polimorfismo em estudo, seguida de amplificação em gel de agarose a 2%. A visualização das bandas foi feita sob luz ultravioleta e os géis foram fotografados. As diferenças genotípicas e alélicas entre os dois grupos para o polimorfismo PROGINS foram calculadas pelo teste de χ2, adotando-se como nível de significância valores de p<0,05. Calculou-se ainda o Odds Ratio (OR, razão de chances), com intervalos de confiança de 95% (IC95%). RESULTADOS: As frequências genotípicas encontradas para o polimorfismo PROGINS foram de 72,3% T1/T1 e 27,7% T1/T2 no grupo com AER e 76,4% T1/T1, 22,3% T1/T2 e 1,3% T2/T2 no Grupo Controle. Não houve diferenças entre os grupos, analisando-se as frequências genotípicas e alélicas: respectivamente p=0,4 (OR: 0,8) e p=0,6 (OR: 0,9). CONCLUSÕES: os dados do presente estudo sugerem que o polimorfismo PROGINS do gene dos receptores de progesterona não está relacionado ao AER.

Polimorfismo do receptor de progesterona como fator de risco para o parto prematuro

OBJETIVO: investigar a associação entre o polimorfismo do gene do receptor da progesterona (PROGINS) e o risco de parto prematuro. MÉTODOS: estudo caso-controle, para o qual foram selecionadas 57 pacientes com antecedente de parto prematuro (Grupo Caso) e 57 pacientes com parto a termo na gravidez atual e sem antecedentes de parto prematuro (Grupo Controle). Foi realizada a coleta de 10 mL de sangue por venopunção de veia periférica para extração de DNA. As genotipagens foram feitas por reação em cadeia de polimerase (PCR) nas condições de ciclagem específicas para o polimorfismo em estudo seguida de eletroforese em gel de agarose a 2%. Foram determinados três genótipos: selvagem (T1/T1), heterozigoto (T1/T2) e mutado (T2/T2). As frequências genotípicas e alélicas dos dois grupos foram comparadas pelo teste do χ² adotando-se, com o nível de significância, valor p<0,05. Calculou-se ainda o Odds Ratio (OR, razão de chances) com intervalos de confiança de 95% (IC95%). RESULTADOS: as frequências genotípicas do alelo selvagem (T1) e alelo mutante (T2) encontradas para o polimorfismo PROGINS foram de 75,4% T1/T1, 22,8% T1/T2 e 1,8% T2/T2 no Grupo com parto pré-termo e 80,7% T1/T, 19,3% T1/T2 e 0% T2/T2 no Grupo com parto a termo. Não houve diferenças entre os grupos, analisando-se as frequências genotípicas e alélicas: p=0,4 (OR=0,7) e p=0,4 (OR=0,7). CONCLUSÕES: o presente estudo sugere que a presença do polimorfismo PROGINS em nossa população não está associado ao risco de parto prematuro.

Prevalência dos genótipos do papilomavírus humano: comparação entre três métodos de detecção em pacientes de Pernambuco, Brasil

OBJETIVO: comparar três métodos para detecção do HPV e determinar a prevalência dos genótipos encontrados. MÉTODOS: um total de 120 amostras de raspagem da região cervical de mulheres portadoras de neoplasia intraepitelial cervical foram analisadas pela reação em cadeia da polimerase convencional, usando os sistemas de primers MY09/11, GP05+/06+ e pela Nested-PCR. As amostras foram submetidas à extração de DNA e, logo após, amplificadas com os primers GH20 e PC04 (β-globina) para verificação da qualidade do DNA obtido e pela reação em cadeia da polimerase convencional e Nested-PCR. Os fragmentos amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1,2%, corados com Blue Green Loading Dye I. As amostras positivas foram sequenciadas usando o sequenciador automático de DNA "MegaBACE 1000". Para análise estatística foram utilizados os teste do Χ2 e o de Fisher com nível de significância de 5%. RESULTADOS: quinze amostras não se amplificaram para os primers de β-globina, sendo eliminadas do estudo. Das amostras restantes, 40% (42/105) foram positivas para os primers MY09/11, 98% (103/105) para os primers GP05+/06+ e 92% (97/105) para Nested-PCR. Considerado as técnicas MY09/11 e GP05+/06+, foi possível observar 100% de amostras positivas para o HPV. Neste estudo, a prevalência dos genótipos foi de 58, 23, 5, 4 e 3% para HPVs 16, 18, 31, 33 e 56, respectivamente. Os HPV 67 e 83 apresentaram 2% e os HPV 6, 11, 58 e candHPV85, 1% cada. A prevalência dos genótipos neste estudo está de acordo com o reportado em todo o mundo (IC95%=0,4657-0,8976). CONCLUSÕES: para obter resultados mais confiáveis, é necessário o uso de mais que um sistema de primers para detecção do HPV. Acredita-se que as três técnicas estudadas são importantes e adequadas para o diagnóstico clínico do HPV quando apropriadamente combinadas.

Transferência de imunidade passiva em bezerros das raças Nelore e Limousin e proteinograma sérico nos primeiros quatro meses de vida

Com o objetivo de investigar alguns aspectos relacionados à transferência de imunidade passiva em bovinos de corte, foram selecionados 90 bezerros aparentemente sadios, 45 da raça Nelore e 45 da raça Limousin, distribuídos em 3 grupos (com 15 bezerros cada) de acordo com o número de parições de suas mães: primeira cria; segunda cria; e terceira ou mais crias. Amostras de sangue foram colhidas de cada bezerro entre 24 e 36 horas de vida e com 15, 30, 60, 90 e 120 dias. Determinaram-se as concentrações de proteína total no soro (PT) e no plasma (PPT), a atividade sérica da gamaglutamiltransferase (GGT), e as concentrações séricas de albumina, alfa, beta e gamaglobulinas por eletroforese em gel de agarose e de IgG estimada por meio do método de turvação pelo sulfato de zinco. Empregou-se a análise de variância bifatorial para as variáveis mensuradas na primeira colheita. O comportamento das variáveis em função da idade foi estudado por meio da análise de variância de medidas repetidas. Correlações foram estabelecidas entre as variáveis. A transferência de imunidade passiva foi bem sucedida nos bezerros de ambas as raças e o número de parições das mães não interferiu no processo. As concentrações mais elevadas de gamaglobulinas ao término do primeiro dia de vida declinaram até valores mínimos aos 60 dias. A partir dessa idade, a elevação conseqüente à produção ativa de anticorpos foi mais precoce nos bezerros taurinos e mais lenta nos zebuínos. A gamaglobulina, ao término do primeiro dia de vida, correlacionou-se com as seguintes variáveis: IgG (r=0,859), PPT (r=0,807), PT (r=0,811) e GGT (r=0,399). O fator etário exerceu efeito sobre todas as variáveis mensuradas. As variações das proteínas séricas obedeceram a um padrão de comportamento fisiológico ao longo dos quatro primeiros meses de vida, de forma geral, não distinto em taurinos e zebuínos.

First identification of natural infection of Rickettsia rickettsii in the Rhipicephalus sanguineus tick, in the State of Rio de Janeiro

The Brazilian Spotted Fever (BSF) is a zoonotic disease caused by Rickettsia rickettsii and transmitted by ticks of the genus Amblyomma, more frequently, Amblyomma cajennense. The aim of this paper was to report the first molecular detection of R. rickettsii on R. sanguineus naturally infected in Rio de Janeiro, Brazil. Ticks were collected from dogs in a rural region of Resende municipality, Rio de Janeiro State, Brazil (22º30'9.46"S, 44º42'44.29"WO), where occurred five human cases of BSF in 2006. The ticks were identified under a stereoscopic microscope and separated in pools by stages, species and sex. DNA extraction was carried out using QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN®). The DNA was submitted to PCR amplification using 04 set of primers: Rr190.70p/Rr190.602n (OmpA, 532bp), BG1-21/BG2-20 (OmpB, 650bp), Tz15/Tz16 (17 kDa protein-encoding gene, 246bp) and RpCS.877p/RpCS.1258n (gltA, 381bp). PCR products were separated by electrophoresis on 1% agarose gels and visualized under ultraviolet light with ethidium bromide. PCR products of the expected sizes were purified by QIAquick® and sequenced by ABI PRISM®. The generated nucleotide sequences were edited with using Bioedit® software and compared with the corresponding homologous sequences available through GenBank, using Discontiguous Mega Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). It was confirmed R. rickettsii by sequencing of the material (GenBank FJ356230). The molecular characterization of R. rickettsii in the tick R. sanguineus emphasizes the role of dogs as carriers of ticks from the environment to home. Moreover, this result suggests that there is a considerable chance for active participation of R. sanguineus as one of tick species in the transmission of R. ricketsii to human being in the Brazilian territory.

Perfil eletroforético das proteínas séricas de serpentes Crotalus durissus terrificus (cascavel) criadas em cativeiro

As serpentes peçonhentas dos gêneros Bothrops e Crotalus têm sido mantidas em cativeiro visando à extração de venenos para a produção de imunobiológicos. O conhecimento da fisiologia desses animais e as alterações na concentração de proteínas e suas frações séricas são importantes para a identificação precoce de importantes enfermidades que cursam com estados de hipoproteinemia e hiperproteinemia. O objetivo do trabalho foi determinar a concentração de proteína total e o perfil eletroforético das proteínas séricas de serpentes Crotalus durissus terrificus (cascavel) criadas em cativeiro. Foram colhidas amostras de sangue da veia coccígea ventral de 21 serpentes adultas e sadias, divididas em dois grupos: Grupo 1 de 12 machos com peso médio de 588,89±193,55g, e Grupo 2 de nove fêmeas com peso médio de 708,33±194,04g. A proteína total sérica foi determinada pelo método de refratometria e a eletroforese em gel de agarose. Obtiveram-se valores da proteína total sérica (g/dL) de 4,51±0,50 para machos e de 4,82±0,72 para fêmeas, e para machos e fêmeas de 4,64±0,61. Foram identificadas pela eletroforese quatro frações protéicas (g/dL): albumina, a, b, g-globulinas e calculada a relação albumina:globulina. As serpentes fêmeas apresentaram maiores valores para as variáveis, albumina e para a relação albumina/globulina (AG) diferindo significativamente (P<0,05) do grupo de machos, porém sem significado clínico.

Perfil eletroforético e concentração de imunoglobulinas G (IgG) do soro sanguíneo de cabras Saanen com mastite experimental induzida por Staphylococcus aureus suplementadas com vitamina E

O objetivo do trabalho foi avaliar o perfil eletroforético das proteínas e a concentração sérica de imunoglobulina G (IgG) em cabras da raça Saanen com mastite induzida experimentalmente por Staphylococcus aureus e suplementadas com vitamina E (acetato de dl-α-tocoferol). Utilizaram-se 14 cabras adultas, gestantes, primíparas, com sorologia negativa para Artrite Encefalite Caprina (CAEV), clinicamente sadias, divididas em dois grupos experimentais de sete animais. Grupo não suplementado (G1) e grupo suplementado com 2.000 U.I. de acetato de dl-α-tocoferol (G2 Vit E) via intramuscular no dia do parto e sete dias após o parto. Ao nono dia do pós-parto foram inoculados 300 UFCs da cepa de S. aureus ATCC 225923, na metade esquerda da glândula mamária de cada animal. A mastite foi determinada pela colheita das amostras de leite para a comprovação da infecção, por meio de exames bacteriológicos, contagem de células somáticas (CCS) e California Mastitis Test (CMT), a partir deste momento foram efetuadas colheitas às 12, 24, 48 e 72 horas, sendo posteriormente instituído o tratamento intramamário com antimicrobiano e nova avaliação 48 horas após o tratamento. O perfil eletroforético em gel de agarose das proteínas séricas das cabras, apresentaram cinco frações, sendo: albumina e globulinas (α, β1, β2 e γ). Houve aumento na produção de γ-globulina e menor produção da fração β2-globulina 12 horas após a infecção, com os valores reduzindo mais rapidamente no grupo suplementado, evidenciando a influência da vitamina E na diminuição da produção das proteínas de fase aguda. Não houve influência da vitamina E na concentração sérica de imunoglobulina G (IgG) nos animais suplementados. A suplementação com vitamina E aumentou a concentração de imunoglobulinas e diminuiu a produção de proteínas de fase aguda, provavelmente pelo efeito antioxidante minimizando a lesão tecidual durante o processo inflamatório localizado na glândula mamária.

Apoptose na maturação placentária de vacas em diferentes estágios de gestação: evidenciação imuno-histoquímica e bioquímica

Apoptose tem um papel importante na manutenção da homeostase placentária, e o desequilíbrio desse processo pode comprometer a gestação. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrencia de apoptose em amostras de placenta de vacas em diferentes fases de gestação. Amostras de placentomos de 15 vacas saudáveis com 4 (n=5), 6 (n=5) e 9 (n=5) meses de gestação foram colhidas e processadas rotineiramente para a histologia, imuno-histoquímica e isolamento de DNA. As lâminas obtidas foram coradas em HE, ou submetidas à análise imuno-histoquímica das proteínas pró-apoptóticas caspase-3 e Bax, e da proteína anti-apoptótica Bcl-2. O DNA isolado foi submetido à eletroforese em gel de agarose para detecção da fragmentação internucleossômica do genoma. Os resultados de histomorfometria revelaram que as células apoptóticas aumentaram progressivamente com o avanço da gestação. Confirmou-se a apoptose pela fragmentação característica do DNA genômico, visualizada pelo clássico "padrão em escada" na eletroforese em gel de agarose. Adcionalmente, a imunoexpressão de caspase-3, Bax e Bcl-2 foram observadas em todas as amostras. Entretanto, a proteína caspase-3 apresentou marcação mais intensa em todos os tempos gestacionais, quando comparada com a marcação das proteínas Bcl-2 e Bax. Esses resultados confirmam e reforçam a importância da apoptose na maturação placentária. Além disto, indica que caspase-3, Bax e Bcl-2 estão envolvidas nos mecanismos de ativação da apoptose pela via intrínseca mitocondrial ao longo da gestação, contribuindo para o equilíbrio fisiológico da celularidade e renovação celular na placenta bovina.

Intercorrência entre leucose enzoótica e brucelose em búfalos (Bubalus bubalis) em sistema de produção extensivo

Objetivou-se com este estudo avaliar a intercorrência entre leucose enzoótica e brucelose em búfalos (Bubalus bubalis) em sistema de produção extensivo, pelo estabelecimento da prevalência de bubalinos reagentes às provas diagnósticas específicas. Foram analisados sorologicamente 232 animais, pela técnica de imunodifusão dupla em gel de agarose para diagnóstico de leucose enzoótica e o teste do antígeno acidificado tamponado, seguida pelos testes confirmatórios 2-mercaptoetanol e soroaglutinação lenta em tubos para diagnóstico de brucelose. As prevalências de búfalos que apresentaram positividade para leucose e brucelose foram 4,21% (10/232) e 5,18% (12/232), respectivamente. Os resultados obtidos nesta pesquisa permitiram concluir que as infecções estudadas encontram-se presentes na população avaliada, entretanto, com baixa prevalência e sem dependência de ocorrência entre ambas.

Cloning, expression and purification of recombinant streptokinase: partial characterization of the protein expressed in Escherichia coli

We cloned the streptokinase (STK) gene of Streptococcus equisimilis in an expression vector of Escherichia coli to overexpress the profibrinolytic protein under the control of a tac promoter. Almost all the recombinant STK was exported to the periplasmic space and recovered after gentle lysozyme digestion of induced cells. The periplasmic fraction was chromatographed on DEAE Sepharose followed by chromatography on phenyl-agarose. Active proteins eluted between 4.5 and 0% ammonium sulfate, when a linear gradient was applied. Three major STK derivatives of 47.5 kDa, 45 kDa and 32 kDa were detected by Western blot analysis with a polyclonal antibody. The 32-kDa protein formed a complex with human plasminogen but did not exhibit Glu-plasminogen activator activity, as revealed by a zymographic assay, whereas the 45-kDa protein showed a Km = 0.70 µM and kcat = 0.82 s-1, when assayed with a chromogen-coupled substrate. These results suggest that these proteins are putative fragments of STK, possibly derived from partial degradation during the export pathway or the purification steps. The 47.5-kDa band corresponded to the native STK, as revealed by peptide sequencing

Use of a cysteine proteinase from Carica candamarcensis as a protective agent during DNA extraction

We describe the use of a plant cysteine proteinase isolated from latex of Carica candamarcensis as a protective agent during isolation of bacterial DNA following growth in culture of these cells. Between 100 to 720 units of proteinase (1 µg = 6 units) afforded good DNA protection when incubated with various kinds of microorganisms. Agarose gel electrophoresis showed that the resulting DNA was similar in size to DNA preparations obtained by treatment with proteinase K. The viability of the resulting material was checked by PCR amplification using species-specific primers. After standing at room temperature (25oC) for 35 days, the enzyme lost 10% of its initial activity. The enzyme stability and good yield of DNA suggest the use of this proteinase as an alternative to proteinase K.

Human group C rotavirus in children with diarrhea in the Federal District, Brazil

Group C rotaviruses are fastidious in their in vitro cell culture requirements. Recent serosurveys indicate that antibody to group C rotavirus is present in 3-45% of the human population in certain geographic locations, suggesting that rotavirus group C infection is more prevalent than previously believed and that the low rate of detection of these agents is probably due to the lack of sensitive diagnostic assays. From March to December 1994, 406 fecal specimens were collected from children under five years of age who were outpatients at the emergency services of nine public hospitals in Brasília, Federal District, Brazil. In addition to the samples from children, one public outpatient unit requested virological investigation of a stool sample from an HIV-seropositive adult male with diarrhea of sudden onset. All samples were analyzed by enzyme immunoassay for group A rotavirus and adenovirus (EIARA) and by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). One hundred and seven (26%) were positive for group A rotavirus. Four samples from children and the sample from the HIV-seropositive patient, although negative by EIARA, showed a group C rotavirus profile by PAGE and were positive for rotavirus by electron microscopy. Using specific VP6 and VP7 primers for group C rotavirus, a reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed and products were detected by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. These products were confirmed to be specific for group C rotavirus by using digoxigenin-oligonucleotide probes, Southern hybridization and chemiluminescent detection. The five positive group C rotavirus samples were detected in August (3 samples) and September (2 samples). To the best of our knowledge, this is the first report of group C rotavirus detected in the Federal District, Brazil and in an HIV-seropositive patient with acute gastroenteritis.

Detection and analysis of apoptosis in peripheral blood cells from breast cancer patients

Apoptosis is a well-known specific process of cell death that normally occurs in physiological situations such as tissue or organ development and involution. During tumor growth there is a balance between proliferation and cell death which involves apoptotic mechanisms. In the present study genomic DNAs from 120 breast tumor biopsies were analyzed by agarose gel electrophoresis and none of them presented the fragmentation pattern characteristic of the apoptosis process. However, 33% of the 105 breast cancer patients clearly showed the apoptotic pattern when DNA from blood cells was analyzed. None of the DNAs from healthy volunteer blood cells showed any trace of apoptosis. Since the breast cancer patients were not receiving chemo- or hormone therapy, the possible relationship between blood cortisol levels and the apoptotic pattern found in patient blood cells was investigated. Using a chemoluminescence immunodetection assay, similar cortisol levels were observed in breast cancer patient sera presenting or not apoptotic blood cells and in healthy volunteer sera. Analysis of the clinical data obtained from 60 of these patients showed that patients bearing tumors of smaller size (under 20 mm) were more susceptible to the apoptotic effect in blood cells. According to the Elston grade, it was observed that 7 of 12 patients with grade III tumors (58%) presented apoptotic peripheral blood cells, in contrast to 10 of 48 patients with grade I and grade II tumors. These observations may reflect the immunosuppression characteristic of some breast cancer patients, which may contribute to tumor growth. Therefore, further studies are necessary to elucidate the factor(s) involved in such massive blood cell death.