Molecular characterization of Brazilian strains of Xanthomonas campestris pv. viticola by rep-PCR fingerprinting

Bacterial canker of grapevine (Vitis vinifera), caused by Xanthomonas campestris pv. viticola was first detected in Brazil in 1998, affecting grapevines in the São Francisco river basin, state of Pernambuco. The disease was also reported in Juazeiro, Bahia and later in Piauí and Ceará. Due to its limited geographical distribution and relatively recent detection in Brazil, very little is known about the pathogen's biology and diversity. Repetitive DNA based-PCR (rep-PCR) profiles were generated from purified bacterial DNA of 40 field strains of X. campestris pv. viticola, collected between 1998 and 2001 in the states of Pernambuco, Bahia and Piauí. Combined analysis of the PCR patterns obtained with primers REP, ERIC and BOX, showed a high degree of similarity among Brazilian strains and the Indian type strain NCPPB 2475. Similar genomic patterns with several diagnostic bands, present in all strains, could be detected. Fingerprints were distinct from those of strains representing other pathovars and from a yellow non-pathogenic isolate from grape leaves. The polymorphism observed among the Brazilian strains allowed their separation into five subgroups, although with no correlation with cultivar of origin, geographic location or year collected.

A Semi-Selective agar medium to detect the presence of Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum in naturally infected cotton seed

A semi-selective agar medium was developed for detection of Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam) in cotton (Gossypium hirsutum) seed. The basic medium was peptone-sucrose-agar (PSA). Criteria for the semi-selective medium were the typical colony characters of Xam and its pathogenicity on cotton. Several systemic fungicides and antibiotics in different concentrations were tested alone or in combination with others. The final composition of the semi-selective agar medium was established after several attempts in order to inhibit most of the fungal and bacterial saprophytes and favour the development of Xam. It contained PSA + cyclohexamide, cephalexin, pencycuron, triadimenol and tolylfluanid. The bacteria were recovered from naturally infected seeds by the direct plating of 2,000 surface disinfected seeds on the semi-selective medium. The recovery of the pathogen from naturally infected leaf tissues and in dilution plating, on semi-selective medium and on nutrient agar, were comparable. Among the three detection methods tested, the semi-selective medium was found to be the most reliable and quantifiable. Degree of severity of angular leaf spot in the field was not always correlated with the level of infection in the seed. This is the first report of a semi-selective agar medium to detect the presence of Xam in naturally infected cotton seed.

Sobrevivência e viabilidade de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão armazenadas sob condições controladas

O estabelecimento de bancos de sementes para conservação ex situ de germoplasma vegetal é largamente utilizado, mas a contaminação das mesmas por fitopatógenos pode comprometer sua integridade. Este trabalho teve por objetivo monitorar a sobrevivência de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, em um lote de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris) cv. Roxão)submetido a três condições de temperatura, durante 60 meses de armazenamento: -18 e 5 ºC, condições preconizadas para a conservação de material genético vegetal a longo e médio prazo, respectivamente, e à temperatura ambiente (20-30 ºC). A sobrevivência da bactéria foi avaliada pela percentagem de sementes contaminadas e a viabilidade pela manutenção da patogenicidade dos isolados. A população de X. axonopodis pv. phaseoli nas sementes foi quantificada ao final de cinco anos de armazenamento. Os resultados mostraram que a percentagem de sementes contaminadas decresceu de 64 para 36-37% nos primeiros seis meses, para os três tratamentos. A partir de 30 meses observou-se que as sementes conservadas a -18 e 5 ºC apresentaram níveis de contaminação (58 e 72%) que diferiram significativamente das conservadas à temperatura ambiente (20%), e aos 60 meses taxas de 46%, 46% e 8%, respectivamente. A temperatura mais propícia à sobrevivência da bactéria foi 5 ºC em que se encontrou uma população máxima de 1,2 x 10(8) ufc/semente. Constatou-se, igualmente, a manutenção do poder infetivo dos isolados durante todo o armazenamento. Pode-se concluir que as condições ótimas para a conservação de sementes são as mesmas para a manutenção da longevidade de X. axonopodis pv. phaseoli.

Mecanismo genético de resistência em três cultivares de algodoeiro a Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum

A mancha angular do algodoeiro (Gossypium hirsutum) causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam) é uma doença de importância econômica para o Brasil, e sua severidade depende de fatores climáticos e da cultivar. A doença não é controlada por produtos químicos sendo que seu controle depende da utilização de sementes sadias, e resistência varietal. DeltaOPAL, EPAMIG Liça, e Fibermax 986 são importantes fontes de resistência a Xam, pois além de resistência, apresentam boas características agronômicas. O objetivo do presente trabalho foi estudar o mecanismo de resistência à mancha angular envolvendo cruzamentos entre as três cultivares resistentes e a suscetível BRS Ita 90, em casa de vegetação. Populações parentais, F1 e F2 foram avaliadas após inoculação com um isolado agressivo de Xam. As três cultivares apresentaram mecanismos diferentes de resistência. Nas cultivares DeltaOPAL e EPAMIG Liça a resistência é conferida por um gene dominante, enquanto que em Fibermax 986, a resistência é dada por dois genes dominantes, independentes e complementares.

Métodos de preservação e crescimento de Xanthomonas campestris pv. viticola em meio de cultura variando temperatura, pH e concentração de NaCl

A bactéria fitopatogênica Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) causa o cancro bacteriano da videira (Vitis vinifera), que ocasiona grandes prejuízos à viticultura no Brasil. Os métodos de dessecação em papel de filtro (DPF), repicagens periódicas (RP), água destilada esterilizada (ADE) e folhas herborizadas (FH) foram utilizados para preservar duas estirpes de Xcv durante 12 meses. As variáveis viabilidade e patogenicidade foram avaliadas mensalmente e estimadas pela obtenção de crescimento bacteriano e área abaixo da curva de incidência da doença (AACID). Tanto o método de DPF como o de ADE propiciaram viabilidade constante de 100% durante 11 meses e os maiores valores de AACID. No método de RP não houve crescimento das estirpes já aos 30 dias, enquanto que, em FH, Xcv foi isolada até cinco meses. o crescimento das estirpes de Xcv em meio de cultura líquido variando temperatura (0, 5, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40 e 45 °C), pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 e 9,0) e concentração de NaCl (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7%) foi avaliado em fotocolorímetro. O crescimento de Xcv foi observado no intervalo de 5 até 35 °C, enquanto que o crescimento ótimo ocorreu de 27 a 29 °C. A Xcv não cresceu a zero e 40 °C. O pH ótimo para o crescimento desta bactéria foi 7,5. O crescimento de Xcv decresceu a partir de 3,0% de NaCl, com concentração letal de 6,0%.

Acibenzolar-S-Metil e Ecolife® na indução de respostas de defesa do tomateiro contra a mancha bacteriana (Xanthomonas vesicatoria)

Foi investigada a eficácia comparativa da pulverização foliar em tomateiro de acibenzolar-S-metil (ASM) e Ecolife® na proteção contra Xanthomonas vesicatoria, bem como avaliada a ativação de algumas respostas bioquímicas de defesa de planta. Plantas de tomateiro cv. Santa Cruz Kada foram pulverizadas com acibenzolar S-metil (0,2 g l-1 ASM) e uma formulação natural proveniente de biomassa cítrica denominada Ecolife® (5 ml l-1). Quatro dias após as pulverizações, as plantas foram inoculadas com um isolado patogênico de Xanthomonas vesicatoria. Em experimentos de quantificação de doença, a pulverização foliar de Ecolife® e ASM conferiu 39,2% e 47,7% de proteção, respectivamente. A resistência induzida em plantas pulverizadas com ASM e Ecolife® foi evidenciada pelo aumento da atividade de peroxidases (POX) e oxidases de polifenóis (PPO), iniciado logo às primeiras horas após as pulverizações, continuando até 12 dias de avaliação. A despeito da tendência de queda nas atividades de amônia-liases de fenilalanina (PAL) a partir de 3 dias após as pulverizações, plantas tratadas com ASM e Ecolife® tiveram discreto aumento no acúmulo de lignina, principalmente aquelas pulverizadas com Ecolife® e inoculadas com X. vesicatoria. Teores de fenóis solúveis totais decresceram significativamente, 9 e 12 dias após pulverizações. O aumento nas atividades de POX e PPO poderia resultar em lignificação, a qual estaria associada a uma estratégia de defesa do tomateiro contra a mancha bacteriana.

Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão em meio de cultura semi seletivo

Para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em extratos de sementes inteiras e moídas de feijão, naturalmente contaminadas e sadias foram utilizados os meio de cultura semi-seletivos XCP1 e MT e o não seletivo 523 de Kado & Hesket. Os extratos de sementes foram também inoculados em folhas primárias de feijoeiro. O meio de cultura semi-seletivo XCP1 foi o mais eficiente na quantificação e detecção de Xap em extratos de sementes inteiras de feijão. Os extratos de sementes contaminadas, inoculados nas folhas primárias de feijoeiro produziram sintomas do crestamento bacteriano comum.

Natural variability in Arabidopsis thaliana germplasm response to Xanthomonas campestris pv. campestris

This work aimed to study the interaction between the model plant Arabidopsis thaliana and Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), the pathogen responsible for black rot of crucifers. The response of 32 accessions of A. thaliana to the Brazilian isolate of Xcc CNPH 17 was evaluated. No immunity-like response was observed. "CS1308", "CS1566" and "CS1643" grown in continuous light were among the accessions that showed strongest resistance when inoculated with 5 x 10(6) CFU/mL. In contrast, "CS1194" and "CS1492" were among the most susceptible accessions. Similar results were obtained when plants were grown under short-day conditions. To quantify the differences in disease symptoms, total chlorophyll was extracted from contrasting accessions at different time points after inoculation. Chlorophyll levels from controls and Xcc inoculated plants showed a similar reduction in resistant accessions, whereas Xcc-inoculated susceptible accessions showed a greater reduction compared to controls. To test the specificity of resistance, accessions CS1308, CS1566, CS1643 and CS1438 (which showed partial resistance to CNPH 17), were inoculated with a more aggressive isolate of Xcc (CNPH 77) and Ralstonia solanacearum. Among the accessions tested, "CS1566" was the most resistant to Xcc CNPH 77 and also displayed resistance to R. solanacearum. Accessions CS1308, CS1566 and CS1643 were also inoculated with a high titer of Xcc CNPH 17 (5 x 10(8) CFU/mL). No collapse of tissue was observed up to 48 h after inoculation, indicating that a hypersensitive response is not involved in the resistance displayed by these accessions.

Hospedeiros alternativos de Xanthomonas campestris pv. viticola

Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), que causa o cancro bacteriano da videira, sobrevive em plantas infectadas, epifiticamente em órgãos da parte aérea e pode ser veiculada em mudas e/ou bacelos infectados. O trabalho teve como objetivo investigar possíveis hospedeiros alternativos do patógeno, visando fornecer subsídios para o manejo da doença. A partir das plantas invasoras Alternanthera tenella, Amaranthus sp., Glycine sp. e Senna obtusifolia com sintomas similares aos do cancro bacteriano da videira, coletadas em parreirais de Juazeiro e Petrolina, no Submédio São Francisco, foram isoladas bactérias semelhantes a Xcv. No entanto, nenhuma bactéria foi isolada de plantas de Commelina benghalensis e Azadirachta indica com sintomas semelhantes. A patogenicidade dos isolados bacterianos obtidos foi confirmada em plantas de A. tenella, Amaranthus sp., Glycine sp., S. obtusifolia e em mudas de videira cv. Red Globe, em condições de casa de vegetação. As plantas invasoras Chamaesyce hirta, Dactyloctenium aegyptium, Eragrostis pilosa e Pilea sp., inoculadas artificialmente com os isolados Xcv1 e UnB1216, também desenvolveram sintomas típicos do cancro bacteriano.

Caracterização dos danos pós-colheita em citros procedentes de "packinghouse"

As doenças pós-colheita representam um sério obstáculo à citricultura, uma vez que comprometem a qualidade e quantidade dos frutos colhidos. Este trabalho objetivou caracterizar as injúrias pós-colheita de frutos de laranja 'Pêra', 'Lima' e 'Natal' e de tangor 'Murcott', destinados ao mercado interno, após diferentes etapas do beneficiamento em "packinghouse". Foram coletados cem frutos na chegada ao "packinghouse", na banca de embalagem e no palete, após embalamento em caixas de madeira. Os frutos foram individualizados e submetidos à câmara úmida por 24 horas, permanecendo por mais 20 dias a 25ºC e 85% de umidade relativa. A incidência de podridões foi avaliada visualmente após a retirada da câmara úmida e a cada três dias. Os patógenos fúngicos encontrados tiveram a patogenicidade confirmada através da inoculação em frutos sadios. Não houve diferença significativa na incidência de doenças pós-colheita nas diferentes fases do processamento nas variedades Lima e Natal. Na variedade Pêra e no tangor 'Murcott', a incidência de doenças foi menor nas amostras coletadas na chegada ao "packinghouse". O bolor verde (Penicillium digitatum) foi a principal doença encontrada nos diferentes frutos cítricos. Outras doenças importantes foram a antracnose (Colletotrichum gloeosporioides), as podridões pedunculares (Lasiodiplodia theobromae e Phomopsis citri) e a podridão azeda (Geotrichum candidum).

Gramíneas hospedeiras de Xanthomonas sp., agente causal da falsa estria vermelha da cana-de-açúcar

Falsa estria vermelha (FEV), uma nova doença causada por Xanthomonas sp., é diferente diferente de todas as outras doenças já descritas em cana-de-açúcar. Ela está distribuída por toda as principais regiões canavieiras do centro-sul do Brasil, mas ainda não foi detectada no norte e nordeste do Brasil nem em qualquer outro país. O presente estudo determinou a gama de culturas e plantas daninhas hospedeiras da bactéria dentre espécies pertencentes às gramíneas, através de inoculação por injeção e pulverização de suspensão bacteriana. Além da cana-de-açúcar, entre as 31 diferentes espécies estudadas, apenas sorgo, milho e aveia apresentaram sintomas, 15 dias após a inoculação. Em sorgo, no ponto de inoculação, apareceram estrias avermelhadas coalescentes. As folhas apresentaram típicas estrias vermelhas finas (1 mm), longas e paralelas às nervuras, com presença de exsudato bacteriano. Até mesmo as inflorescências apresentaram pontuações avermelhadas. Plantas de milho inoculadas com seringa apresentaram sintomas de anasarca e descoloração de tecidos ao redor do ponto de inoculação e estrias cloróticas (2-3 mm) no limbo foliar; porém, sem exsudato de bactéria. Apenas folhas de cevada apresentaram sintomas quando inoculadas por pulverização. As lesões iniciais eram estrias e manchas de cor palha, evoluindo para uma necrose total das folhas, causando a morte das plantas. A partir de folhas sintomáticas de cana-de-açúcar, sorgo, milho e aveia, realizaram-se re-isolamentos, obtendo-se culturas puras de Xanthomonas sp. cuja identidade foi comprovada através de testes sorológicos e por Rep-PCR. Diante desses resultados, surge a necessidade de realização de inspeções e campos de cultivo de sorgo, milho e aveia para verificar a presença da bactéria da FEV e determinar se o patógeno pode infectar essas culturas naturalmente.

Genes diferencialmente expressos em cana-de-açúcar inoculada com Xanthomonas albilineans, o agente causal da escaldadura da folha

A escaldadura da folha, causada pela bactéria Xanthomonas albilineans colonizadora do xilema, é uma das principais doenças da cana-de-açúcar. A sintomatologia na fase crônica é caracterizada principalmente pelo aparecimento de uma faixa branca paralela à nervura central da folha, que evolui até queimar totalmente, sendo também observado brotação de gemas laterais no colmo. Neste trabalho, a técnica de macroarranjos de cDNA foi empregada para o estudo da expressão de 3.575 ESTs (espressed sequence tags) em folhas de cana-de-açúcar. Foram utilizadas duas variedades, uma resistente (SP82-1176) e outra suscetível (SP78-4467) a Xanthomonas albilineans as quais foram infectadas mecanicamente por ferimentos. As membranas dos macroarranjos foram confeccionadas a partir de ESTs de bibliotecas de folha e cartucho de cana-de-açúcar provenientes do projeto SUCEST e hibridizadas contra sondas de cDNA de plantas infectadas e controle marcadas com isótopos radioativos. Analisando os resultados dos macroarranjos foi possível verificar um comportamento diferenciado para cada variedade durante o ataque do patógeno. Após realizadas análises estatísticas identificamos na variedade resistente ESTs com expressão induzida relacionadas com biossíntese de isoprenoides, proteínas LRR transmembrânica, "ziper" de leucina, lignificação, tolerância ao frio, diferenciação de plastídeos, sistemas de defesa e de adaptação da planta ao meio ambiente. As ESTs reprimidas na variedade resistente foram àquelas relacionadas com genes responsáveis pela síntese de proteínas do controle da expansão da parede celular, detoxificação e transporte de auxina. Na variedade susceptível foram reprimidas ESTs relacionadas a genes de proteínas das respostas de defesa da planta, biossíntese de Etileno e regulação da transcrição.

Development of a molecular method for detection and identification of Xanthomonas campestris pv. viticola

In order to develop a molecular method for detection and identification of Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) the causal agent of grapevine bacterial canker, primers were designed based on the partial sequence of the hrpB gene. Primer pairs Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R, which amplified 243- and 340-bp fragments, respectively, were tested for specificity and sensitivity in detecting DNA from Xcv. Amplification was positive with DNA from 44 Xcv strains and with DNA from four strains of X. campestris pv. mangiferaeindicae and five strains of X. axonopodis pv. passiflorae, with both primer pairs. However, the enzymatic digestion of PCR products could differentiate Xcv strains from the others. None of the primer pairs amplified DNA from grapevine, from 20 strains of nonpathogenic bacteria from grape leaves and 10 strains from six representative genera of plant pathogenic bacteria. Sensitivity of primers Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R was 10 pg and 1 pg of purified Xcv DNA, respectively. Detection limit of primers RST2/Xcv3R was 10(4) CFU/ml, but this limit could be lowered to 10² CFU/ml with a second round of amplification using the internal primer Xcv1F. Presence of Xcv in tissues of grapevine petioles previously inoculated with Xcv could not be detected by PCR using macerated extract added directly in the reaction. However, amplification was positive with the introduction of an agar plating step prior to PCR. Xcv could be detected in 1 µl of the plate wash and from a cell suspension obtained from a single colony. Bacterium identity was confirmed by RFLP analysis of the RST2/Xcv3R amplification products digested with Hae III.

Efeitos do Banana streak virus no desenvolvimento de cultivares de bananeira

Este trabalho avaliou, em condições de casa de vegetação, os efeitos da infecção pelo BSV no crescimento de cinco cultivares de bananeira. Mudas micropropagadas das cultivares SH 3640, FHIA 18, Caipira, Thap Maeo e Pioneira foram inoculadas com BSV pela cochonilha Planacoccus citri Risso. Como controles utilizaram-se mudas não inoculadas e inoculadas com cochonilhas não virulíferas. Avaliou-se a altura das plantas, o diâmetro do pseudocaule, o número de folhas, a área foliar e as massas da matéria seca da parte aérea e da raiz. Os primeiros sintomas do BSV foram detectados 15 dias após a inoculação em todas as plantas inoculadas com o vírus. Houve diferenças estatísticas significativas nas variáveis analisadas, concluindo-se que o vírus afetou o desenvolvimento das plantas de todas as cultivares avaliadas.