Transformation of Xanthomonas axonopodis pv. citri by electroporation

This study describes the use of electroporation for transforming Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), the causal agent of citrus (Citrus spp.) canker. It also evaluates the methodology used for this species under different electrical parameters. The bacterium used in the study (Xac 306) was the same strain used for recent complete sequencing of the organism. The use of a plasmid (pUFR047, gentamycin r) is reported here to be able to replicate in cells of Xac. Following the preparation and resuspension of competent cells of Xac at a density of ~4 x 10(10) cfu/ml, in 10% glycerol, and the addition of the replicative plasmid, an electrical pulse was applied to each treatment. Selection of transformants showed a high efficiency of transformation (1.1 x 10(6) transformants/mug DNA), which indicates an effective, and inverse, combination between electrical resistance (50 W) and capacitance (50 µF) for this species, with an electrical field strength of 12.5 kV.cm-1 and 2.7-ms pulse duration. Besides the description of a method for electroporation of Xac 306, this study provides additional information for the use of the technique on studies for production of mutants of this species.

Escalas diagramáticas para avaliação da severidade do cancro cítrico

Escalas diagramáticas são importantes ferramentas na avaliação da severidade de doenças. Objetivando padronizar a estimativa da severidade do cancro cítrico em folhas de citros (Citrus sinensis) causada por Xanthomonas axonopodis pv. citri, foram elaboradas quatro escalas diagramáticas, considerando a ocorrência de lesões isoladas pequenas (LP), médias (LM) e grandes (LG) e de lesões associadas com o ataque da larva minadora dos citros (LMC). Cada escala possui oito níveis de porcentagens da área foliar lesionada: 0,2 a 16% para LP; 0,6 a 25% para LM; 1,8 a 30% para LG e 0,5 a 30% para LMC. Inicialmente, seis avaliadores estimaram a severidade de 447 imagens digitalizadas de folhas sintomáticas com o auxílio das quatro escalas. Após treinamento, foram avaliadas mais 115 imagens. Regressões lineares entre as severidades real e estimada foram calculadas para cada avaliador. As escalas foram validadas conjuntamente considerando acurácia, precisão e reprodutibilidade das avaliações, revelando-se adequadas para quantificação da severidade do cancro cítrico nas folhas.

Danos da morte súbita dos citros sobre a produção de laranja

A Morte Súbita dos Citros (MSC) afeta laranjeiras doces (Citrus sinensis) e algumas tangerineiras (Citrus reticulata) enxertadas em limoeiro 'Cravo' (Citrus limonia) no norte do Estado de São Paulo e sul do Triângulo Mineiro. O progresso da doença nos pomares têm causado grande preocupação para o agronegócio citrícola. Para caracterizar e quantificar os danos causados pela MSC, a produção de frutos (peso total e número de frutos por planta e tamanho dos frutos) foi avaliada em quatro talhões para cada combinação variedade ('Hamlin', 'Pêra', 'Natal' e 'Valência') / classe de idade (três a cinco anos, seis a dez anos e 11 a 15 anos). Em cada talhão, as plantas foram classificadas de acordo com a severidade de MSC (0 = sadia, 1 = sintomas iniciais e 2 = sintomas severos). Para cada nível de severidade foram colhidas dez plantas escolhidas ao acaso. Os danos foram caracterizados pela redução do peso total de frutos por planta (28% e 50% para o nível 1 e 2, respectivamente), do número total de frutos por planta (12% e 26% para o nível 1 e 2, respectivamente) e do tamanho do fruto (22% e 41% para nível 1 e 2, respectivamente). As variedades de laranja não diferiram em relação à porcentagem de redução para todas as variáveis de produção avaliadas. As plantas mais jovens tiveram a maior redução no número total de frutos por planta e as plantas com mais de cinco anos de idade tiveram as maiores reduções no tamanho dos frutos. As classes de idade não diferiram na porcentagem de redução do peso total de frutos por planta.

Effect of temperature, leaf wetness, and rainfall on the production of Guignardia citricarpa ascospores and on back spot severity on sweet orange

The black spot of citrus (Citrus sp.) is caused by Guignardia citricarpa with ascospore production depending on temperature, leaf wetness, and rainfall. The number of ascospores produced was monitored using a spore trap and climatic factors were recorded using an automated meteorological station of 'Natal' and 'Valencia' sweet orange (Citrus sinensis) orchards in Mogi Guaçu in the state of São Paulo, Brazil, from November 2000 to March 2001. The fruits were bagged to prevent infection and the bags removed from different sets of fruit for one week during each of the 18 weeks of the season in both orchards. Ascospores were produced during the entire experimental period, from spring through summer, primarily after rain events. In both orchards, ascospore production reached a peak in January and February. Ascospore production was related to leaf wetness only in the Natal orange orchard but was not related to total rainfall or temperature in either orchard. Disease was most severe on fruit exposed the 7th, 8th, and 13th weeks after beginning the experiment in both cultivars as well as after the 16th week for 'Natal'. There was a strong relationship between disease severity and total rainfall for both orchards and a weak correlation between temperature and severity in the 'Natal' block only. There was no relationship between severity and leaf wetness or ascospore numbers.

Agressividade de linhagens de Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii Tipo C em lima ácida 'Galego'

O presente trabalho objetivou gerar informações referentes à agressividade de linhagens de Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii Tipo C(Xaa-C), produtoras (PP) e não produtoras de pigmento (NP) escuro em meio de cultura, comparativamente a X. axonopodis pv. citri Tipo A (Xac) . Os tratamentos foram formados por 14 linhagens, sendo sete de Xaa-C PP, cinco Xaa-C NP, e duas linhagens de Xac. As linhagens foram inoculadas através de ferimentos, em folhas de lima ácida 'Galego' (Citrus aurantifolia Swingle), com agulha previamente mergulhada em uma suspensão de células bacterianas (10(7) UFC/mL). Foram realizadas dez repetições para cada tratamento, representadas por uma planta cada. As plantas foram mantidas em casa de vegetação durante todo o experimento. As linhagens diferiram entre si quanto ao período de incubação, diâmetro e populações bacterianas das lesões e, comparativamente, Xaa-C NP mostraram-se mais agressivas do que Xaa-C PP. Algumas linhagens induziram sintomas que diferiram quanto à presença e extensão de anasarca, halo amarelo e saliência do tecido necrosado.

Susceptibility of fruits of the 'Valência' and 'Natal' sweet orange varieties to Guignardia citricarpa and the influence of the coexistence of healthy and symptomatic fruits

The importance of the presence of symptomatic fruits with citrus black symptoms (CBS) on the disease severity level in subsequent crop production was assessed in an orchard planted with Valência and Natal sweet orange varieties. Additionally, the period of susceptibility of the fruits of these varieties was evaluated. Fruits were covered with paper bags at the stage of 75% fallen petals and were then exposed to natural infection at weekly intervals, from October 2000 to April 2001. This process was carried out in plants where the fruits from the previous harvest had been picked as well as in plants where fruits remained until natural drop. The evaluation of disease severity used a scale that varied from 0 (absence of symptoms) to 6 (severe symptoms). It was observed that, for the Valência and Natal varieties, conidia of Phyllosticta citricarpa that had formed on the lesions of fruits from the previous harvest did not significantly increase the severity of disease on the fruits of the subsequent harvest period. In this study, the protection of the fruits until 10 weeks after petal drop did not affect the number of lesions, indicating that ascospore discharges after that date were, probably, responsible for disease severity. Fruits exposed between the 20th and 24th week after 75% of the petals had fallen were symptomatic, indicating that, at this stage, the fruits were still susceptible to the pathogen.

Dinâmica temporal da população do ácaro Brevipalpus phoenicis e da leprose dos citros sob condições naturais de epidemia

A densidade populacional do ácaro vetor de Citrus leprosis virus (CiLV), Brevipalpus phoenicis, num talhão, é o principal indicador para a tomada de decisão de medidas de controle da leprose dos citros. Há pouca informação sobre o crescimento da incidência de plantas com leprose dos citros isoladamente ou em conjunto com a população do ácaro. Este trabalho teve por objetivo caracterizar o progresso temporal da população de B. phoenicis e da incidência de leprose dos citros e a relação entre essas populações, sob condições naturais de epidemia. Dois talhões de laranja doce, cvs. Valência e Natal, foram monitorados de 2002 a 2004, em intervalos de 22 dias, em média. O crescimento da incidência da doença foi lento e estimativas da taxa de progresso da doença foram bastante baixas, variando de 0,0126 a 0,0448 para 'Valência' e de 0,0044 a 0,0525 para 'Natal'. A quantidade de inóculo inicial nos ramos cresceu significativamente de um ciclo para outro. Ao final do período, a incidência foi de 32% das plantas de 'Valência' e de 6,8% na cv. Natal. Apesar de não ser sistêmica, a leprose dos citros comporta-se como poliética com acúmulo de inóculo de ano para ano, especialmente nos ramos. A incidência não esteve correlacionada com a presença de ácaros na planta em levantamentos anteriores, mas apresentou correlação positiva significativa (P<0,001) com a própria incidência da doença registrada anteriormente. Isto indica que a presença de sintomas, e não somente a de ácaros, deve ser considerada em amostragens visando controle da doença.

Incidência e severidade de cancro cítrico em laranja 'Pêra Rio' sob condições de controle químico e proteção com quebra-vento

Foram estudadas a incidência e severidade de cancro cítrico (Xanthomonas axonopodis pv. citri) em plantas de laranja 'Pêra Rio' (Citrus sinensis) no município de Ourizona, região Noroeste do Estado do Paraná, utilizando controle químico, pela aplicação de bactericida cúprico, e proteção com quebra-vento artificial. Níveis mensais de incidência foram obtidos pela proporção de folhas doentes em relação ao total de folhas avaliadas, enquanto que, níveis mensais de severidade foram determinados por meio de escalas diagramáticas específicas considerando apenas folhas doentes. Os dados foram dispostos em curvas de progresso temporal e analisados com relação à área sob a curva de progresso da doença estandardizada (AUDPC*) e o coeficiente de determinação (R²) obtido entre os níveis de incidência e severidade. A aplicação de cobre apresentou efeito significativo na redução dos níveis de cancro cítrico e o emprego de quebra-vento pouco ou nada contribuiu para o controle da doença. Após 29 meses, plantas submetidas à aplicação freqüente de bactericida cúprico apresentaram valores médios de AUDPC* de incidência 43,5% inferiores aos observados nas plantas não protegidas quimicamente. O mesmo comportamento foi observado para a severidade da doença. Após 18 avaliações mensais, os valores de AUDPC* de severidade para as plantas submetidas à aplicação de produto cúprico foram 37,1% menores do que para as plantas não protegidas quimicamente. Para os dois anos agrícolas estudados, os valores de R² entre os níveis de incidência e severidade de cancro cítrico foram superiores a 0,80 (p<0,01).

Determinação e distribuição de ácido ascórbico em três frutos tropicais

O método clássico iodimétrico foi utilizado para determinação de ácido ascórbico (AA) nos frutos araçá (Eugenia sp.), acerola (Malphigia sp.) e laranja (Citrus sinenses). Os frutos coletados foram classificados como verdes, verde- amarelados ou amarelos conforme a cor superficial. Os frutos foram levados ao laboratório e resfriados para minimizar a oxidação de AA. Os teores determinados de AA para o araçá evidenciaram que há uma gradiente de concentração entre as partes superior e inferior dos frutos, sendo a concentração em C2 (concentração de ácido ascórbico na parte inferior do fruto) sempre maior que a concentração em C1 (concentração de ácido ascórbico na parte superior do fruto ligada ao pedúnculo). Comportamento semelhante também foi observado para acerolas e laranjas, que apresentaram uma concentração média na parte superior de 17,7 mg g-1 e 0,612 mg L-1 e na parte inferior 19,6 mg g-1 e 0,665 mg L-1, respectivamente. Pelos resultados obtidos pode-se concluir que os três frutos apresentam uma distribuição heterogênea de AA e essa variação é mais pronunciada para frutos verdes, i.e. frutos menos adequados para consumo.

Visualização in vitro da colonização de raízes por rizobactérias

É proposto nesse trabalho a utilização do substrato phytagel para a germinação de sementes bacterizadas e visualização de colônias bacterianas. Sementes de limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck) foram inoculadas e monitoradas com rizobactérias utilizando-se tubos de ensaio contendo diferentes substratos para germinação de sementes, quais sejam: Ágar-Ágar, Ágar Noble e Phytagel, onde foram avaliados sete isolados rizobacterianos além de um isolado de Escherichia coli DH5a como controle negativo. Verificou-se que o Phytagel permitiu uma visualização nítida da colonização ao longo das raízes, pelas bactérias, como também proporcionou ser uma boa ferramenta para estudar a colonização via microscopia de varredura. As rizobactérias que melhor colonizaram as raízes e que apresentaram turbidez no ágar, ao seu redor, mostraram-se aderidas à superfície radicular, com colonização eficiente em diferentes sítios ao longo das raízes, quando observadas em alta magnificação.

Etiology and epidemiology of Pythium root rot in hydroponic crops: current knowledge and perspectives

The etiology and epidemiology of Pythium root rot in hydroponically-grown crops are reviewed with emphasis on knowledge and concepts considered important for managing the disease in commercial greenhouses. Pythium root rot continually threatens the productivity of numerous kinds of crops in hydroponic systems around the world including cucumber, tomato, sweet pepper, spinach, lettuce, nasturtium, arugula, rose, and chrysanthemum. Principal causal agents include Pythium aphanidermatum, Pythium dissotocum, members of Pythium group F, and Pythium ultimum var. ultimum. Perspectives are given of sources of initial inoculum of Pythium spp. in hydroponic systems, of infection and colonization of roots by the pathogens, symptom development and inoculum production in host roots, and inoculum dispersal in nutrient solutions. Recent findings that a specific elicitor produced by P. aphanidermatum may trigger necrosis (browning) of the roots and the transition from biotrophic to necrotrophic infection are considered. Effects on root rot epidemics of host factors (disease susceptibility, phenological growth stage, root exudates and phenolic substances), the root environment (rooting media, concentrations of dissolved oxygen and phenolic substances in the nutrient solution, microbial communities and temperature) and human interferences (cropping practices and control measures) are reviewed. Recent findings on predisposition of roots to Pythium attack by environmental stress factors are highlighted. The commonly minor impact on epidemics of measures to disinfest nutrient solution as it recirculates outside the crop is contrasted with the impact of treatments that suppress Pythium in the roots and root zone of the crop. New discoveries that infection of roots by P. aphanidermatum markedly slows the increase in leaf area and whole-plant carbon gain without significant effect on the efficiency of photosynthesis per unit area of leaf are noted. The platform of knowledge and understanding of the etiology and epidemiology of root rot, and its effects on the physiology of the whole plant, are discussed in relation to new research directions and development of better practices to manage the disease in hydroponic crops. Focus is on methods and technologies for tracking Pythium and root rot, and on developing, integrating, and optimizing treatments to suppress the pathogen in the root zone and progress of root rot.

Characterization of Xanthomonas spp. strains by bacteriocins

Twenty-five strains of Xanthomonas axonopodis pv. citri and 14 strains of Xanthomonas spp. were tested for bacteriocin production. X. axonopodis pv. passiflorae strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 X. axonopodis pv. citri strains evaluated in this study while strains of X. axonopodis pv. manihotis and X. campestris pv. campestris showed variable sensitivity. Only five of the 25 X. axonopodis pv. citri strains were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by the Xanthomonas axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar-2850 A) strains were thermolabile, resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse while the bacteriocin produced by X. axonopodis pv. citri was sensitive to these enzymes. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. passiflorae and X. axonopodis pv. citri were called passifloricin and citricin, respectively.

Ontogênese de caneluras em pedúnculo de flores de laranjeira doce infectados pelo vírus da tristeza dos citros estirpe "Capão Bonito"

Um estudo da ontogênese das caneluras induzidas em ramos de laranjeiras doces suscetíveis por isolados severos do vírus da tristeza dos citros (Citrus tristeza vírus - CTV) foi feito usando-se como modelo pedúnculos florais e de frutos. O menor calibre destes órgãos permite um melhor acompanhamento do processo. As observações foram feitas em laranjeira cv. Pêra infetada pelo isolado severo Capão Bonito do CTV. Cinco fases do processo de formação de caneluras puderam ser deduzidas pelas análises anatômicas. As primeiras alterações são representadas pelo aparecimento de células adensadas, hipertrofia e hiperplasia no parênquima e câmbio do floema e uma desorganização generalizada desta área. Segue-se uma atividade intensa do câmbio do floema adjacente e sua expansão em direção ao xilema. Esta invasão do xilema resulta na ruptura do anel do xilema pela massa celular do floema constituída de células recém formadas de parede celular delgada. Esta invasão do floema em direção ao xilema inicia um processo de degeneração dos vasos e parênquima do xilema. Finalmente há um colapso completo da região do xilema invadida, que é substituída pela massa do floema, resultando na canelura, notada ao se remover a casca.

Desenvolvimento de um sistema de apoio à decisão para a diagnose de doenças, pragas e distúrbios abióticos dos citros

A preocupação com a diagnose dos problemas que afetam as plantas cítricas proporcionou ao longo dos anos o acúmulo de conhecimento, que precisava ser organizado e divulgado de forma eficiente e rápida. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho construir uma base de conhecimentos para diagnóstico de doenças bióticas e abióticas dos citros, desenvolver e implementar o sistema de apoio à decisão (SAD) e avaliar o sistema. O SAD foi construído utilizando a ferramenta 'Borland Delphi' versão 5. Foram formuladas 562 perguntas, 322 regras e anexadas fotografias para facilitar o diagnóstico de 34 doenças, 40 pragas e 34 distúrbios abióticos dos citros. A avaliação do SAD foi dividida em verificação e validação. Na verificação, o SAD foi submetido a uma análise por meio de questionário a 5 especialistas em citros. A validação do programa foi realizada com quatro grupos, de diferentes níveis de conhecimento (10 pessoas/grupo), tentando diagnosticar corretamente. Obteve-se um acerto de 45,6% dos usuários e 93,6% do SAD. O sistema foi denominado Dr. Citrus (protótipo com registro no INPI n° 014070009188).

Diversidad genética de aislamientos de Bacillus subtilis con potencial para el control biológico de Colletotrichum acutatum y Guignardia citricarpa

El sector citrícola enfrenta serios problemas representados por enfermedades en las flores y en frutos jóvenes que además de disminuir la productividad, devalúan los frutos por el aspecto que le dan a los mismos. Tales enfermedades están representadas, principalmente, por la mancha negra de los frutos cítricos (MNC) y por la caída prematura de los frutos cítricos (CPFC), donde la medida predominante de control es la pulverización con productos químicos. Entretanto, los costos financieros y ambientales de las aplicaciones con estés productos químicos, sumado a las crecientes restricciones de la presencia de residuos, están a exigir el estudio de nuevas alternativas de control. Entre estas, el control biológico surge como una alternativa importante. Estudios fueron anteriormente realizados, bajo condiciones de laboratorio y de campo, con el objetivo de determinar la potencialidad de aislados de Bacillus subtilis en el control de las enfermedades mencionadas arriba, puesto que, uno aislado, el ACB-69 fue el que presentó la mejor eficiencia de control. Frente a lo anteriormente expuesto y, sabiendo que, el conocimiento de la biodiversidad de los seres es importante para la determinación de sus funciones potenciales, el presente proyecto de investigación tuvo como objetivo estudiar la diversidad genética, a través de marcadores moleculares AFLP, de 32 aislamientos de B. subtilis con la finalidad de se encontrar, dentro los mismos, uno (o más aislados) que presentase mayor semejanza con el ACB-69 y que cuando testado, bajo condiciones naturales de ocurrencia de las enfermedades, si puede encontrar similar control. En función de los resultados experimentales obtenidos, se concluyo que: (a) los aislados de B. subtilis estudiados se agruparon en el filograma de distancia genética, independiente de la procedencia o del huésped; (b) los aislados ACB-69 y ACB-83, con potencial para el control de la caída prematura de los frutos cítricos, comparten la misma ancestralidad, lo que puede ser evaluado por la metodología aplicada; c) en términos biológicos, el aislado ACB-83 merece mas estudios cuanto a la viabilidad de control de las enfermedades caída prematura de los frutos cítricos y de la mancha negra, bajo condiciones de campo.