Ondas ultrassônicas e pérolas de vidro: um novo método de extração de beta-galactosidase para uso em laboratório

The optimization of a traditional technique of cellular disruption by abrasion was carried out and a process using ultrasonic waves associated with glass pearls to extract beta-galactosidase from Kluyveromyces marxianus proposed. In the first case, the effects of the diameter and weight of the pearls in relation to the volume of cellular suspension and amount of time for cellular disruption were evaluated. The efficiency of the new process of cellular disruption was evaluated by varying the length of time of sonification and comparing with the method of abrasion under the same conditions. The proposed method can be efficiently applied to obtain beta-galactosidase at laboratory scale.

A new approach to evaluate immobilization of β-galactosidase on Eupergit® C: structural, kinetic, and thermal characterization

This study aimed to evaluate β-galactosidase immobilization. For this purpose, the ionic strength of the buffer, reaction time, amount of the immobilization support, and pH were evaluated by a central composite design. Assay 8, which consisted of 1.5 mol L-1 phosphate buffer (pH 7.5) and a reaction time of 2 h, produced the maximum yield. Eupergit® C (400 mg) was subsequently used as an immobilization support. Immobilization kinetics wereinvestigated, and a significant increase in the yield was obtained after immobilization compared with that obtained from assay 8 (22.0 U mL-1 vs. 15.6 U mL-1). The enzyme efficiency of actuation was evaluated using o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside and lactose, with lactose providing better results. The reuse of β-galactosidase was evaluated, and more than 50% of the initial enzyme activity was maintained after five cycles of use. Enzyme characterization revealed that immobilization improved some aspects of the thermostability of β-galactosidase.

Adsorção de alfa-lactalbumina do soro de leite em hidroxiapatita: efeito do pH e da temperatura e análise termodinâmica

The nutritional and functional benefits offered by whey protein α-lactalbumin justify the great interest in its manufacture in large quantities at a high purity level. Hydroxyapatite is a calcium phosphate material able to adsorb proteins and can be synthesized at low production cost. Therefore, this work evaluated the adsorption of α-lactalbumin on hydroxyapatite using solid-liquid phase equilibrium data reported as adsorption isotherms. Van't Hoff's thermodynamics analysis showed that the adsorption process is entropically driven.

CARBOXYLATION OF SILVER NANOPARTICLES FOR THE IMMOBILIZATION OF β-GALACTOSIDASE AND ITS EFFICACY IN GALACTO-OLIGOSACCHARIDES PRODUCTION

The present study investigated the carboxylation of silver nanoparticles (AgNPs) by 1:3 nitric acid-sulfuric acid mixtures for immobilizing Aspergillus oryzae β-galactosidase. Carboxylated AgNPs retained 93% enzyme upon immobilization and the enzyme did not leach out appreciably from the modified nanosupport in the presence of 100 mmol L-1 NaCl. Atomic force micrograph revealed the binding of β-galactosidase on the modified AgNPs. The optimal pH for soluble and carboxylated AgNPs adsorbed β-galactosidase (IβG) was observed at pH 4.5 while the optimal operating temperature was broadened from 50 ºC to 60 ºC for IβG. Michaelis constant, Km was increased two and a half fold for IβG while Vmax decreases slightly as compared to soluble enzyme. β-galactosidase immobilized on surface functionalized AgNPs retained 70% biocatalytic activity even at 4% galactose concentration as compared to enzyme in solution. Our study showed that IβG produces greater amount of galacto-oligosaccharides at higher temperatures (50 ºC and 60 ºC) from 0.1 mol L-1 lactose solution at pH 4.5 as compared to previous reports.

Esquitossomose mansônica hepatoesplênica humana: produção de TNF-alfa em monócitos

OBJETIVO: Investigar os níveis de liberação de TNF-alfa?em cultura de monócitos em portadores humanos da forma hepatoesplênica de esquistossomose mansônica. MÉTODO: Foram incluídos aleatoriamente, no estudo, 39 voluntários de idades variando entre 15 e 31 anos, 19 homens e 20 mulheres, divididos em três grupos. Grupo 1 (GC) 12 indivíduos sadios, sem esquistossomose. Grupo 2 (AI) 18 indivíduos portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica, que tinham se submetido a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior, quando tinham idades entre 7 e 16 anos. Esses pacientes receberam oxaminiquine na dose de 20mg/kg 30 dias antes do procedimento cirúrgico. O seguimento médio atual é de cerca de 8 anos. Grupo 3 - pacientes esplenectomizados sem auto-implante esplênico (ESAI) constituído de nove adultos jovens que tinham se submetido à esplenectomia sem auto-implante esplênico e desconexão ázigo-porta. Os pacientes esquistossomóticos dos grupos 2 e 3 tiveram confirmação dessa doença pela presença de fibrose de Symmers nas biópsias hepáticas realizadas durante o ato cirúrgico. Foram colhidos 6 ml de sangue periférico de cada um dos voluntários incluídos no presente estudo, cujos monócitos foram separados por centrifugação e cultivados no meio de cultura CultilabÒ). Amostras de 100ml do sobrenadante da cultura de monócitos (10(6) células/ml), de cada indivíduo dos três grupos, eram colhidos para determinação das concentrações de TNF-alfa. Essa concentração era mensurada pelo estudo colorimétrico de ELISA para citocinas (QuanticininasTM - Sistema R&D), após 4 horas de estimulação com PMA e incubação, em uma atmosfera úmida com 5% de CO² a 37ºC. RESULTADOS: As concentrações de TNF-alfa? não diferiram significantemente nos três grupos estudados [(GC 135,0 ± 51,6 pg/ml; AI 97,0 ± 25,4 pg/ml e ESAI 107,0 ±. 52,1 pg/ml) - ANOVA, F = 0,210; p = 0,813]. CONCLUSÃO: Os achados contribuem para hipótese de que após esplenectomia com ou sem auto-implante esplênico a função dos monócitos, com relação a produção de TNF-alfa, mantém-se preservada.

Associação entre os polimorfismos HaeIII e MspI do gene para o receptor alfa de estrogênio e densidade mamográfica em mulheres após a menopausa

OBJETIVO: Avaliar a presença dos polimorfismos HaeIII e MspI do gene para o receptor de estrogênio alfa, bem como fatores clínicos e suas possíveis associações com a densidade mamográfica em mulheres após a menopausa. MÉTODOS: Foram avaliadas 115 mulheres após a menopausa, não usuárias de terapia hormonal e sem lesão mamária clínica ou mamograficamente identificada. A densidade mamográfica foi determinada por três observadores independentes, tomando-se como base a classificação dos padrões mamográficos do ACR-BIRADS®, 2003 (duas avaliações subjetivas e uma computadorizada - Adobe Photoshop® 7.0). Amostras de raspado bucal foram obtidas para extração de DNA e em seguida foi realizada uma PCR-RFLP (Polymerase Chain Reation - Restriction Fragment Length Polymorphism) para análise de polimorfismos presentes no íntron 1 e éxon 1 do gene do REalfa (HaeIII e MspI). RESULTADOS: O polimorfismo HaeIII foi encontrado em 43 (37,4%) das 115 mulheres, ao passo que o MspI estava presente em 96 (83,5%) das mesmas. Houve alto grau de concordância entre os três observadores na determinação da densidade mamográfica. Trinta e quatro (29,6%) mulheres tinham mamas densas, e 81 (70,4%), mamas lipossubstituídas. CONCLUSÃO: Não houve associação entre o polimorfismo HaeIII do gene para o receptor de estrogênio alfa e densidade mamográfica (Fisher = 0,712). Houve associação próxima à significância estatística entre o polimorfismo MspI e densidade (Fisher = 0,098). Idade, paridade e índice de massa corporal mostraram-se associados com densidade mamográfica.

Expressão local do fator de necrose tumoral alfa na ruptura prematura de membranas

OBJETIVO: comparar a expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em membranas ovulares com ruptura prematura (RPM) e com ruptura oportuna das mesmas; verificar a associação entre a expressão do TNF-α em membranas ovulares e o grau de corioamnionite das mesmas e correlacionar a expressão do TNF-α e o tempo de ruptura das membranas. MÉTODOS: foram analisadas as membranas ovulares de 31 parturientes com RPM, com idade gestacional acima de 34 semanas, e de 14 parturientes com ruptura oportuna das membranas, com idade gestacional igual ou maior de 37 semanas. A detecção da corioamnionite foi feita por meio de estudo histopatológico. A avaliação da expressão do TNF-α foi feita por meio de técnica imunoistoquímica, na qual foi empregado o método streptavidina-biotina-peroxidase (LSAB). RESULTADOS: o tempo médio de ruptura foi de 16,6 horas. A frequência da expressão de TNF-α, nos Grupos Controle e Estudo, não mostrou diferença significante (χ2=6,6; p=0,08). No Grupo Estudo, houve correlação entre o grau de corioamnionite e a intensidade da expressão de TNF-α (coeficiente de Spearman (Rs)=0,4; p=0,02). CONCLUSÕES: não houve diferença significante entre as expressões do TNF-α em membranas ovulares com ruptura prematura e com ruptura oportuna das mesmas; no Grupo Estudo, constatou-se associação significante entre a expressão do TNF-α e o grau de corioamnionite e não houve associação entre o tempo de ruptura e a intensidade da expressão do TNF-α.

Concentração de alfa-tocoferol no soro e colostro materno de adolescentes e adultas

OBJETIVOS: avaliar a concentração de alfa-tocoferol no soro e colostro materno de puérperas adolescentes e adultas e verificar a adequação nutricional de vitamina E do colostro oferecido ao lactente. MÉTODOS: participaram do estudo 72 puérperas, sendo 25 adolescentes e 47 adultas. Foram coletados 5 mL de sangue e 2 mL de colostro em condição de jejum para análise dos níveis de alfa-tocoferol. As amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência. A adequação nutricional do colostro para a vitamina E foi calculada pelo produto do volume estimado de ingestão de leite com a concentração de alfa-tocoferol no colostro e por comparação direta desse produto com o valor de referência para ingestão do nutriente (4 mg/dia). RESULTADOS: os níveis de alfa-tocoferol no soro de puérperas adolescentes e adultas foram, respectivamente, 30,8±9,8 e 34,1±9,5 µmol/L (média±DP). No colostro, as adolescentes apresentaram concentração de alfa-tocoferol de 32,9±15,8 µmol/L e as adultas de 30,4 ± 18,0 µmol/L, não sendo encontrada diferença significativa entre as concentrações séricas, assim como no colostro dos grupos estudados. CONCLUSÕES: Tanto as puérperas adolescentes quanto as adultas apresentaram um estado nutricional satisfatório de vitamina E refletido no colostro cujos valores foram capazes de suprir o requerimento nutricional do lactente, sugerindo que a idade materna não influencia os níveis de alfa-tocoferol do colostro humano.

Níveis de alfa-tocoferol no soro e colostro de lactantes e associação com variáveis maternas

OBJETIVOS: Diagnosticar bioquimicamente o estado nutricional de vitamina E de lactantes por meio da análise do alfa-tocoferol no soro e no colostro, verificar sua associação com variáveis maternas e determinar a prevalência de deficiência de vitamina E nessas mulheres. MÉTODOS: Participaram do estudo 103 puérperas que foram classificadas quanto às seguintes variáveis maternas: idade, estado nutricional pré-gestacional, ganho de peso gestacional, paridade e tipo de parto. Amostras de soro e colostro foram coletadas em jejum no pós-parto imediato e o alfa-tocoferol foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Para definir o estado nutricional de vitamina E, foi adotado ponto de corte sérico (697,7 μg/dL). A análise estatística foi realizada com o uso do teste t de Student para amostras independentes e correlação de Pearson. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. RESULTADOS: A concentração média de alfa-tocoferol foi 1.125,1±551,0 μg/dL no colostro e 1.138,6±346,0 μg/dL no soro, indicativo de estado nutricional bioquímico adequado. Entretanto, ao analisar as puérperas individualmente, constatamos que 16% apresentaram valores abaixo do esperado para esta vitamina. As mulheres submetidas à cesárea apresentaram níveis de alfa-tocoferol no colostro (1.280±591 μg/dL) significativamente maiores em relação àquelas cuja via de parto foi a normal (961,7±370 μg/dL) (p<0,05). Verificou-se que as parturientes com excesso de peso pré-gestacional tiveram concentração da vitamina no colostro maior (1.331,5±548 μg/dL) quando comparadas às mulheres com baixo peso (982,1±374 μg/dL) ou eutrofia (992,3±346 μg/dL) (p<0,05). Entretanto, as demais variáveis estudadas não apresentaram associação com o alfa-tocoferol do colostro. Além disso, nenhuma variável mostrou estar relacionada aos níveis da vitamina no soro materno e não foi demonstrada correlação entre os níveis de alfa-tocoferol no soro e no leite. CONCLUSÕES: Apesar do diagnóstico de satisfatório estado nutricional, as lactantes apresentaram risco importante de deficiência subclínica para vitamina E. Sugere-se que a concentração de alfa-tocoferol presente no colostro esteja associada ao tipo de parto e ao estado nutricional pré-gestacional da mulher.

Comparação entre a concentração sérica de alfa-tocoferol de puérperas assistidas em maternidades públicas e privadas no Nordeste do Brasil

OBJETIVO: Comparar a concentração de alfa-tocoferol no soro entre puérperas atendidas em maternidades das redes pública e privada da cidade de Natal (RN), Brasil.MÉTODOS: Participaram do estudo 209 puérperas, sendo 96 mulheres provenientes da rede privada e 113, da rede pública, entre 24 e 48 horas pós-parto. Foram incluídas no estudo parturientes com idade a partir de 12 anos, sem patologias associadas à gestação, que tiveram concepto único sem má-formação. Mulheres descompensadas clinicamente e com gestação múltipla foram excluídas. Amostras de 5 mL de sangue de cada participante foram coletadas no período de jejum, antes da primeira refeição do dia. A concentração de alfa-tocoferol no soro (µg/dL) foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A diferença estatística entre as médias foi testada utilizando o teste t de Student.RESULTADOS: As médias da concentração de alfa-tocoferol nas puérperas da rede pública e da rede privada, respectivamente, foram 1.115,7±341,4 μg/dL e 1.355,7±397,6 μg/dL, tendo sido observada diferença estatisticamente significante (p=0,000687). Para avaliação individual da concentração de vitamina E, a deficiência foi identificada quando alfa-tocoferol <11,6 μmol/L ou <499,6 µg/dL. As puérperas da rede pública tiveram um percentual de 5,3% (n=6) de deficiência, enquanto nas participantes da rede privada tal carência não foi encontrada. Todavia, baixas concentrações (alfa-tocoferol entre 11,6-16,2 μmol/L ou 499,6-697,7 µg/dL) ocorreram tanto na rede pública como na privada: 9,7% (n=11) e 4,2% (n=4), respectivamente.CONCLUSÃO: Esses resultados destacam que as mulheres assistidas no setor público foram mais vulneráveis a desenvolver baixas concentrações de alfa-tocoferol do que as mulheres assistidas no setor privado.

Transient high-level expression of ß-galactosidase after transfection of fibroblasts from GM1 gangliosidosis patients with plasmid DNA

GM1 gangliosidosis is an autosomal recessive disorder caused by the deficiency of lysosomal acid hydrolase ß-galactosidase (ß-Gal). It is one of the most frequent lysosomal storage disorders in Brazil, with an estimated frequency of 1:17,000. The enzyme is secreted and can be captured by deficient cells and targeted to the lysosomes. There is no effective treatment for GM1 gangliosidosis. To determine the efficiency of an expression vector for correcting the genetic defect of GM1 gangliosidosis, we tested transfer of the ß-Gal gene (Glb1) to fibroblasts in culture using liposomes. ß-Gal cDNA was cloned into the expression vectors pSCTOP and pREP9. Transfection was performed using 4 µL lipofectamine 2000 and 1.5-2.0 µg DNA. Cells (2 x 10(5)/well) were harvested 24 h, 48 h, and 7 days after transfection. Enzyme specific activity was measured in cell lysate and supernatant by fluorometric assay. Twenty-four hours after transfection, treated cells showed a higher enzyme specific activity (pREP9-ß-Gal: 621.5 ± 323.0, pSCTOP-ß-Gal: 714.5 ± 349.5, pREP9-ß-Gal + pSCTOP-ß-Gal: 1859.0 ± 182.4, and pREP9-ß-Gal + pTRACER: 979.5 ± 254.9 nmol·h-1·mg-1 protein) compared to untreated cells (18.0 ± 3.1 for cell and 32.2 ± 22.2 nmol·h-1·mg-1 protein for supernatant). However, cells maintained in culture for 7 days showed values similar to those of untreated patients. In the present study, we were able to transfect primary patients' skin fibroblasts in culture using a non-viral vector which overexpresses the ß-Gal gene for 24 h. This is the first attempt to correct fibroblasts from patients with GM1 gangliosidosis by gene therapy using a non-viral vector.

Teores de retinol, beta-caroteno e alfa-tocoferol em leites bovinos comercializados na cidade de São Paulo

Os teores de retinol, beta-caroteno e alfa-tocoferol foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência em leites em pó, pasteurizados e esterilizados, comercializados na Cidade de São Paulo. Após a saponificação e extração, os compostos foram determinados simultaneamente utilizando-se coluna de sílica, fase móvel constituída por hexano:isopropanol (99:1) e fluxo de 2,0mL/min. O retinol e o beta-caroteno foram determinados no detector UV/visível e o alfa-tocoferol no detector de fluorescência, ligado em série com o anterior. Os valores de vitamina A dos leites foram calculados com e sem a consideração do beta-caroteno. A maior contribuição deste nutriente no valor de vitamina A esteve entre os leites em pó, cerca de 17% em uma das marcas. Os altos teores das vitamina A e E encontrados em alguns leites, indicam que os mesmos provavelmente receberam adição destas vitaminas, não trazendo, entretanto, tal informação no rótulo. A análise de vitaminas nestes produtos indica a necessidade de maior controle de qualidade dos mesmos.

CONFIRMAÇÃO DA IDENTIDADE DA alfa-CRIPTOXANTINA E INCIDÊNCIA DE CAROTENÓIDES MINORITÁRIOS PROVITAMÍNICOS A EM VERDURAS FOLHOSAS VERDES

Numerosos trabalhos comprovaram que os carotenóides principais de folhas verdes são invariavelmente luteína, beta-caroteno, violaxantina e neoxantina. No entanto, há discordância em torno dos carotenóides minoritários. Portanto, a espectrometria de massas por impacto de elétrons e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos foram utilizados para confirmar a identidade de carotenóides minoritários com atividade provitamínica A em verduras folhosas brasileiras. Os carotenóides pró-vitamínicos A, incluindo os isômeros cis e trans de beta-caroteno, foram separados em coluna de C18 polimérica, Vydac 201TP54, com metanol/água (98:2) como fase móvel. Os espectros UV-visível e de massas confirmaram o carotenóide monoidroxilado como sendo alfa-criptoxantina e não beta-criptoxantina como aponta a literatura internacional. Todas as onze folhas analisadas (agrião, alface crespa, alface lisa, almeirão, caruru, chicória, couve, espinafre, rúcula, salsinha e taioba) apresentaram alfa-criptoxantina, 13-cis-beta-caroteno e 9-cis-beta-caroteno, enquanto que alfa-caroteno foi encontrado em apenas quatro folhas (caruru, couve, salsinha e taioba).

Estudo da produção de beta-galactosidase por fermentação de soro de queijo com Kluyveromyces marxianus

A hidrólise enzimática da lactose por beta-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lácteos, como na obtenção de leite com baixo teor de lactose para consumo por indivíduos intolerantes à mesma e na prevenção da cristalização em produtos de laticínio. Neste trabalho, a enzima beta-galactosidase foi produzida pelo cultivo do microrganismo Kluyveromyces marxianus, em meio de cultura à base de soro de queijo em diferentes concentrações iniciais de lactose e extrato de levedura, de acordo com um planejamento fatorial. As fermentações foram conduzidas em incubador rotativo a 150rpm, a 30°C e pH inicial 5,5. A concentração celular inicial foi de 10(7) células/mL. Para a extração da enzima beta-galactosidase, foi realizada autólise das células utilizando como solvente o clorofórmio em tampão fosfato. No meio de cultura enriquecido com (NH4)2SO4, KH2PO4 e MgSO4, nas concentrações iniciais de lactose e de extrato de levedura iguais a 50g/L e 12g/L, respectivamente, obteve-se uma atividade de 28,0UGl/mL e uma concentração celular máxima de 5,3g/L.