Desenvolvimento de iniciadores para detecção e identificação de Diaporthe phaseolorum var. meridionalis em sementes de soja

Considerando a grande variabilidade apresentada pelo complexo Diaporthe/Phomopsis, os métodos rotineiros de sanidade de sementes, empregados na detecção do gênero Diaporthe, não são confiáveis visto que, para sua identificação são utilizadas as características morfológicas das colônias que se desenvolvem sobre as sementes. Diante disso, este trabalho teve como objetivo desenvolver iniciadores específicos, bem como um método confiável para detecção e identificação de Diaporthe phaseolorum var. meridionalis (Dphm), em sementes de soja. Amostra de sementes da cultivar IAS5, analisada previamente para sanidade, não portadoras de Diaporthe (SS) foram inoculadas com Dphm (SI), obtendo-se amostras com as seguintes proporções de SI:SS: 1:10, 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400. Para a extração de DNA do micélio do patógeno das sementes foi necessário primeiro incubar as sementes por 7 dias, utilizando-se o método do papel de filtro modificado com 2,4 D e, em seguida submetê-las à lavagem em tampão de extração (1% de SDS, 10 mM de TRIS/HCL e 25 mM de EDTA) por 20 min, sob agitação a 100 rpm. Em seguida, alíquotas de 350 miL do sobrenadante foram transferidas para novos microtubos contendo 350 miL de resina de sílica gel da Wizard/Promega permanecendo em contacto com a mesma por 1 minuto. Os DNAs extraídos foram utilizados como molde na reação de PCR com os iniciadores: DphLe (TCG GCC TTG GAA GTA GAA AG) e DphRi (ACT GAA TGC GTT GCG ATT CT) Utilizando-se estes iniciadores, foi possível detectar a presença de D. phaseolorum var meridionalis em sementes de soja, na proporção de uma semente infectada com o patógeno em amostras de 400 sementes (0,25% de incidência), utilizando-se o método do papel de filtro modificado com 2,4 D associado à técnica de PCR.

Meio de cultura semi-seletivo para detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em solo e sementes de feijoeiro

A murcha-de-curtobacterium, causada pela bactéria Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), é um importante problema para o cultivo de feijão (Phaseolus vulgaris L.) na região Centro-Sul do Brasil. A principal forma de disseminação da bactéria é por sementes contaminadas. Embora a ocorrência desta doença seja relativamente recente no Brasil, Cff tem sido disseminado rapidamente nas regiões produtoras de feijão do país. Este trabalho teve como objetivo ajustar o meio de cultura CNS (Corynebacterium Nebraskense Selective Medium) para recuperação e detecção de Cff em solo e sementes de feijoeiro. Suspensões provenientes da lavagem de amostras de solo e sementes contaminadas pela bactéria foram plaqueadas no meio de cultura CNS - modificado. Os ajustes realizados no meio de cultura possibilitaram a recuperação eficiente de Cff presente em solo e sementes contaminadas. As modificações estabelecidas para o meio CNS foram a redução da concentração de sulfato de polimixina para 16 mg/l, exclusão do componente ciclohexamida e substituição do fungicida Daconil 2787-F (530 mg/ml de chlorothalonil) pelo Dacostar 500 (500 mg/ml de chlorothalonil).

Efeito do pré-plantio com plantas medicinais e aromáticas no controle de Plasmodiophora brassicae

A "hérnia das crucíferas" é a principal doença na produção de brássicas na Região Metropolitana de Curitiba-PR. Fatores ambientais favoráveis, ausência de cultivares resistentes e de controle químico eficiente, aliados ao plantio sucessivo de espécies da mesma família, têm colaborado para sua disseminação. Com o objetivo de controlar a doença com menor impacto ambiental, o presente estudo verificou o efeito do pré-plantio de plantas medicinais e aromáticas na redução de inóculo de Plasmodiophora brassicae. Dois experimentos foram conduzidos em casa de vegetação no Setor de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná, nos períodos de junho a novembro de 2003 e julho a dezembro de 2004. O delineamento foi inteiramente casualizado com nove tratamentos e seis repetições. As plantas utilizadas nos tratamentos foram: menta (Mentha piperita L.); alfavaca (Ocimum basilicum L.); bardana (Arctium minus Hill); calêndula (Calendula officinalis L.); cebolinha (Allium fistulosum L.); salsa (Petroselinum hortense Hoffm) e sálvia (Salvia officinalis L.), e como testemunhas foram utilizados solos sem patógeno e solo infestado, ambos em pousio. Utilizaram-se vasos contendo 3 Kg de solo esterilizado via vapor e como inóculo de P. brassicae foram utilizados 2,5 g de galhas por vaso. A rúcula (Eruca sativa Mill) foi o hospedeiro suscetível utilizado. Após 45 dias do plantio da rúcula foram determinadas a massa aérea fresca, incidência de galhas galhas e o índice de severidade. A maior massa aérea fresca e as menores severidades foram obtidas no experimento de 2003, nos tratamentos com o pré-plantio das medicinais bardana, salsa, menta, alfavaca e cebolinha.

Inoculação e sobrevivência de Xanthomonas vesicatoria em sementes de tomateiro

Para avaliar o efeito de métodos de inocuação de Xanthomonas vesicatoria (Doidge) (9) em sementes de tomate sobre a qualidade da semente e transmissão da fitobactéria compararam-se os tratamentos: 1) inoculação a vácuo com suspensão de células de X. vesicatoria em STP (0,005M, pH 7,4 e NaCl 0,85%); 2) imersão por 24 horas em suspensão de células de X. vesicatoria em STP; 3) vácuo em solução STP; 4) imersão por 24 horas em STP; 5) imersão por 5 min. em álcool etílico e 6) semente original. As avaliações foram realizadas por testes de germinação e isolamentos em meio Nutriente Agar Modificado (NAM) aos 1, 15, 30 e 45 dias após aplicação dos tratamentos. Em seguida, avaliou-se o efeito da umidade (4% e 8%) e o armazenamento das sementes inoculadas e variações de umidade antes da realização dos testes sobre a sobrevivência e recuperação de X. vesicatoria. Os métodos de inoculação testados podem ser utilizados em trabalhos de rotina, porém, as sementes devem ser utilizadas até 30 dias após a inoculação a partir de quando ocorre uma redução acentuada na taxa de recuperação da fitobactéria. A umidade das sementes interfere na sobrevivência e na transmissão de X. vesicatoria pelas sementes de tomate.

Detecção de allexivírus em primórdios foliares de alho via RT-PCR

Nos procedimentos de detecção de allexivirus em bulbos de alho, tem-se como rotina o plantio de bulbilhos para obtenção de tecido foliar a ser analisado via testes sorológicos e/ou moleculares. A disponibilização das plantas em casa de vegetação implica em gastos com a manutenção e requer, em média, 30 dias. Em áreas isentas desses vírus, corre-se, ainda, o risco de sua introdução e disseminação. No presente trabalho buscou-se ajustar um protocolo para detecção rápida de allexivírus em alho a partir de primórdios foliares. Bulbilhos de alho para consumo, oriundos do Rio Grande do Sul e importados da Argentina foram dissecados para obtenção de primórdios foliares e extração de RNA total a partir de 0,1 g de tecido. A seguir foram conduzidas reações de RT-PCR com um par de oligonucleotídeos, capaz de gerar um fragmento de aproximadamente 500 pb relativo à porção interna do gene da capa protéica de várias espécies do gênero Allexivirus. Uma banda com tamanho aproximado de 500 pb foi visualizada, em gel de agarose e, posteriormente, confirmada por Southern Blot e por seqüenciamento como sendo Garlic vírus C (GarV-C, AY170322.1). A obtenção de RNA total diretamente de primórdios foliares de bulbilhos e seu uso em análise de RT-PCR, constituem-se em uma metodologia econômica, rápida e segura para a detecção de allexivírus em bulbos de alho.

Eficiência e persistência de fungicidas no controle do oídio do trigo via tratamento de sementes

O oídio do trigo, causado por Blumeria graminis f.sp. tritici, ocorre com alta freqüência e intensidade em cultivares suscetíveis, na região Sul do Brasil. Em experimento conduzido em casa-de-vegetação, avaliou-se a eficiência e o período de proteção dos fungicidas difenoconazole (15 SC 100, 200 e 300 mL), flutriafol (12,5 SC 200, 300 e 400 mL) triadimenol (15 SC 200, 300 e 400 mL) e triticonazole (20 SC 135, 270 e 400 mL/ 100 kg de sementes), em três doses da formulação comercial, aplicados via tratamento de semente para o controle do agente causal do oídio. Sementes de trigo, cultivar BR 23, suscetível à doença, foram tratadas com os fungicidas e semeadas em vasos plásticos, contendo como substrato uma mistura de solo, areia e vermiculita. Vasos contendo plantas de trigo, contendo sinais do fungo, foram colocados entre os tratamentos para servir como fonte de inóculo primário. As avaliações foram realizadas diariamente, no afilho principal, desde o surgimento dos primeiros sinais. Utilizou-se como critério de quantificação da doença a incidência de folhas infectadas, até que a planta estivesse com a quarta folha totalmente expandida. Curvas ajustadas segundo o modelo logístico foram obtidas para cada fungicida em suas três doses. O período de proteção conferido pelos fungicidas foi menor para o produto difenoconazole, aumentando o período com o flutriafol e, posteriormente, com o triticonazole. O maior período de proteção foi obtido com o fungicida triadimenol.

Reação de cultivares de batata a Streptomyces scabies, agente causal da sarna comum profunda

Este trabalho visou caracterizar quanto a critérios morfológicos e fisiológicos isolados de Streptomyces causadores de sarna comum profunda em batata; avaliar o comportamento de cultivares em relação à doença e a variação na agressividade entre os isolados da bactéria. Os isolados de Streptomyces apresentaram coloração cinza em meio extrato de levedura e malte e cadeias de esporos espiraladas, produzidas sobre um micélio aéreo. Ocorreu produção de melanina em meio de tirosina-ágar e a utilização de oito fontes de carbono recomendadas, propriedades estas que correspondem às descritas para S. scabies. Batatas-semente sadias de seis cultivares foram plantadas em substrato infestado com seis isolados de S. scabies separadamente e as plantas cultivadas em vasos e ambiente aberto. A severidade da doença foi estimada com auxílio de uma escala diagramática e avaliou-se o rendimento de tubérculos (g/planta). As cvs. Mondial e Jaete Bintje foram as mais resistentes à sarna comum com severidade média nos dois experimentos de 10,5% e 14,0%, respectivamente, seguidas por Asterix (17,4%), Ágata (21,8%), Monalisa (23,0%) e Cupido (23,3%). A agressividade dos isolados variou quantitativamente, com severidade maior para o isolado M4 (34,7%) e menor para o isolado M1 (6,2%). Redução da produção de tubérculos foi verificada na cv. Jaete Bintje, no primeiro experimento, e quando as cultivares foram infectadas pelos isolados A1, M2 e M3, no primeiro experimento, e pelo isolado M4, no segundo experimento.

Ocorrência endofítica de Lasiodiplodia theobromae em tecidos de cajueiro e sua transmissão por propágulos

Lasiodiplodia theobromae, agente causal da resinose e da podridão-preta-da-haste é o principal patógeno do cajueiro no semi-árido nordestino. Esse patógeno é reconhecido em outros hospedeiros pela capacidade de colonizar tecidos vegetais sem aparente sintoma. Essa característica é de grande importância epidemiológica, prognosticando medidas de exclusão no manejo da doença. A ocorrência epidêmica da resinose em áreas isoladas reforça a hipótese dos propágulos assintomáticos do hospedeiro servirem como fonte de inoculo primário. Os objetivos deste estudo foram determinar a capacidade de L. theobromae de sobreviver em tecidos de cajueiro sem apresentar sintomas e estimar a transmissão deste patógeno via propágulos. A presença do fungo a diferentes distâncias do cancro e nas duas direções em relação ao mesmo (descendente e ascendente) foi determinada pelo plaqueamento de tecidos de troncos infectados. Na outra parte do trabalho, foram coletados em pomares comerciais sementes de plantas sem sintomas e com sintomas severos de resinose. Estas foram semeadas separadamente e as plântulas obtidas foram enxertadas com garfos provenientes de ramos de plantas sadias e ramos de plantas severamente infectadas, perfazendo-se todas as combinações de origem da semente e garfos. As mudas produzidas conforme os quatro tratamentos foram plantadas sob condições favoráveis à doença. L. theobromae foi isolado até 80 cm, tanto na direção ascendente como na descendente em relação do cancro. A interação garfo de planta doente e semente de planta doente apresentou maior incidência da resinose do que a interação garfo de planta sadia e semente de planta doente, mostrando que o garfo também contribui no aumento da incidência.. A interpretação desses resultados evidencia o caráter endofítico de L. theobromae e o propágulo infectado como veículo de introdução da doença no pomar.

Efeito de diferentes níveis de Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides Costa, em plantas de algodão no campo e sua incidência nas sementes

A transmissão planta-semente de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides, agente causal da ramulose do algodoeiro, não tem sido correlacionada com a severidade da doença no campo. Entretanto, baixos níveis de incidência têm, muitas vezes, resultado em altos índices de infecção das sementes pelo patógeno. Esse fato induz o cancelamento de campos de produção de sementes em algumas regiões produtoras. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de níveis de inóculo inicial, constituído de plantas com sintomas da doença, em relação à incidência da ramulose quando 70% das maçãs estavam formadas, período considerado como de maior suscetibilidade à infecção, bem como a transmissão planta-semente em relação aos níveis de incidência da doença no campo. O experimento foi conduzido durante os anos agrícolas de 2006 e 2007, com níveis de inóculo inicial de 0,0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 e 1,6% de plantas com sintomas aos 40 dias após a emergência, em blocos casualizados com quatro repetições e parcelas com oito linhas de 15 m. A incidência da ramulose foi avaliada quando 70% das maçãs estavam formadas, em 200 plantas, nas quatro fileiras centrais. Após a colheita, as sementes foram submetidas ao teste de sanidade pelo método do papel de filtro. Observou-se correlação significativa entre os níveis de inóculo inicial e a incidência da doença quando 70% das maçãs estavam formadas, bem como entre os níveis de incidência no campo e a incidência do patógeno nas sementes, sendo esta correlação altamente significativa no ano de 2006. Campos de produção com incidência de ramulose acima de 5% podem induzir níveis elevados de infecção nas sementes.

Variabilidade genética entre isolados de Colletotrichum gossypii do algodoeiro

O algodoeiro é atacado por Colletotrichum gossypii (CG) e C. gossypii var. cephalosporioides (CGC). Ambos os patógenos são transmitidos pela semente e sua distinção morfológica é extremamente difícil e inconsistente. Tentativas foram feitas no presente trabalho para verificar a variabilidade genética entre CG e CGC através de RAPD-PCR, ERIC- e REP-PCR e PCR-RFLP da região ITS rDNA. Foram utilizados 53 isolados coletados de sementes e folhas de plantas de diferentes cultivares nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais, e Paraiba, entre 1999 e 2003. Baseado em testes de patogenicidade, vinte e um isolados foram classificados como CG e 32 como CGC. Os resultados obtidos por RAPD-PCR, utilizando-se oito primers, revelaram dois grupos distintos sendo que o primeiro foi formado por 94% dos isolados de sementes e o segundo por 95% dos isolados de folhas. Na análise de ERIC- e REP-PCR, resultados semelhantes a RAPD foram obtidos, sendo que o primeiro grupo foi formado por 93% dos isolados provenientes das sementes e o segundo por 78% dos isolados provenientes das folhas. Quando o produto de amplificação da região ITS rDNA foi digerido com oito enzimas de restrição, um perfil de bandas semelhante para todos os isolados foi obtido. Resultados de RAPD, ERIC- e REP-PCR demonstraram que existem diferenças genéticas entre os isolados provenientes das sementes e aqueles provenientes de parte aérea, e esses dois grupos foram claramente distintos. Estudos futuros devem ser realizados utilizando outras técnicas moleculares para a obtenção de marcadores capazes de distinguir entre isolados de CG e CGC.

Anatomia de lesões foliares causadas pelo vírus da Mancha Clorótica do Clerodendrum, transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis em diferentes espécies

O gênero botânico Clerodendrum pertence à família Lamiaceae e compreende várias espécies ornamentais, Manchas cloróticas e necróticas em folhas de coração-sangrento foram observadas pela primeira vez em um jardim de Piracicaba, SP, associadas à infestação com Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). Exames de secções de tecidos das lesões foliares ao microscópio eletrônico revelaram ocorrência de efeitos citopáticos do tipo nuclear e concluiu-se que os sintomas eram causados por um vírus transmitido por Brevipalpus (VTB), o qual foi designado de mancha clorótica de Clerodendrum (Clerodendrum Chlorotic Spot Virus- ClCSV). O ClCSV é transmitido mecanicamente de coração-sangrento para coração-sangrento. Em ensaios preliminares foi transmitido por B. phoenicis e mecanicamente para várias outras plantas, além da ocorrência de sua disseminação natural por este ácaro para outras espécies. Visando complementar a caracterização do ClCSV foram feitos estudos sobre alterações anatômicas em folhas de plantas infectadas pelo ClCSV. Foram examinadas secções histológicas de folhas sadias e infectadas pelo ClCSV de C. x speciosum e de outras hospedeiras como Hibiscus schizopetalus, Salvia leucantha, Malvaviscus arboreus e Annona muricata. Constatou-se que o ClCSV causa alterações celulares semelhantes nas diferentes hospedeiras e os sintomas causados por este vírus são similares aos causados por outros vírus transmitidos por Brevipalpus como o vírus da leprose dos citros citoplasmático (Citrus Lepros Virus Cytoplasmic- CiLV-C) e nuclear (Citrus Leprosis Virus Nuclear- CiLV-N), mancha anular do cafeeiro (Coffee Ringspot Virus- CoRSV), mancha anular de Solanum violaefolium (Solanum violaefolium Ringspot Virus- SvRSV) e "Orchid Fleck Vírus" (OFV), representadas por hipertrofia e hiperplasia frequentemente acompanhadas de necrose nos tecidos do parênquima paliçádico e lacunoso.

Incidência de Leifsonia xyli subsp. xyli em variedades de cana-de-açúcar a serem empregados para multiplicação no estado de São Paulo

O raquitismo-da-soqueira, causada por Leifsonia xyli subsp xyli (Lxx) é uma das principais doenças da cana-de-açúcar pelo dano que acarreta à produtividade e estar presente em todas as regiões produtoras do país. Outro fator que contribui para sua importância na cultura é a dificuldade da sua identificação no campo pelo sintomas produzidos. Aliado a isso, mudas contaminadas juntamente com instrumentos de corte são os principais meios de disseminação da doença. O Laboratório de Genética Molecular (LAGEM) da UFSCar é um dos laboratórios que realizam exames de sanidade quanto ao raquitismo-da-soqueira. O objetivo de presente trabalho foi o de examinar a incidência de Lxx nas canas enviadas para análise de sanidade ao LAGEM e reportar os resultados dos exames realizados entre os anos de 2005 e 2007. Esses resultados evidenciaram que RB867515 foi a variedade mais enviada em cada um dos três anos. Vinte e quatro das 98 variedades analisadas mostraram-se positivas quanto a Lxx, com porcentagem variando de 0,4 a 38,9 %.

Controle integrado da ferrugem asiática da soja (Phakopsora pachyrhizi) com o fungicida fluquinconazole aplicado nas sementes em associação com outros fungicidas pulverizados na parte aérea da cultura

O objetivo deste trabalho foi avaliar o controle da ferrugem asiática da soja (Phakopsora pachyrhizi) pela integração do tratamento de sementes com o fungicida fluquinconazole e a pulverização de fungicidas na parte aérea da cultura. Dois ensaios foram instalados na safra 2006/07, um em Dourados, MS, usando sementes de soja da cv. BRS 245 RR e o outro em Paulínia, SP com a cv. CD 208. Foram avaliados a severidade da doença, a desfolha e o rendimento de grãos. O delineamento experimental usado foi o de blocos ao acaso, com quatro repetições, em arranjo fatorial 2x5, com dois tratamentos de semente, com e sem fluquinconazole, e cinco combinações de misturas de fungicidas aplicadas na parte aérea da soja. Os resultados observados nestes ensaios mostraram que a adição do fluquinconazole ao tratamento de sementes padrão na cultura da soja, sem considerar a aplicação de fungicidas na parte aérea da cultura, atrasou a evolução da ferrugem da soja, apresentando diferença significativa com o tratamento de sementes padrão sem o fluquinconazole, em relação à severidade e desfolha, o que não ocorreu com relação ao rendimento de grãos. Considerando a integração entre o tratamento de sementes com fluquinconazole e os fungicidas aplicados na parte aérea da soja, na maioria das avaliações de severidade da ferrugem e de desfolha, bem como em relação ao rendimento de grãos da cultura, não foi observada interação significativa entre estas duas práticas. As aplicações foliares de fungicidas foram eficientes para o controle da ferrugem da soja, proporcionando menores níveis de severidade e de desfolha, o que refletiu de forma positiva no rendimento de grãos da cultura, em comparação com a testemunha não tratada. Não foram observados efeitos fitotóxicos nas plantas de soja decorrentes da utilização do fungicida fluquinconazole nas sementes.

Efeito de óleos essenciais como alternativa no controle de Colletotrichum gloeosporioides, em pimenta

Fungos do gênero Colletotrichum causam doenças conhecidas como antracnose. Métodos alternativos que sejam eficientes e menos agressivos vêm sendo amplamente testados. Dentre estes, surge o interesse pela utilização de óleos essenciais extraídos de vegetais. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de óleos essenciais de eucalipto, copaíba, andiroba, babaçu, coco, neem, semente de uva, amêndoa, hortelã e pau rosa, em diferentes concentrações sobre o fungo Colletotrichum gloeosporioides, in vitro e em frutos de pimenta em pós colheita. O experimento in vitro foi realizado utilizando-se cinco concentrações (0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0%) dos dez óleos misturados ao meio de cultura BDA. As variáveis analisadas foram a taxa de crescimento micelial e o índice de velocidade de crescimento micelial (IVCM). O ensaio em pós-colheita foi feito com imersão dos frutos de pimenta por 5 minutos, nos mesmos óleos utilizados no experimento anterior, usando-se a maior concentração. O fungo C. gloeosporioides foi inoculado, através de ferimento, logo após a imersão dos frutos. As avaliações foram realizadas diariamente através de medição do diâmetro das colônias e das lesões, tomando-se duas medições em sentidos diametralmente opostos. Pode-se observar que no experimento in vitro todos os óleos, com exceção dos óleos de babaçu, semente de uva e amêndoa, tiveram excelentes resultados inibindo o crescimento do fungo. No resultado obtido em pós-colheita foi observado que apenas o óleo de babaçu não foi eficiente em reduzir o desenvolvimento da lesão de antracnose. Dados relevantes foram observados para os óleos de semente de uva e amêndoa, que não apresentaram efeito direto sobre o fungo in vitro, porém no tratamento pós-colheita apresentaram bons resultados, reduzindo a lesão causada por C. gloeosporioides, sugerindo assim que estes óleos possam ser utilizados como indutores de resistência em frutos de pimenta com antracnose.

Sensibilidade do método de obtenção das células bacterianas e da técnica de PCR para detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em sementes de feijão

Atualmente, existe a necessidade de se desenvolver métodos sensíveis, baratos, reproduzíveis e rápidos para a detecção de fitobactérias em sementes. O objetivo deste trabalho foi otimizar um método de obtenção das células bacterianas e a técnica de PCR para detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), em sementes de feijão. Foi utilizado o primer CffFOR2-REV4, desenhado a partir do fragmento amplificado via PCR baseado na seqüência repetitiva (Rep-PCR). Avaliaram-se também quatro métodos de preparação dos extratos de sementes de feijão para a obtenção células de Cff : 1) extrato bruto de sementes; 2 ) extrato concentra do por filtração em membra na milipore (0,22Mu de diâmetro) e ressuspensão em água; 3) extrato concentrado por centrifugação a 10 .00 0 xg por 15 minutos no volume de 20 ou de 80 mL e 4) Bio-PCR. Dentre esses métodos, tanto a Bio-PCR quanto a concentração do extrato por centrifugação, seja no volume de 20 ou de 80 mL, possibilitaram amplificar o segmento de DNA de 306 pb, característico de Cff. Essas duas técnicas, além de detectar a bactéria, apresentam alta sensibilidade, detectando até 1 semente inoculada artificialmente artificialmente com Cff em 999 sementes sadi as. Analisaram-se dezessete lotes comerciais de sementes de feijão pelo método de concentração de extrato por centrifugação, sendo qu e em doze detectou-se a bactéria Cff, observado pela presença de bandas com 306 pb. Portanto, foi possível otimizar um método de obtenção das células bacterianas e técnica de PCR para detecção de Cff em sementes de feijão, que seja sensível, reproduzível e de fácil execução, que poderá ser utilizado rotineiramente em laboratórios de análises de sementes.