RESGATE DE EMBRIÕES IMATUROS IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DE MACIEIRA (Malus spp.)

A cultura in vitro de embriões permite desenvolver estudos nas áreas de fisiologia e melhoramento, possibilitando o resgate de embriões imaturos, oriundos de cruzamentos que podem ser incompatíveis. Em macieira, geralmente, os embriões imaturos apresentam dormência e baixa germinação. O objetivo deste trabalho foi testar concentrações de BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes períodos de imersão para superação da dormência e germinação de embriões imaturos de macieira. Os embriões foram extraídos de sementes retiradas de frutos oriundos do cruzamento entre os porta-enxertos de macieira Marubakaido (Malus prunifolia) x M9 (Malus pumilla), realizado em plantas matrizes cultivadas na Epagri -- São Joaquim (SC). Os 50 frutos colhidos ao acaso foram submetidos a uma esterilização com etanol 96º por 10 min e após com solução de hipoclorito de sódio a 2% por 20 min. As sementes foram submetidas a uma desinfestação, utilizando-se etanol 70% por 30 s e solução de hipoclorito de sódio 1,25% por 15 min, seguindo-se três lavagens com água esterilizada e autoclavada. Os embriões foram inoculados em 10 ml de meio MS/2, suplementado com 100 mg.L-1 de mio-inositol, 30 g.L-1 de sacarose e com BAP (0, 6 e 12 mg.L-1) e 6 g.L-1 de agar, com pH ajustado para 5,8. Os embriões foram mantidos por 24 ou 48 horas neste meio e depois transferidos para um meio MS/2 sem regulador vegetal. Não ocorreu contaminação nem oxidação em nenhum embrião. A concentração de BAP que promoveu maior crescimento dos embriões foi de 6 mg.L-1, mas o melhor aspecto quanto à intensidade de coloração e formação de brotos foi obtido utilizando-se 12 mg.L-1.

CULTURA IN VITRO DE EMBRIÕES ZIGÓTICOS DE AÇAIZEIRO

Este trabalho teve como objetivo estabelecer o protocolo para a produção de plântulas in vitro a partir da conversão de embriões zigóticos de açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.). Os embriões zigóticos maduros foram excisados sob condições assépticas, a partir de sementes obtidas de frutos maduros, e cultivados em tubos de ensaio com 10 mL de meio MS modificado pela presença de 0,17 g.L-1 de NaH2PO4, com 0,6 % de ágar, 0,25 % de carvão ativado e 3 % de sacarose. Foram testadas diferentes combinações de ANA (0,54; 2,68 e 5,37 miM) e BAP (0,44; 1,11; 1,55 e 2,22 miM) e uma testemunha adicional. Em média, os tratamentos constituídos da combinação de ANA e BAP foram superiores à testemunha para todas as variáveis avaliadas. As concentrações de 0,54 e 2,68 miM de ANA promoveram, em média, maior formação de plântulas normais quando comparado com 5,37 miM de ANA. O maior comprimento da parte aérea foi induzido pela presença de 2,68 miM de ANA combinado com 1,11; 1,55 e 2,22 miM de BAP. Não foram verificadas diferenças significativas entre as concentrações de ANA e BAP para a percentagem de conversão de embriões e número de raízes por plântula

ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES NA OBTENÇÃO DE PLANTAS EM CRUZAMENTOS ENTRE GENITORES APIRENOS DE VIDEIRA

Pesquisou-se o efeito do estádio de desenvolvimento de embriões resgatados na obtenção de plantas em cruzamentos entre genitores apirenos de videira, utilizando dois métodos de cultivo in vitro de sementes-traço. No método 1 (M1), as sementes-traço foram cultivadas 60 dias em meio-de-cultura ER e no método 2 (M2) 60 dias em ER, mais 30 dias em meio-de-cultura MS. O estádio de desenvolvimento do embrião foi identificado no final destes períodos, quando do resgate e transferência para meio-de-cultura WP. Quatro tipos de embriões foram identificados: globular, cordiforme, torpedo e indefinido. O estádio globular foi encontrado com maior freqüência, levando à obtenção de maior número de plantas, mesmo tendo apresentado menor capacidade de gerar plantas. A maior eficiência em gerar plantas foi obtida com o estádio torpedo. No M2, ocorreu maior número de embriões germinados e de plantas desenvolvidas. Como o estádio de desenvolvimento do embrião influencia na obtenção de plantas, o resgate de embriões em estádio mais avançado do seu desenvolvimento leva a tem maior capacidade de gerar plantas. Portanto, uso de técnicas que favoreçam o resgate de embriões mais desenvolvidos pode aumentar o número de plantas obtidas.

Desenvolvimento in vitro de plântulas de diplóides de bananeira obtidas a partir de cultura de embriões

Este trabalho teve por objetivo avaliar o desenvolvimento in vitro de plântulas de progênies de oito genótipos de bananeira obtidos a partir de cultura de embriões. Os genótipos foram as espécies selvagens Calcutta e Malaccensis (Musa acuminata-AA), Butuhan e França (M. balbisiana-BB) e os híbridos 0304-02, 1304-06, 4252-04 e 9379-09 (M. acuminata-AA). Os embriões foram extraídos de forma asséptica, sendo introduzidos em meio de cultura MS com 30 g L-1 agar, inicialmente em placas de Petri (40 dias) e depois em tubos de ensaio (45 dias). Verificou-se efeito do genótipo no desenvolvimento in vitro dos embriões. As progênies dos genótipos selvagens do grupo BB, seguidos das progênies dos híbridos AA apresentaram maior desenvolvimento para as variáveis estudadas. O protocolo utilizado foi adequado para a cultura de embriões das progênies dos oito genótipos, devendo, no entanto, o período de desenvolvimento in vitro ser reduzido para 30 dias a fim de que o enraizamento não seja muito acentuado.

Superação in vitro da dormência de embriões do porta-enxerto de macieira M9 (Malus pumilla Mill.)

A dormência em sementes de macieira é um dos fatores limitantes para o avanço nos programas de melhoramento genético nesta espécie. Assim, o presente estudo objetivou estudar a germinação in vitro de embriões dormentes do porta-enxerto de macieira M9, oriundos da EE São Joaquim da EPAGRI/SC. Os embriões foram excisados de sementes maduras e inoculados em meio basal MS, adicionado de sacarose (30 g.L-1), ágar (6 g.L-1), água de coco (15%), caseína hidrolisada (CH) (500 mg.L-1), AIA (0 e 14 µM); AG3 (0 e 1,5 µM), Kin (5 µM), 2-iP (12 µM); BAP (4 µM). As culturas foram mantidas no escuro por 10 dias e transferidas para sala de crescimento sob regime de luz de 16 horas, temperatura de 25 ± 2°C e 40 µmol de radiação luminosa. A maior percentagem de germinação (75%) foi obtida em meio MS suplementado com CH (500 mg.L-1), AIA (14 µM), AG3 (1,5 µM) e Kin (5 µM). Quando a Kin foi substituída por BAP (4µM), observou-se a formação de calo, sobre o qual se originaram gemas e brotações, cujos valores médios foram de 2,3 brotos por embrião e 12,3 gemas por brotação. Em relação ao comprimento das brotações, não houve diferença significativa entre os tratamentos. A maior percentagem de indução de calos ocorreu em meio de cultura suplementado com AIA, Kin e 2-iP. O meio de cultura MS/2 suplementado com CH e água de coco e isento de fitorreguladores, resultou em 25% de germinação. Já, o número de raízes foi maior no meio de cultura MS suplementado com AIA (14 µM), AG3 (1,5 µM) e CH. O comprimento médio das raízes (4,0 cm) não foi afetado por nenhum tratamento em particular. Desta forma, esta técnica é uma alternativa eficiente ao uso de tratamentos de frio para a superação da dormência.

Desempenho de diferentes estádios embrionários no cultivo in vitro de embriões de 'Pêra Rio' x 'Poncã'

Objetivou-se verificar qual o melhor estádio embrionário para o cultivo de embriões imaturos oriundos de frutos provenientes de hibridação entre 'Pêra Rio' x 'Poncã' , bem como o efeito de diferentes concentrações do meio de cultura MT. Os embriões em diferentes estádios de desenvolvimento (globulares, torpedo e cordiforme) foram excisados e inoculados em tubos de ensaio contendo 15 mL do meio MT com diferentes concentrações (0; 50; 100 e 150% da composição original e acrescido de 50 g.L-1 de sacarose). Após a inoculação, os embriões foram incubados à 27±1ºC, fotoperíodo de 16 horas e irradiância de 32 mmol.m-2.s-1. Após 90 dias, avaliou-se o comprimento da parte aérea e do sistema radicular, massa fresca e número de folhas das plântulas. Melhor desenvolvimento dos embriões imaturos foi obtido em estádio cotiledonar e com a concentração de 150% do meio MT.

Adequação de nutrientes do meio MT para o cultivo de embriões imaturos de tangerineira 'Cleópatra'

Este trabalho teve como objetivo ajustar a concentração de macronutrientes, micronutrientes e vitaminas do meio de cultura Murashige & Tucker (MT), de modo a permitir a germinação de embriões imaturos, menores que 3 mm, de tangerineira 'Cleópatra'. As sementes foram obtidas a partir de frutos com 4 a 5 meses após a antese, cujos embriões não germinam nos meios de cultura atualmente indicados para citros. Inicialmente, os embriões foram cultivados em meio de cultura básico contendo sacarose e ágar, seguindo uma seqüência de etapas, procedendo-se a ajustes da concentração normal dos macronutrientes (1/1, ½ e ¼), micronutrientes (1/1, ½, ¼ e 1/1, 3/2, 2/1) e vitaminas (2/1, 1/1 e ½) do meio MT. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em um esquema fatorial 3 (concentrações do MT) x 4 (comprimentos de embriões), com 10 repetições. As variáveis, porcentagem de germinação de embriões, porcentagem de plântulas normais e comprimentos dessas plântulas foram avaliadas 30 dias após a inoculação dos embriões em meio de cultura. Os melhores resultados foram obtidos utilizando-se de metade da concentração normal de macronutrientes, não havendo necessidade de alterar as concentrações de micronutrientes e vitaminas.

Reação de híbridos somáticos de citros à infecção por Phytophthora nicotianae

Este trabalho avaliou a resistência à infecção de tronco e de raízes por Phytophthora nicotianae em híbridos somáticos de citros com potencial para serem utilizados como porta-enxertos. Os híbridos somáticos avaliados foram laranja 'Hamlin' (Citrus sinensis) + toranja 'Indian Red' (Citrus grandis) (plantas 1 e 2) e laranja 'Hamlin' (C. sinensis) + toranja 'Singapura' (C. grandis). Plantas de limão 'Cravo' (Citrus limonia), laranja 'Caipira' (C. sinensis), laranja-azeda (C. aurantium) e Poncirus trifoliata 'Davis A' (Poncirus trifoliata) foram utilizadas como plantas-controle devido à reação conhecida à infecção pelo patógeno. Avaliações realizadas entre 30 e 60 dias após as inoculações com o patógeno incluíram o comprimento das lesões no tronco e a massa seca do sistema radicular nas plantas avaliadas. O híbrido somático laranja 'Hamlin' + toranja 'Indian Red' (planta 1) mostrou-se tolerante a P. nicotianae, indicando potencial para continuidade nas suas avaliações como porta-enxerto para citros.

Estratificação in vitro de embriões zigóticos de pessegueiro em diferentes meios de cultura e concentrações de sacarose

A embriocultura permite desenvolver embriões de sementes que não germinariam em condições convencionais de semeadura. Esta técnica é útil na obtenção de cultivares de pessegueiro com maturação precoce. O uso de genótipos diferentes faz com que sejam necessários ajustes ao protocolo. O objetivo deste trabalho foi testar quatro tipos de meio de cultura (WPM, SH, MS e SBH), em duas concentrações de sacarose (1,5 e 3%), a fim de avaliar qual a melhor combinação para o cultivo de embriões de pessegueiro in vitro. Os genótipos utilizados como modelo do estudo foram 'Conserva 1129', em 2009, e 'Conserva 844', em 2010. Avaliaram-se a germinação, o desenvolvimento na fase in vitro, o comprimento de caule, número de folhas, sobrevivência das plântulas e formação de rosetas, em casa de vegetação. Considerando as condições em que os experimentos foram conduzidos, pode-se concluir que a estratificação e a germinação de embriões imaturos de pessegueiro in vitro melhoram quando realizadas em meios com maior concentração salina e de sacarose.

Germinação in vitro de embriões zigóticos maduros de macaúba influenciada por temperaturas de armazenamento dos frutos e concentrações de sacarose

Este trabalho teve como objetivos avaliar a influência de temperaturas de armazenamento dos frutos e de concentrações de sacarose na germinação in vitro de embriões zigóticos maduros de macaúba (Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd ex Mart.). Após a colheita, os frutos foram armazenados à temperatura ambiente (27 ± 2 ºC) ou em câmara fria (a 12-15 ºC). Decorrido esse período, os embriões foram isolados e, imediatamente, inoculados em meio básico MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) suplementado com 100 mg L-1 de mioinositol, 2 g L-1 de carvão ativado e 6,5 g L-1 de ágar Merck®. O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 6. Os tratamentos consistiram da combinação de duas condições de armazenamento dos frutos após a colheita (frutos armazenados à sombra, em temperatura ambiente (27 ± 2 ºC) ou em câmara fria a 12 - 15 ºC, na ausência de luz, durante 30 dias, e concentrações de sacarose no meio nutritivo (5, 10, 15, 20, 25 e 30 g L-1). Utilizaram-se cinco repetições por tratamento, cada uma composta por cinco explantes. Consideraram-se como fonte de explantes embriões zigóticos extraídos de frutos maduros. Após 90 dias, avaliaram-se a germinação de plântulas completas, os percentuais de plântulas viáveis ou normais, plântulas que emitiram apenas primórdios de raiz e plântulas hiper-hídricas. Observou-se maior percentual de germinação nos embriões isolados de frutos mantidos em temperatura ambiente. Menor porcentagem de plântulas com primórdios de raiz foi obtida para os frutos mantidos em câmara fria. O meio acrescido de sacarose a 30 g L-1 contribuiu para o desenvolvimento de plântulas viáveis ou normais.

SENSIBILIDADE À DESSECAÇÃO DE EMBRIÕES DE Inga vera Willd. FORMADOS SOB DIFERENTES CONDIÇÕES AMBIENTAIS1

Ingá, espécie nativa do Brasil utilizada na arborização urbana e em sistemas agroflorestais, tem sementes altamente sensíveis à dessecação. Essa sensibilidade pode ser condicionada pelas condições ambientais em que as sementes são formadas. Neste estudo, analisou-se o grau de sensibilidade à dessecação de embriões de ingá de origens distintas e formados sob diferentes condições ambientais. Os embriões foram obtidos de frutos maduros de matrizes em São Paulo e Minas Gerais e analisados quanto ao teor de água e conteúdo de massa de matéria seca no momento da dispersão e quanto ao grau de sensibilidade à dessecação. Os resultados confirmaram a hipótese de que a sensibilidade à dessecação não é totalmente predeterminada para as sementes de uma espécie e pode apresentar variações conforme a região de procedência. Verificou-se, ainda, que as condições do ambiente, principalmente temperatura do ar e disponibilidade hídrica, podem condicionar o ciclo de maturação, o grau de maturidade dos embriões após a dispersão dos frutos, a aquisição da tolerância à dessecação e a qualidade final dos embriões.

Co-cultura de embriões humanos em células vero e transferência em fase de blastocisto

Objetivos: determinar se o dia da transferência ou o estágio em que o embrião é transferido interferem nas taxas de gravidez e implantação. Métodos: cento e sete pacientes tiveram seus oócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Os embriões foram co-cultivados em células Vero e transferidos no dia 3 ou dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica. Resultados: a taxa de implantação dos embriões transferidos no dia 5 foi significativamente maior que quando os embriões eram transferidos no dia 3, mas as taxas de gravidez não variaram. Observou-se uma diferença significativa nas taxas de gravidez quando se comparou o estágio em que o embrião era transferido, obtendo-se 70,6% de gravidez quando se transferiam blastocistos expandidos e 20,0% e 10,5% quando eram transferidos blastocistos iniciais ou mórulas, respectivamente. Conclusões: as taxas de implantação e gravidez são significativamente aumentadas quando se transferem embriões em estágio de blastocisto expandido, mas os meios e condições de cultura de que dispomos no momento ainda são insuficientes para nos fornecer uma taxa satisfatória de embriões neste estágio.

Avaliação do Desenvolvimento de Embriões Bovinos Pós-Biópsia: um Modelo para Treinamento

Objetivo: montar um protocolo animal para estudo e treinamento em biópsia embrionária. Métodos: ovários de vaca obtidos em abatedouro eram transportados ao laboratório onde os oócitos aspirados eram maturados. Posteriormente eram submetidos à fertilização in vitro. No dia 5 pós-fertilização, os embriões eram biopsiados, com a abertura da zona pelúcida realizada mediante lâmina de corte ajustada ao microscópio óptico. Após abertura da zona pelúcida 1 ou 2 blastômeros eram removidos dos embriões. Após a biópsia, os embriões permaneciam em co-cultivo por mais três dias. Ao final deste tempo, o desenvolvimento dos embriões era avaliado e comparado ao do grupo controle por meio de estudo morfológico e contagem do número de células, usando coloração específica para núcleos. Resultados: dos 57 embriões biopsiados, 40 atingiram o estágio de blastocisto (70,2%) e em 11 foi observado o "hatching" (27,5%). No grupo controle obtiveram-se 42 blastocistos (73,7%) e, destes, 11 chegaram a "hatching" (26,2%). Após contagem do número de células, observou-se que não houve diferença estatisticamente significante entre os 2 grupos. Conclusão: podemos verificar por meio dos resultados que o protocolo proposto foi tecnicamente viável, além de fornecer bom número de embriões, pela facilidade de obtenção de oócitos bovinos, podendo ser adotado para treinamento.

Transferência de blastocisto após descongelamento de embriões em mórula resultando em gestação gemelar: relato de caso

A criopreservação de embriões em estágios mais tardios do desenvolvimento parece apresentar resultados satisfatórios. Com o objetivo de melhor testar a sobrevivência e o desenvolvimento de embriões, os mesmos foram criopreservados e descongelados em estadio de mórula ou blastocisto e deixados em cultura para que pudesse ser avaliada sua evolução natural. Dos 2 blastocistos e 5 mórulas congelados, 4 mórulas sobreviveram ao descongelamento, tendo sido transferidas em estadio de blastocisto, 24 horas depois. A transferência, realizada em paciente jovem, segundo casamento de homem vasectomizado há dez anos, resultou em gestação gemelar. O descongelamento de embriões em estadio de mórula e a observação in vitro da retomada de seu desenvolvimento até o estadio de blastocisto fornecem um parâmetro adicional na avaliação da qualidade do embrião e, provavelmente, melhore as taxas de gravidez.