RFLP analysis of a PCR-amplified fragment of the 16S rRNA gene as a tool to identify Enterococcus strains

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of a PCR-amplified fragment of the 16S rRNA gene was performed on reference strains belonging to 21 different enterococcal species and on 75 Enterococcus isolates recovered from poultry meat, pasteurised milk and fresh cheese. PCR amplification generated a 275 bp fragment, which was digested with three restriction endonucleases (DdeI, HaeIII, HinfI). The strains were divided into five groups (groups A-E) on the basis of their restriction patterns. Five biochemical tests (arabinose, arginine, manitol, methyl-β-D-glucopyranoside and raffinose) were then performed in addition to RFLP analysis to narrow the identification of enterococcal strains to the species level. PCR-RFLP, in conjunction with the selected biochemical tests, allowed the precise identification of the 21 species of Enterococcus included in the present study. This proposed method is relatively simple and rapid and can be useful as an adjunct tool for accurate identification of Enterococcus.

In vitro and in vivo effects of Enterococcus faecalis CECT7121 on Toxocara canis

The aim of the present paper was to evaluate the larvicidal effect of Enterococcus faecalis CECT7121 (Ef7121) on the Toxocara canis cycle both in vitro and in vivo. For the in vitro experiments, T. canis larvae were incubated with the supernatants of Ef7121 (EI) and mutant Ef7121 (EIm), in a pre-culture of Ef7121 (EII) and in a fresh culture with Ef7121 (EIII) and the Ef7121 mutant strain (EIIIm). The viability of the larvae was calculated after a 48 h incubation. A significant reduction of the viability of T. canis larvae was observed in EI, EII and EIII. A decrease of this inhibitory effect was observed in EIm and EIIIm (p = 0.008). In the in vivo experiments, mice were orally inoculated with three doses of Ef7121. To study the probiotic persistence in the intestine, the animals were sacrificed every four days and their intestines were dissected. The initial average bacterial levels were 9.7 x 10(4) for Ef7121 (colony forming units/g). At the end of the assay the levels were 1.46 x 10(4). No bacterial translocation was detected in mesenteric lymphatic nodules and spleen. Ef7121 interference with the biological cycle was evaluated in mice challenged with T. canis. The interference was significant when the mice were challenged with probiotic and T. canis simultaneously (p = 0.001), but it was not significant when the challenge was performed 15 days after administration of the bacterial inoculum (p = 0.06). In conclusion, Ef7121 possessed in vitro and in vivo larvicidal activity.

Emergence and characterisation of vanB vancomycin-resistant Enterococcus faecalis in Rio de Janeiro, Brazil

Here we describe the detection and characterisation of three isolates of vancomycin-resistant VanB-type Enterococcus faecalis. Sequence analysis suggested that these isolates harboured the vanB1 gene. The isolates were susceptible to the majority of antimicrobial agents tested, with the exception of chloramphenicol, erythromycin and vancomycin, and showed distinct profiles of high-level resistance to aminoglycosides. Analysis of the clonal relatedness of the vanB E. faecalis isolates showed similar pulsed-field gel electrophoresis profiles. To our knowledge, this is the first report of the occurrence of enterococcal strains carrying vanB genes in Brazil.

Detection of vanC 1 gene transcription in vancomycin-susceptible Enterococcus faecalis

Here we report the presence and expression levels of the vanC 1 and vanC 2/3 genes in vancomycin-susceptible strains of Enterococcus faecalis. The vanC 1 and vanC 2/3 genes were located in the plasmid DNA and on the chromosome, respectively. Specific mRNA of the vanC 1 gene was detected in one of these strains. Additionally, analysis of the vanC gene sequences showed that these genes are related to the vanC genes of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus. The presence of vanC genes is useful for the identification of E. gallinarum and E. casseliflavus. Moreover, this is the first report of vanC mRNA in E. faecalis.

Presence of virulence factors in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium susceptible and resistant to vancomycin

Despite the increasing importance of Enterococcus as opportunistic pathogens, their virulence factors are still poorly understood. This study determines the frequency of virulence factors in clinical and commensal Enterococcus isolates from inpatients in Porto Alegre, Brazil. Fifty Enterococcus isolates were analysed and the presence of the gelE, asa1 and esp genes was determined. Gelatinase activity and biofilm formation were also tested. The clonal relationships among the isolates were evaluated using pulsed-field gel electrophoresis. The asa1, gelE and esp genes were identified in 38%, 60% and 76% of all isolates, respectively. The first two genes were more prevalent in Enterococcus faecalis than in Enterococcus faecium, as was biofilm formation, which was associated with gelE and asa1 genes, but not with the esp gene. The presence of gelE and the activity of gelatinase were not fully concordant. No relationship was observed among any virulence factors and specific subclones of E. faecalis or E. faecium resistant to vancomycin. In conclusion, E. faecalis and E. faecium isolates showed significantly different patterns of virulence determinants. Neither the source of isolation nor the clonal relationship or vancomycin resistance influenced their distribution.

Oxidative stress enhances the expression of sulfur assimilation genes: preliminary insights on the Enterococcus faecalis iron-sulfur cluster machinery regulation

The Firmicutes bacteria participate extensively in virulence and pathological processes. Enterococcus faecalis is a commensal microorganism; however, it is also a pathogenic bacterium mainly associated with nosocomial infections in immunocompromised patients. Iron-sulfur [Fe-S] clusters are inorganic prosthetic groups involved in diverse biological processes, whose in vivo formation requires several specific protein machineries. Escherichia coli is one of the most frequently studied microorganisms regarding [Fe-S] cluster biogenesis and encodes the iron-sulfur cluster and sulfur assimilation systems. In Firmicutes species, a unique operon composed of the sufCDSUB genes is responsible for [Fe-S] cluster biogenesis. The aim of this study was to investigate the potential of the E. faecalis sufCDSUB system in the [Fe-S] cluster assembly using oxidative stress and iron depletion as adverse growth conditions. Quantitative real-time polymerase chain reaction demonstrated, for the first time, that Gram-positive bacteria possess an OxyR component responsive to oxidative stress conditions, as fully described for E. coli models. Likewise, strong expression of the sufCDSUB genes was observed in low concentrations of hydrogen peroxide, indicating that the lowest concentration of oxygen free radicals inside cells, known to be highly damaging to [Fe-S] clusters, is sufficient to trigger the transcriptional machinery for prompt replacement of [Fe-S] clusters.

The first report of the vanC1 gene in Enterococcus faecium isolated from a human clinical specimen

The vanC1 gene, which is chromosomally located, confers resistance to vancomycin and serves as a species marker for Enterococcus gallinarum. Enterococcus faecium TJ4031 was isolated from a blood culture and harbours the vanC1gene. Polymerase chain reaction (PCR) assays were performed to detect vanXYc and vanTc genes. Only the vanXYc gene was found in the E. faecium TJ4031 isolate. The minimum inhibitory concentrations of vancomycin and teicoplanin were 2 µg/mL and 1 µg/mL, respectively. Real-time reverse transcription-PCR results revealed that the vanC1and vanXYc genes were not expressed. Pulsed-field gel electrophoresis and southern hybridisation results showed that the vanC1 gene was encoded in the chromosome. E. faecalis isolated from animals has been reported to harbour vanC1gene. However, this study is the first to report the presence of the vanC1gene in E. faecium of human origin. Additionally, our research showed the vanC1gene cannot serve as a species-specific gene of E. gallinarum and that it is able to be transferred between bacteria. Although the resistance marker is not expressed in the strain, our results showed that E. faecium could acquire the vanC1gene from different species.

Efeito de repelência do inseticida deltamethrin sobre insetos de raças resistentes e suscetíveis de Rhyzopertha dominica (F.) (Coleoptera, Bostrichidae) em grãos de trigo armazenado

Rhyzopertha dominica (F.) foi submetida a estudos de repelência ao inseticida deltamethrin aplicado em grãos de trigo, em laboratório. Foram testadas quatro raças de R. dominica, duas resistentes ao deltamethrin, BR6 e BR12, e duas suscetíveis, BR4 e UK1, coletadas em unidades armazenadoras de grãos e mantidas em multiplicação em laboratório. O experimento foi realizado em quatro repetições, liberando-se 100 insetos, por repetição, em um pote de plástico contendo grãos de trigo não tratados; esse pote ficava conectado a outro de mesmo tamanho contendo grãos de trigo tratados com CL5, CL25 e CL50 do inseticida deltamethrin, separadamente, para cada raça. O conjunto foi mantido na posição horizontal, de forma a permitir a livre passagem dos insetos entre os dois compartimentos, a 25±1ºC e 60±5% de temperatura e de umidade relativa do ar, respectivamente. A avaliação da distribuição dos insetos no interior dos potes ocorreu 12 dias após sua liberação. Os insetos evitaram os grãos tratados com todas as concentrações de deltamethrin, indicando o efeito de repelência que o inseticida exerce sobre eles. No caso das raças suscetíveis, a diferença não foi significativa entre o número de indivíduos nas porções tratadas e não tratadas, nas diferentes concentrações. Por outro lado, os indivíduos das raças resistentes apresentaram um comportamento de repelência significativamente mais acentuado que os das suscetíveis, especialmente nas concentrações mais elevadas. O estudo dessas respostas comportamentais é fundamental para a tomada de decisões em programas de manejo da resistência de insetos de produtos armazenados.

Seleção de clones de batata-doce resistentes a insetos de solo

O objetivo deste trabalho foi selecionar clones comerciais de batata-doce para a região do Triângulo Mineiro. Dos clones avaliados, 60 foram obtidos por policruzamentos e cedidos pela Universidade Federal de Lavras (UFLA), três, entre produtores rurais dos municípios de Araguari, Uberlândia e Machado, todos do Estado de Minas Gerais, e outros nove foram usados como testemunhas (Brazlândia Branca, Brazlândia Rosada, Surpresa, Rio Doce, Morena Roxa, Coquinho, Arroba, Pira 1 e o Clone 042). O experimento foi instalado no espaçamento de 1,10 x 0,45 m, utilizando-se o delineamento blocos casualizados, com 72 tratamentos, quatro repetições e 16 plantas por parcela. Entre os clones avaliados 32,8% apresentaram alta ou moderada resistência a insetos de solo. O clone 95041 foi o mais produtivo, com 28.048,96 kg/ha. Os clones 95009, 95010, 95014, 95020, 95033, 95042 e 95057 foram altamente resistentes a insetos de solo.

Variantes somaclonais da cultivar de arroz Bluebelle resistentes à brusone

A brusone, causada por Pyricularia grisea, constitui fator limitante da produtividade do arroz irrigado, principalmente no Estado do Tocantins. A detecção de variabilidade genética quanto à resistência à brusone em cultivares suscetíveis, como a Bluebelle, considerada uma das cultivares-padrões quanto à qualidade dos grãos, foi o principal objetivo deste trabalho. O procedimento adotado incluiu a indução de calos provenientes de panículas imaturas, regeneração, avaliação e seleção das plantas R2 resistentes à doença. O mesmo procedimento foi utilizado para nova indução de calos e regeneração de plantas a partir de três plantas R2 selecionadas. Foi realizada a avaliação e a seleção de plantas resistentes nas gerações R2 e R4 em viveiro de brusone. Nos testes realizados em casa de vegetação com três isolados coletados da cultivar Metica1, pertencentes aos patótipos IB41 e IB45 de P. grisea, todos os 47 somaclones R6 foram resistentes. Por outro lado, os somaclones apresentaram reações diferenciais frente a cinco isolados provenientes de somaclones da cultivar Bluebelle, e resistência a um isolado proveniente da cultivar Bluebelle, enquanto a cultivar Bluebelle foi suscetível a todos os isolados. Estes resultados indicaram variação genética no que diz respeito à resistência à brusone, na segunda fase de indução de calos e na regeneração de plantas. Dos 47 somaclones R6, 22 apresentaram alto grau de resistência vertical nos testes conduzidos nos viveiros de brusone em quatro locais, e poderão ser utilizados como novas fontes de resistência.

Somaclones da cultivar de arroz aromático Basmati-370 resistentes à brusone

A cultivar de arroz aromático Basmati-370 é uma das preferidas no mercado mundial. Possui aroma agradável, grão extra-fino, e característica de alongamento após o cozimento; porém, é suscetível a alguns patótipos de Pyricularia grisea no Brasil. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o grau de resistência à brusone, e algumas características agronômicas nas gerações avançadas de seus somaclones. Foram estudadas gerações R5 a R9, no campo, em viveiro de brusone e em casa de vegetação. Não foram observadas variações significativas na qualidade de grãos e outras características agronômicas. Entretanto, alguns somaclones apresentaram alto grau de resistência à brusone. Foram registrados no Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa-Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão 19 somaclones como novas fontes de arroz aromático. Dois somaclones, SCBAS04 e SBAS16, exibiram alto grau de resistência à brusone, e foram superiores à cultivar Basmati-370 quanto ao aroma.

Padrão eletroforético de proteínas resistentes ao calor em sementes de milho

Na aquisição e manutenção da tolerância à dessecação de sementes, há vários mecanismos envolvidos, entre eles a indução das proteínas resistentes ao calor. O objetivo deste trabalho foi avaliar mudanças no padrão eletroforético das proteínas resistentes ao calor de sementes de milho submetidas a alta temperatura de secagem, associando-as à sua tolerância. Foram utilizadas sementes de linhagens, híbridos simples e híbridos recíprocos colhidas com teor de água de aproximadamente 35% e secadas a 45°C. Sementes das linhagens secadas à sombra foram utilizadas como controle e sua qualidade fisiológica foi avaliada por meio do teste de germinação. As proteínas resistentes ao calor foram extraídas de eixos embrionários das sementes em tampão Tris HCl 0,05 M. Não foi possível determinar uma banda específica da fração das proteínas resistentes ao calor que possa servir como marcador da tolerância à alta temperatura de secagem. Houve estabilidade nos padrões de bandas das proteínas provenientes de sementes submetidas à secagem artificial e natural, mesmo quando foram observadas variações nos valores de germinação. Os padrões eletroforéticos das proteínas resistentes ao calor foram semelhantes entre as sementes híbridas e os respectivos recíprocos.

Progênies superiores de soja resistentes ao tipo 3 do nematóide de cisto da soja

Os objetivos deste trabalho foram selecionar progênies superiores de soja e avaliá-las, em casa de vegetação, quanto à resistência ao nematóide tipo 3 de cisto da soja (Heterodera glycines). Foram avaliadas 222 progênies segregantes de soja, em ensaios conduzidos em campo, nos anos 1999/2000, 2000/2001 e 2001/2002, sob delineamento de blocos aumentados de Federer, e no ano 2002/2003 em blocos ao acaso, com duas repetições, tendo sido avaliados dez atributos agronômicos. No ano de 2003 foi conduzido em casa de vegetação um ensaio com 11 progênies superiores, para a avaliação de resistência ao nematóide de cisto, adotando-se delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições. Com relação aos atributos agronômicos, as progênies JAB 99-17-4-9-1 e JAB 99-40-12-1-2 destacaram-se das demais por possuir médias adequadas para a maioria dos atributos. Por sua vez, na avaliação de resistência em casa de vegetação, seis progênies revelaram-se resistentes ao nematóide de cisto da soja tipo 3.

Distância genética e geográfica entre acessos de picão-preto suscetíveis e resistentes a herbicidas inibidores da acetolactato sintase

O objetivo deste trabalho foi avaliar o grau de similaridade genética entre acessos de picão-preto, suscetíveis e resistentes aos herbicidas inibidores da enzima acetolactato sintase (ALS) e a relação entre similaridade genética e distância geográfica desses acessos. Sementes dos acessos foram coletadas no Estado do Paraná e cultivadas em casa de vegetação, na Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, em outubro de 2004. Depois da confirmação da resistência ou suscetibilidade dos acessos aos inibidores da enzima ALS, realizou-se a extração de DNA. Por meio da técnica de RAPD, foi possível avaliar a similaridade genética entre os acessos de picão-preto. Na análise conjunta dos acessos, dos 20 iniciadores utilizados, 17 apresentaram-se polimórficos, amplificando um total de 94 bandas. A similaridade genética média foi baixa e equivalente a 37%. A análise de regressão evidenciou que não há relação entre distância genética e geográfica nos acessos de picão-preto avaliados. A baixa similaridade geral entre esses acessos evidencia que a resistência aos herbicidas na região se configura pela seleção de indivíduos resistentes preexistentes na população.

Identificação de híbridos de citros resistentes à mancha-marrom-de-alternária por meio de fAFLP e testes de patogenicidade

O objetivo deste trabalho foi identificar híbridos, oriundos de hibridações controladas entre 'Folha Murcha' x 'Ponkan' e testá-los quanto à resistência a Alternaria alternata f. sp. citri. As plântulas foram obtidas via cultura in vitro de embriões. Utilizou-se o marcador molecular fAFLP para identificação dos híbridos e, em seguida, realizou-se o teste de patogenicidade nos híbridos com isolados de Alternaria alternata f. sp. citri, em condições de laboratório. Os pares de primers EcoRI AAG - MseI CAG e EcoRI ACC - MseI CAA foram os mais eficientes na identificação dos híbridos, os quais identificaram 48,5% de híbridos. Os híbridos F64, F108, F111, F113, F131 e F139 são potencialmente resistentes a Alternaria alternata f. sp. citri.