Cultura de Embriões até o Estágio de Blastocisto: Comparação entre o Uso de Meios Seqüenciais e de Co-Cultura

Objetivos: comparar o desenvolvimento embrionário com o uso de dois métodos diferentes de cultura (meio seqüencial ou co-cultura em células Vero). Métodos: foram incluídas 110 pacientes que tiveram ovócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Metade das pacientes teve seus embriões cultivados juntamente com células Vero e a outra metade em meio seqüencial G1:2/G2:2. Os embriões foram transferidos no dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica, verificando-se a taxa de blastulação. A gravidez foi definida por meio de ultra-sonografia, verificando-se batimento cardíaco após a 13ª semana pós-transferência. Resultados: a taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9% e 14% com células Vero e G1:2/G2:2, respectivamente. Com células Vero 36,0% das pacientes engravidaram com taxa de implantação de 18,9%. Quando se utilizou G1:2/G2:2 as taxas de gravidez e implantação foram 28,9% e 14,9%, respectivamente. Em apenas 17 casos obtiveram-se blastocistos após co-cultivo em células Vero, apresentando 76,5% de taxa de gravidez e 63,0% de implantação. Quando o cultivo foi em G1/G2 21 pacientes apresentaram blastocistos e as taxas de gravidez e implantação foram de 57,1 e 76,0%, respectivamente. Conclusão: não houve diferença significativa entre as taxas de gravidez ou implantação nos 2 tipos de cultivo. Nos casos em que blastocistos expandidos foram transferidos, as taxas de implantação e gravidez aumentaram com ambos os tipos de cultivo. Nestas pacientes, independente do tipo de cultivo utilizado, um número maior de ovócitos foi obtido, o que nos leva a pensar que não apenas as condições de cultura influenciam as taxas de implantação e gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as "boas respondedoras" tiveram melhores resultados.

Caracterização da inviabilidade evolutiva de embriões visando doações para pesquisas de células-tronco

OBJETIVO: estabelecer quais as características que definem um embrião como inviável, tornando-o passível de doação para pesquisa com células-tronco. MÉTODOS: avaliação retrospectiva de ciclos de fertilização in vitro realizados entre janeiro de 1995 a 2005. Foram selecionados ciclos nos quais se transferiram para a cavidade uterina embriões com classificações morfológicas iguais entre si. Desta forma, avaliaram-se as taxas de gravidez, implantação e involução de sacos gestacionais dos embriões frescos e criopreservados, distribuídos em grupos, de acordo com sua morfologia. Foram considerados embriões tipo A aqueles simétricos e sem fragmentação; tipo B, assimétricos ou com até 25% de fragmentação; tipo C, com 25 a 50% do seu volume ocupado por fragmentos, e tipo D, aqueles com 50% ou mais de fragmentação. Para as análises estatísticas utilizaram-se os testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. RESULTADOS: em 87 ciclos foram transferidos 172 embriões tipo D, obtendo-se 11% de gravidez, embora somente metade dos embriões inicialmente implantados manteve sua evolução. Já embriões de mesma morfologia quando criopreservados, após descongelamento, não mostraram capacidade evolutiva, apresentando, a partir da transferência de 113 embriões em 36 ciclos, somente uma implantação, perfazendo uma diminuta taxa de 3% de gravidez. A única gestação obtida involuiu antes da 12ª semana de gestação. CONCLUSÃO: embriões de baixos escores morfológicos não podem ser considerados inviáveis por serem capazes, embora com uma freqüência muito baixa, de promoverem gestação. Mas estes mesmos embriões, quando criopreservados e posteriormente transferidos após descongelamento, mostraram taxa de gravidez irrisória, além de não resultarem em gravidez viável. Logo, quando extranumerários, os embriões tipo D não deveriam ser criopreservados, podendo então, ao invés de serem descartados, ser doados para pesquisa de células-tronco embrionárias.

Identificação do nicho de progenitores mesenquimais no fígado de embriões e fetos caninos: uma fonte de células-tronco para terapia celular

As células-tronco (CT) derivadas dos tecidos fetais (TF) foram as mais recentes descobertas entre as CT, e ultimamente tem demonstrado amplo potencial terapêutico, dentre os TF o fígado fetal (FF) apresenta grande potencial terapêutico. Este órgão durante o período fetal em mamíferos é um nicho hematopoético transitório, sendo o principal órgão responsável pela hematopoese no feto, além de contribuir com a formação do nicho definitivo na medula óssea adulta, portanto pode ser considerado um nicho de células-tronco mesenquimais (CTM) e progenitores. No entanto, pouco se sabe sobre a localização destas células no FF, desta forma o presente estudo visa identificar o nicho de CTM e progenitores em FF de cães, a fim de contribuir com as técnicas de isolamento e extração celular. Em conjunto foi realizada a verificação da expressão do fator de transcrição Oct-3/4 e da proteína delta polimerase do DNA (PCNA). Para a análise foram utilizados cinco embriões e 11 fetos caninos com idades gestacionais variando de 25-60 dias. Os resultados elucidaram a partir de 25 dias de gestação o FF apresentou-se volumoso e composto por todas as estruturas típicas, dentre elas a tríade portal, ductos biliares e ramos das artérias hepáticas. Com 30 dias de gestação foram identificados os primeiros sitos de progenitores mesenquimais (PM) enquanto que aos 60 dias os nichos estavam completamente formados com localização semelhante ao fígado adulto (FA). No entanto, células imunopositivas para Oct-3/4 não foram identificadas; sendo assim, destacamos que o FF é uma fonte de PM, apresentando-se como uma alternativa para a utilização terapêutica, bem como para os estudos da biologia do desenvolvimento das CTM e progenitores.

Desempenho reprodutivo entre receptoras bovinas não contaminadas e naturalmente infectadas por Neospora caninum, após a transferência de embriões

O uso do conhecimento de biotécnicas para a melhoria da produção de bens e serviços tem avançado significativamente. O controle de doenças infecciosas continua a representar o maior obstáculo para a saúde dos animais. A perda embrionária pode ser responsável pelo aumento de prejuízos econômicos isolados para os produtores de bovinos. A infecção por Neospora caninum tem emergido como uma importante doença reprodutiva e, em vários países, tem sido diagnosticada como principal causa de aborto. O objetivo desse trabalho foi comparar o desempenho reprodutivo em receptoras bovinas não contaminadas e naturalmente infectadas por Neospora caninum após a transferência de embriões (TE). A escolha dos animais (n=395) para o experimento foi realizada através de avaliação ginecológica, via palpação transretal. As vacinações seguiram protocolo sanitário recomendado para a TE. O manejo nutricional foi baseado no National Research Council (NRC, 1999). A TE de embriões descongelados foi feita após a sincronização do ciclo estral das receptoras. Para a avaliação do desempenho reprodutivo se utilizou de ultrassonografia transretal. A identificação das receptoras positivas para Neospora caninum realizou-se através do teste de ELISA e, para as amostras reagentes, confirmação através de imunofluorescência indireta (IFI). Os dados foram analisados utilizando Past® e foram considerados estatisticamente significantes (P<0,01). Os resultados mostram uma taxa de prenhes (n=191) de 48,35%, seguida de uma taxa de abortos aos 60 dias de gestação (n=14) de 3,5% e abortos ao sexto mês de gestação (n=12) de 3,04%. Esses resultados tornam-se relevantes quando se leva em consideração que, receptoras infectadas pelo protozoário não apresentaram uma taxa elevada de perdas gestacionais. A insignificância estatística dos dados obtidos nesse estudo confere a segurança em sugerir que não há necessidade em implantar o diagnóstico ou controle prévios para Neosporose em rebanhos aptos a TE.

Influência do estrógeno e do interferon γ sobre a expressão da indoleamina-2,3-dioxigenase em cultura de células de placenta e embriões de ratas Wistar

Resumo: A indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima responsável por catabolizar o aminoácido triptofano. Sua presença no ambiente uterino placentário está relacionada à tolerância imunológica ao semi-aloenxerto, pois impede a proliferação de células imunológicas maternas, seja pela falta do aminoácido, ou pela ação de alguns catabólitos oriundos da quebra do triptofano, como o ácido quinolínico, que é tóxico principalmente para os linfócitos T. Pouco se conhece sob a influência de substâncias (hormônios e citocinas) presentes na interface materno fetal e a expressão dessa enzima. Por esta razão, formulou-se a hipótese de que hormônios e interleucinas presentes na região uteroplacentária poderiam exercer algum efeito na expressão da IDO. Células oriundas da interface materno fetal de ratas Wistar foram mantidas em cultivo, onde receberam suplementação com estradiol e interferon-γ. A expressão da enzima foi avaliada pela técnica de citometria de fluxo nos períodos de 4, 24 e 48 horas e confirmação da presença proteica por imuno-histoquímica. Os resultados mostraram um aumento na expressão de IDO após a adição de estrógeno (9,03±0,81/11,25±0,25) e interferon-γ (9,03±0,81/20,43±0,60). O efeito do interferon-γ já era esperado como relatado na literatura, contudo, a elevação da expressão da IDO pela adição do estrógeno constitui nova informação sobre possíveis mecanismos envolvidos na ativação da enzima. O melhor esclarecimento desses achados poderia contribuir para uma melhor compreensão da participação dessa enzima na tolerância materno-fetal e para uma futura modulação terapêutica da mesma.

Germinação in vitro e embriogênese somática a partir de embriões imaturos de canela sassafrás (Ocotea odorifera Mez)

Embriões zigóticos em diferentes estádios de desenvolvimento foram utilizados para avaliar o potencial de germinação e competência embriogênica in vitro. Frutos coletados entre 15 e 360 dias após a antese foram avaliados em relação ao diâmetro (mm), comprimento (mm) e massa fresca (g). Para avaliar a percentagem de germinação in vitro, embriões zigóticos em diferentes estádios de desenvolvimento foram inoculados em meio de cultura composto de sais minerais de Murashigue & Skoog (MS), ou em meio MS suplementado com 4,4 miM de BAP, sacarose (3%), ágar (0,6%), carvão ativado (0,15%). Para a indução de embriogênese somática, eixos embrionários em diferentes estádios de desenvolvimento foram inoculados em meio de cultura MS, suplementado com 2,4-D (0, 9, 18, 72 e 144 miM), sacarose (3%), ágar (0,6%), carvão ativado (0,15%). O embrião zigótico e o fruto apresentaram pequeno crescimento até 180 dias após a floração, aumentando após esta data até a última coleta (360 dias após a floração). A germinação in vitro foi observada em embriões imaturos coletados a partir dos 240 dias após a floração, com percentagem média de 40%. Na última coleta a percentagem média de germinação foi 80%. Culturas embriogênicas foram induzidas em meio de cultura contendo altas concentrações de 2,4-D (72-144 miM) em eixos embrionários coletados a partir dos 150 dias após a floração. As culturas embriogênicas foram mantidas in vitro em meio de cultura MS desprovido de reguladores de crescimento, pelo processo de embriogênese secundária repetitiva.

Mobilização de água e conservação da viabilidade de embriões de sementes recalcitrantes de ingá (Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T. D. Pennington)

Sementes anidrobióticas (ortodoxas) podem ter seu teor de água reduzido a valores suficientemente baixos para minimizar o metabolismo e, dessa forma, manter a viabilidade por períodos prolongados. Sementes não-anidrobióticas (recalcitrantes) não perdem sua viabilidade desde que o teor de água seja mantido acima de determinados valores em que a quantidade da água ainda é elevada para manter o metabolismo ativo; no entanto, a longevidade dessas sementes é relativamente baixa. No presente trabalho procurou-se manter o teor de água dos embriões de ingá por meio do armazenamento em soluções de polietileno glicol 6000 (PEG), com potencial hídrico conhecido e pré-estabelecido, visando a prolongar a longevidade. Os resultados indicaram que embriões mantidos em substrato com solução de PEG a -2,4 MPa apresentaram germinação superior a 80% aos 90 dias de armazenamento a 10 ºC, enquanto os armazenados em substrato umedecido com água pura (0 MPa), na mesma temperatura, apresentaram germinação inferior a 60%.

Sementes recalcitrantes: intolerantes a baixas temperaturas? Embriões recalcitrantes de Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T. D. Penn. toleram temperatura sub-zero

Sementes recalcitrantes são intolerantes à dessecação e a baixas temperaturas, que são as principais formas de conservação de sementes e, portanto, são de difícil armazenamento. Inga vera subsp. affinis produz sementes denominadas recalcitrantes, uma vez que não toleram redução do teor de água para valores inferiores a 35%. Neste trabalho é demonstrada a tolerância desses embriões a temperatura de -2 ºC. Embriões de I. vera de diferentes estádios de maturação foram armazenados por até 45 dias nas temperaturas de 8 ºC a -18 ºC, com ou sem secagens prévias até -4,0 e -6,0 MPa. Os resultados permitiram observar que, embora nenhum tratamento tenha proporcionado resistância à temperatura de -18 ºC, a secagem dos embriões maduros a -4 MPa proporcionou maior tolerância à redução de temperatura até níveis de congelamento da água (-2 ºC).

Inibição do desenvolvimento in vitro de embriões de Coffea por cafeína exógena

A cafeína, alcalóide conhecido como 1,3,7-trimetilxantina, é encontrada em sementes quiescentes de cafeeiro, perfazendo um total de 1,1 a 1,7% em Coffea arabica L. e 2 a 3% em Coffea canephora Pierre, localizada em sua grande maioria no endosperma, na forma livre no citoplasma das células ou complexada com ácidos clorogênicos. Com função fisiológica em plantas ainda não totalmente esclarecida, a cafeína causa efeito alelopático, seja inibindo a germinação de várias espécies, seja como anti-herbívoro ou como agente pesticida natural. A lenta germinação de sementes de café ainda não foi esclarecida e várias causas são apontadas, como presença do endocarpo, baixa absorção de água e O2, presença de inibidores naturais e balanço hormonal. Embora sugeridos, estudos sobre a inibição de sementes de cafeeiro por ação da cafeína endógena e ou exógena são escassos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da cafeína exógena sobre a germinação e o desenvolvimento de embriões de Coffea arabica L. e de Coffea canephora Pierre. O experimento foi realizado utilizando-se frutos no estádio cereja das cultivares Rubi e Apoatã IAC-2258. Após desinfestação dos frutos por 30 minutos de imersão em hipoclorito de sódio (2% i.a.) e lavagem por três vezes em água destilada e autoclavada, os embriões foram retirados e inoculados, de modo asséptico, em placas de petri com meio MS 50%, acrescido de sacarose e suplementado com diferentes concentrações de cafeína (0,00; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30 e 0,40%). Os embriões foram mantidos em sala de crescimento a 27 ± 2ºC e densidade de fluxo de fótons de 13µmol.m-2.s-1, durante 23 dias, quando foram avaliados comprimento da parte aérea, comprimento de raiz e massa fresca das plântulas. Cinco dias após o cultivo, foram avaliadas a porcentagem de emissão de radículas e cotilédones, computando-se os embriões com cotilédones abertos e radículas expandidas. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com seis repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída por cinco embriões. Concluiu-se que a germinação e o desenvolvimento in vitro de embriões de Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre são afetados por cafeína exógena. O efeito detrimental da cafeína exógena em embriões de Coffea é maior nas radículas do que nos cotilédones. Embriões de Coffea arabica L. são mais sensíveis aos efeitos negativos da cafeína exógena do que embriões de Coffea canephora Pierre. A cafeína pode contribuir para a lenta germinação de sementes e o lento desenvolvimento de plântulas de cafeeiro.

Caracterização morfológica de embriões por imagens de raios x e relação com a massa e a qualidade fisiológica de sementes de Tecoma stans L. Juss. ex Kunth (Bignoniaceae)

As imagens obtidas pelos raios X vêm sendo utilizadas na análise da qualidade de sementes desde os anos 50 e, atualmente, vêm se destacando por ser um método rápido, de boa precisão e não destrutivo. Deste modo, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar as características morfológicas dos embriões de sementes de Tecoma stans L. Juss. ex Kunth pertencentes a diferentes classes de massa através da análise de imagens obtidas pelo uso dos raios X, correlacionando-as com a germinação e morfologia das plântulas. Foram utilizadas sete classes de massa com trinta sementes em cada classe, que foram submetidas aos raios X para a obtenção das imagens dos embriões. Os embriões, de cada uma das classes, foram separados de acordo com suas características morfológicas em 4 categorias (embriões sem defeito, embriões com pequenos defeitos, embriões deformados e sementes sem embrião). As sementes das diferentes classes de massa foram colocadas para germinar (emissão da raiz primária) e após dez dias foi observado o número de plântulas normais em cada uma das categorias e classes de massa. A maioria das sementes das classes 1 e 2, mais leves, apresenta-se com embriões deformados ou sem embrião, enquanto que as de maior massa (classes 3 a 7) apresentam embriões sem defeitos, em sua maioria ou totalidade. Quase a totalidade das sementes com embriões sem defeito germina, porém, nem todas dão origem a plântulas normais.

Tolerância à seca de genótipos de trigo utilizando agentes indutores de estresse no processo de seleção

Com o objetivo de selecionar genótipos de trigo tolerantes à seca, por meio da indução de déficit hídrico por diferentes agentes osmóticos, sementes e embriões imaturos de oito genótipos foram submetidos a diferentes gradientes osmóticos e avaliados quanto ao comprimento da parte aérea e da raiz principal e à produção de biomassa total. As sementes foram submetidas aos agentes polietilenoglicol-6000 e manitol, em sete gradientes osmóticos, e avaliadas após dez dias. Os embriões foram cultivados em meio macrobatata, suplementado com PEG 6000, manitol e maltose nas concentrações de 10, 20 e 30%, além do controle, e avaliados após 30 dias de incubação. O delineamento foi inteiramente casualizado e os dados foram submetidos à análise de regressão, utilizando-se o teste "t", para comparar os valores de Beta, e análise de variância, com teste de médias pelo teste "t". Houve efeito do estresse hídrico em todos os genótipos testados para as plântulas oriundas de sementes, com interação significativa entre agente e cultivar e efeito negativo maior para PEG 6000. Os genótipos BH 1146 e Ocepar 14 apresentaram maior tolerância à seca, redução média no crescimento, na presença dos agentes estressantes, de 58 e 62%, respectivamente. Em contraste, o Aliança foi o mais sensível, com redução média de 92%. Para as plântulas oriundas de embriões imaturos, o genótipo BH 1146 também apresentou relativa tolerância; já o Ocepar 14 e Aliança foram altamente sensíveis. Porém, estes genótipos também apresentaram baixo desempenho no meio sem a presença dos agentes estressantes, podendo o efeito negativo estar condicionado ao cultivo in vitro.