Caracterização molecular através da técnica fAFLP de isolados de Diaporthe citri

A citricultura é um mercado em expansão, principalmente no Estado de São Paulo, cuja importância na balança comercial já é reconhecida. Como em qualquer espécie cultivada, o crescimento das áreas de cultivo favorecem também o crescimento de problemas fitossanitários. Desta forma, as espécies de citros são afetadas por diversas doenças destacando-se entre elas a melanose, causada por Diaporthe citri (Wolf.), à qual a grande maioria das variedades comerciais são suscetíveis. O conhecimento da diversidade intra-específica é de grande importância, já que esta poderá auxiliar na seleção de variedades com resistência. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética em isolados de Diaporthe citri, originários de diferentes locais, variedades e partes da planta, utilizando marcadores moleculares. Marcadores do tipo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) foram utilizados para caracterização de dez isolados do patógeno. Os DNAs genômicos extraídos da massa micelial foram utilizados nas reações de amplificação. A técnica fluorescent AFLP permitiu a distinção dos isolados estudados, tendo sido classificados em quatro grupos distintos. Contudo, estes grupos não foram formados em razão da região geográfica, parte da planta ou variedade.

Transmissão experimental do Grapevine virus B pela cochonilha Pseudococcus longispinus Targioni-Tozzetti (Hemiptera: Pseudococcidae)

Em São Paulo, existem dois isolados do Grapevine virus B (GVB), sorologicamente semelhantes e sintomatologicamente distintos, que causam a doença denominada fendilhamento cortical ("grapevine corky bark", GCB). Na literatura estrangeira existem relatos de que o GVB pode ser transmitido por cochonilhas brancas. O objetivo do presente trabalho foi o de verificar a transmissibilidade do GVB de videira infectada para videira sadia através da cochonilha da espécie Pseudococcus longispinus. Os dois isolados do vírus foram testados: o isolado comum (GVB-C) e o isolado Itália (GVB-I). A confirmação de infecção foi feita através da análise visual de sintomas, ELISA e RT-PCR. Em todos os testes de inoculação experimental, os primeiros sintomas da virose foram notados com, aproximadamente, 8 a 12 meses após a exposição às cochonilhas. Plantas sadias da variedade LN-33, mantidas ao redor de uma planta infectada com o GVB-C e altamente infestada pela P. longispinus, tornaram-se infectadas com incidência de 54,2%, após 4 anos. Empregando-se inoculação experimental com cochonilhas virulíferas, plantas da indicadora LN-33 apresentaram infecção de 46,2% e 40,0% para o GVB-C e GVB-I, respectivamente, após 3 anos de observações. Apesar desta espéciede cochonilhaocorrer de maneira eventual nos vinhedos do Estado de São Paulo, precauções devem ser tomadas em áreas onde são mantidos clones sadios de variedades de copa e de porta-enxerto de videira, visto que esses insetos, além de possuírem grande número de plantas hospedeiras, também podem transmitir outros importantes vírus da videira.

Efeito do tempo, substrato e temperatura na penetração de juvenis do segundo estádio de Meloidogyne javanica e Heterodera glycines em soja

Observou-se que, independente do substrato, aos 2 dias após a inoculação a penetração de juvenis do segundo estádio (J2)de Meloidogyne javanica nasraízes da soja foi baixa em comparação com os demais períodos. Em areia fina, maior penetração ocorreu aproximadamente aos 4,4 dias após a inoculação. Na mistura de solo + areia grossa, o aumento foi linear no intervalo de 2 a 8 dias após a inoculação. Na areia fina o número de J2 de Heterodera glycines no interior das raízes foi mais alto aos 2 dias da inoculação. Na mistura de solo + areia grossa, ocorreram menor número de J2 de H. glycines nas raízes aos 2 dias após a inoculação e tendência de aumento até o 8º dia. Na temperatura de 24ºC, ocorreu maior (P< 0,05) penetração de J2 de M. javanica indiferente da resistência da cultivar. Entretanto, na cultivar resistente a penetração não foi alterada (P< 0,05) entre 24 e 28ºC. A 32ºC ocorreu queda significante no número de J2 de M. javanica nas raízes chegando a 17,97% daquela em 28ºC e semelhante àquelas em 16 e 20ºC. Na cultivar suscetível a queda na penetração foi significante aos 28ºC e 32ºC, da ordem de 34,74% em relação a 24ºC, porém ainda mais elevada (P< 0,05) do que em 16 e 20ºC. A 12ºC não ocorreu penetração em qualquer cultivar testada. Para H. glycines, a maior penetração na cultura suscetível ocorreu à temperatura de 21,3ºC e a 22,4ºC na resistente. A 12 e 32ºC a penetração de H. glycines foi semelhante nas cultivares resistente e suscetível, porém correspondendo a aproximadamente metade daquela observada nas melhores temperaturas.

Desenvolvimento de iniciadores para detecção e identificação de Diaporthe phaseolorum var. meridionalis em sementes de soja

Considerando a grande variabilidade apresentada pelo complexo Diaporthe/Phomopsis, os métodos rotineiros de sanidade de sementes, empregados na detecção do gênero Diaporthe, não são confiáveis visto que, para sua identificação são utilizadas as características morfológicas das colônias que se desenvolvem sobre as sementes. Diante disso, este trabalho teve como objetivo desenvolver iniciadores específicos, bem como um método confiável para detecção e identificação de Diaporthe phaseolorum var. meridionalis (Dphm), em sementes de soja. Amostra de sementes da cultivar IAS5, analisada previamente para sanidade, não portadoras de Diaporthe (SS) foram inoculadas com Dphm (SI), obtendo-se amostras com as seguintes proporções de SI:SS: 1:10, 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400. Para a extração de DNA do micélio do patógeno das sementes foi necessário primeiro incubar as sementes por 7 dias, utilizando-se o método do papel de filtro modificado com 2,4 D e, em seguida submetê-las à lavagem em tampão de extração (1% de SDS, 10 mM de TRIS/HCL e 25 mM de EDTA) por 20 min, sob agitação a 100 rpm. Em seguida, alíquotas de 350 miL do sobrenadante foram transferidas para novos microtubos contendo 350 miL de resina de sílica gel da Wizard/Promega permanecendo em contacto com a mesma por 1 minuto. Os DNAs extraídos foram utilizados como molde na reação de PCR com os iniciadores: DphLe (TCG GCC TTG GAA GTA GAA AG) e DphRi (ACT GAA TGC GTT GCG ATT CT) Utilizando-se estes iniciadores, foi possível detectar a presença de D. phaseolorum var meridionalis em sementes de soja, na proporção de uma semente infectada com o patógeno em amostras de 400 sementes (0,25% de incidência), utilizando-se o método do papel de filtro modificado com 2,4 D associado à técnica de PCR.

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Caracterização morfológica e identificação molecular de isolados de Fusarium graminearum associados à giberela do trigo e triticale no sul do Brasil

A giberela ou fusariose da espiga é uma das principais doenças do trigo e triticale no sul do Brasil. A espécie de fungo Fusarium graminearum é citada como agente causal da doença, muito embora, em outros países, outras espécies de Fusarium também estejam associadas à doença. No País, não existem relatos de levantamentos de espécies associadas à doença. O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Fusarium associados à giberela do trigo e triticale procedentes do sul do Brasil, com base na morfologia e no emprego da reação da polimerase em cadeia (PCR) baseada em oligonucletídeos específicos para espécies de Fusarium. A patogenicidade dos isolados em trigo foi avaliada em espigas de plantas cultivadas em casa de vegetação. Os 20 isolados monospóricos analisados, obtidos de espigas doentes e sementes, foram identificados como F. graminearum.

Neon-S, novo meio para detecção de Sclerotinia sclerotiorum em sementes

O meio Neon, desenvolvido para verificar a viabilidade de escleródios de Sclerotinia sclerotiorum, foi modificado e denominado de Neon-S com o objetivo de detectar o patógeno em sementes. Um antibiótico de amplo espectro e uma forma do ácido 2,4 D que suportassem a autoclavagem foram incorporados ao novo meio. Verificaram-se a concentração ideal de azul de bromofenol e as melhores condições de luminosidade e temperatura para a incubação das sementes sobre este meio. Todos os novos ingredientes do meio foram adicionados antes da autoclavagem e o ajuste de pH foi dispensado. O Neon-S foi comparado com os métodos de detecção de patógenos em sementes recomendados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Em relação ao método do papel de filtro e do rolo de papel, o do presente trabalho foi mais rápido e eficiente, reduzindo o tempo de detecção de 37 dias para 12 dias.

Efeito da solarização e do brometo de metila sobre a comunidade de fungos do solo

A microbiota do solo é de grande importância no desenvolvimento de culturas. Os métodos de controle, químico (brometo de metila) e físico (solarização), alteram essa microbiota. O presente trabalho objetivou estudar o comportamento da comunidade de fungos em solo solarizado e fumigado (brometo de metila). O delineamento experimental foi de blocos ao acaso, com três tratamentos (solarização, brometo de metila e testemunha) e sete repetições. A comunidade de fungos do solo foi avaliada de forma quantitativa e qualitativa, em três momentos (antes, durante e após a solarização) com amostras coletadas de três profundidades (0-5; 10-15 e 20-25 cm). Durante a solarização ocorreu uma redução na comunidade de fungos do solo, em termos quantitativos, em todas as camadas amostradas. No entanto, essa diminuição foi mais significativa na camada superficial (0-5cm). Em termos qualitativos, a solarização reduziu também o número de diferentes espécies de fungos do solo, mas na camada de 20-25 cm, essa diminuição foi a zero aos 56 dias de avaliação. A recolonização da microbiota do solo, em termos quantitativos, foi maior no tratamento com brometo de metila do que nos demais. Entretanto, esse aumento não foi o mesmo em termos qualitativos. Nos tratamentos solarizado e testemunha, o aumento na comunidade de fungos do solo foi acompanhado pela diversificação de espécies fúngicas.

Resposta diferencial das cultivares de algodoeiro a Alternaria macrospora

Estudou-se a resposta diferencial de 32 cultivares comerciais do algodoeiro a A. macrospora em casa de vegetação. A inoculação foi realizada em plântulas de 20-25 dias de idade com 25 repetições, utilizando-se o delineamento experimental de blocos ao acaso. As cultivares foram agrupadas através de análise de Scott & Knott. Resistência completa não foi encontrada, sendo que todas as cultivares foram suscetíveis. Houve diferença entre reação de plantas da mesma cultivar. Não obstante, quando algumas plantas das cvs. BRS Antares e Fibermax 986, que mostraram resistência, foram inoculadas com mistura de nove isolados escolhidos ao acaso, as mesmas mantiveram sua resistência a esta mistura. Trabalhos futuros deverão ser realizados para encontrar fontes de resistência a este patógeno em outras espécies de Gossypium.

Diversidade de Phytophthora parasitica isolados de Citrus usando seqüências de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA

Realizou-se estudo para caracterização e verificação da diversidade genética de Phytophthora parasitica, agente causador da gomose dos citros. Quatorze isolados de Phytophthora parasitica, provenientes do Estado de São Paulo, foram seqüenciados a partir das regiões internas transcritas (ITS1 e ITS2) do gene 5.8S. Obtiveram-se seqüências de 812 pb a 860 pb que foram comparadas com seqüências de outras espécies de Phytophthora spp depositadas no NCBI. Foram feitos estudos filogenéticos, utilizando-se o método "neighbor-joining" com 1000 "bootstrap" e construído o dendrograma mais representativo. Obtiveram-se os resultados de 98,88% a 100% de similaridade genética entre os 14 isolados paulistas, e 99,5% a 98,8% entre estes e a seqüência de P. nicotianae (gi| 8927482) obtida do GenBank NCBI.

Vírus da mancha anular do cafeeiro (Coffee ringspot virus - CoRSV): influência na qualidade da bebida e na produção de grãos de café

A mancha anular do cafeeiro, causada pelo Coffee ringspot virus (CoRSV) que é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes) (Acari: Tenuipalpidae), tem sido observada em altas incidências em várias regiões cafeeiras do Estado de Minas Gerais. O CoRSV causa manchas cloróticas arrendondadas ou irregulares nas folhas, caules e frutos. Foi feita uma avaliação do efeito da infecção de frutos do cafeeiro pelo CoRSV na qualidade da bebida por meio de teste bioquímico e de degustação, e também na eventual perda de peso nos grãos. Testes revelaram que grãos provenientes de frutos de café infectados pelo CoRSV apresentavam menor teor de açúcares redutores e maior condutividade elétrica. Houve também depreciação na qualidade de bebida gerada pelos frutos infectados por meio do teste de degustação (teste de xícara). O peso médio dos grãos provenientes de frutos manchados foi cerca de 5% menor do que dos grãos de frutos sem sintomas.