Caracterização morfológica e fisiológica de isolados de Colletotrichum sp. causadores de antracnose em solanáceas

A antracnose é uma doença freqüente nas hortaliças solanáceas. O agente causal é reportado como o fungo Colletotrichum gloeosporioides. Neste trabalho caracterizou-se a morfologia e a fisiologia de Colletotrichum sp. obtidos de pimenta, pimentão e jiló. A caracterização morfológica se baseou no tamanho e forma dos conídios e na forma dos apressórios de 30 isolados. A caracterização fisiológica foi baseada no crescimento em diferentes temperaturas, utilização de diferentes fontes de carbono e sensibilidade ao fungicida benomyl. Quinze isolados foram cultivados em meio BDA, nas temperaturas de 10, 15, 20, 25, 28, e 30ºC. Trinta e dois isolados foram cultivados em meio mínimo acrescido de glicose, frutose, lactose, maltose, sacarose ou amido. Além disso, 43 isolados foram cultivados em meio BDA suplementado com 0, 1, 10 e 100 mig/mL de benomyl. Os isolados de jiló apresentaram menor sensibilidade ao benomyl e predominância de conídios fusiformes, com ápices afilados e menores dimensões, características semelhantes às citadas para C. acutatum. Os isolados de pimentão e pimenta apresentaram alta sensibilidade ao benomyl e predominância de conídios cilíndricos com ápices arredondados, características citadas para C. gloeosporioides. Apressórios de formato irregular, circular e ovalado foram observados independente do hospedeiro de origem do isolado. O amido foi a fonte de carbono que proporcionou maior desenvolvimento micelial para a maioria dos isolados. A temperatura ótima de desenvolvimento, para todos os isolados, foi próxima a 25ºC, exceto para um único isolado de pimenta, com maior desenvolvimento a 28ºC. A velocidade de crescimento micelial para todos os isolados, em todas as temperaturas testadas, foi semelhante à apresentada pelo isolado padrão de C. acutatum usado no teste. Os isolados de pimentão e pimenta foram os que mostraram maior variabilidade para as características estudadas. Finalmente, ficou demonstrado que C. acutatum também está associado à antracnose nessas solanáceas.

Caracterização molecular através da técnica fAFLP de isolados de Diaporthe citri

A citricultura é um mercado em expansão, principalmente no Estado de São Paulo, cuja importância na balança comercial já é reconhecida. Como em qualquer espécie cultivada, o crescimento das áreas de cultivo favorecem também o crescimento de problemas fitossanitários. Desta forma, as espécies de citros são afetadas por diversas doenças destacando-se entre elas a melanose, causada por Diaporthe citri (Wolf.), à qual a grande maioria das variedades comerciais são suscetíveis. O conhecimento da diversidade intra-específica é de grande importância, já que esta poderá auxiliar na seleção de variedades com resistência. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética em isolados de Diaporthe citri, originários de diferentes locais, variedades e partes da planta, utilizando marcadores moleculares. Marcadores do tipo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) foram utilizados para caracterização de dez isolados do patógeno. Os DNAs genômicos extraídos da massa micelial foram utilizados nas reações de amplificação. A técnica fluorescent AFLP permitiu a distinção dos isolados estudados, tendo sido classificados em quatro grupos distintos. Contudo, estes grupos não foram formados em razão da região geográfica, parte da planta ou variedade.

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Caracterização morfológica e identificação molecular de isolados de Fusarium graminearum associados à giberela do trigo e triticale no sul do Brasil

A giberela ou fusariose da espiga é uma das principais doenças do trigo e triticale no sul do Brasil. A espécie de fungo Fusarium graminearum é citada como agente causal da doença, muito embora, em outros países, outras espécies de Fusarium também estejam associadas à doença. No País, não existem relatos de levantamentos de espécies associadas à doença. O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Fusarium associados à giberela do trigo e triticale procedentes do sul do Brasil, com base na morfologia e no emprego da reação da polimerase em cadeia (PCR) baseada em oligonucletídeos específicos para espécies de Fusarium. A patogenicidade dos isolados em trigo foi avaliada em espigas de plantas cultivadas em casa de vegetação. Os 20 isolados monospóricos analisados, obtidos de espigas doentes e sementes, foram identificados como F. graminearum.

Diversidade de Phytophthora parasitica isolados de Citrus usando seqüências de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA

Realizou-se estudo para caracterização e verificação da diversidade genética de Phytophthora parasitica, agente causador da gomose dos citros. Quatorze isolados de Phytophthora parasitica, provenientes do Estado de São Paulo, foram seqüenciados a partir das regiões internas transcritas (ITS1 e ITS2) do gene 5.8S. Obtiveram-se seqüências de 812 pb a 860 pb que foram comparadas com seqüências de outras espécies de Phytophthora spp depositadas no NCBI. Foram feitos estudos filogenéticos, utilizando-se o método "neighbor-joining" com 1000 "bootstrap" e construído o dendrograma mais representativo. Obtiveram-se os resultados de 98,88% a 100% de similaridade genética entre os 14 isolados paulistas, e 99,5% a 98,8% entre estes e a seqüência de P. nicotianae (gi| 8927482) obtida do GenBank NCBI.

Crescimento in vitro de isolados de Armillaria sp. obtidos de Pinus elliottii var: elliottii sob várias temperaturas

A armilariose tem sido considerada a principal doença em Pinus no Brasil. Os sintomas e danos consistem no amarelecimento de acículas, declínio, podridão de raízes, exsudação de resina e morte. A temperatura é um dos fatores ambientais que influencia patógenos, doença de plantas ou ambos. Este trabalho avaliou o comportamento de três isolados de Armillaria sp. obtidos de P. elliottii var. elliottii, submetidos a uma faixa de temperatura de 16 a 26 ºC, utilizando a biomassa seca produzida em meio líquido como parâmetro de análise. Verificou-se que todos os isolados apresentaram máxima produção de biomassa a 22 ºC. Utilizando-se de regressão cúbica encontrou-se temperaturas de máximo crescimento entre 21,79 e 23,19 ºC. De acordo com os resultados, a melhor temperatura para crescimento dos isolados testados situou-se em 22 ºC.

Variabilidade biológica de isolados do Citrus leprosis virus (CiLV) oriundos de cultivares de laranjeira

A leprose, causada pelo Citrus leprosis virus (CiLV), é uma das principais doenças presentes em pomares cítricos fluminenses. O objetivo deste trabalho foi comparar o quadro sintomatológico desenvolvido por isolados de CiLV obtidos de cultivares comerciais de laranjeira (Lima, Pêra e Seleta), inoculados mecanicamente em Chenopodium amaranticolor, em três diluições. Após cinco a sete dias da inoculação foram observadas lesões necróticas, com pequeno halo clorótico quando observadas contra a luz. O maior número de lesões, nas três diluições, foi obtido do isolado de 'Seleta', seguido por 'Pêra' e 'Lima'. A melhor diluição utilizada para a observação das lesões foi de 1:10. Os resultados demonstram uma possível variabilidade biológica entre os isolados virais e/ou uma menor ou maior replicação viral, dependendo da cultivar, indicando um possível mecanismo de resistência da planta ao vírus.

Patogenicidade de isolados de Corynespora cassiicola a diferentes espécies de plantas

Corynespora cassiicola, relatado como um patógeno com ampla gama de espécies hospedeiras, tem causado danos em várias culturas de interesse comercial. Neste trabalho avaliou-se, em ambiente de casa-de-vegetação, a patogenicidade de 15 isolados de C. cassiicola originados de diferentes espécies hospedeiras, quando inoculados em 12 diferentes espécies vegetais. Os isolados de pepino foram os mais patogênicos. Além dos híbridos de pepino, estes infectaram outras seis espécies vegetais testadas. Já os isolados de trapoeraba e de alface foram os que apresentaram menor patogenicidade, pois além dos hospedeiros originais infectaram somente uma espécie hospedeira. A maioria dos isolados apresentou elevada inespecificidade. As espécies vegetais testadas reagiram de formas diferentes quando inoculadas com diferentes isolados. O mamoeiro apresentou maior suscetibilidade, sendo infectado por 12 dos 15 isolados. Contrariamente, a trapoeraba e o assa-peixe foram suscetíveis a três e dois isolados, respectivamente.

Caracterização molecular e patogênica de isolados de Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson, agente causal da escaldadura das folhas da cana-de-açúcar

A escaldadura das folhas, causada pela bactéria Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson, é uma das cinco doenças mais importantes da cana-de-açúcar e sua ocorrência reduz o rendimento e a longevidade da cultura. Variedades resistentes têm sido usadas para o controle, porém há evidências da ocorrência de variantes do patógeno. Em campos comerciais do Estado de São Paulo, tem sido observado que a mesma variedade de cana se apresenta como resistente em uma região e suscetível em outra, sugerindo a ocorrência de variantes na população do patógeno. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a presença de diversidade genética da bactéria em áreas comerciais. Um total de 50 isolados foram obtidos em cultura pura a partir de plantas sintomáticas coletadas em Piracicaba (SP), Jaú (SP), região de Ribeirão Preto (SP) e Iturama (MG). Os isolados foram confirmados como pertencentes à espécie X. albilineans por meio de características de colônias, serologia e PCR com 'primers' específicos. Para caracterização da diversidade genética, foi usado o método de Rep-PCR, a partir do DNA extraído de cada isolado. Oito isolados, provenientes dos diferentes grupos identificados por rep-PCR, foram usados em testes de patogenicidade, por meio de inoculação em duas variedades de cana. Os resultados confirmaram todos os isolados como pertencentes à espécie X. albilineans. Por meio de rep-PCR, foi demonstrada diversidade genética entre os isolados, os quais foram separados em três grupos: um grupo composto somente pelos isolados de Piracicaba; um segundo, contendo todos os isolados amostrados em Jaú e na região de Ribeirão Preto, e um isolado de Iturama; e, no terceiro, somente dois isolados coletados em Iturama. Os testes de patogenicidade revelaram diferenças na agressividade entre isolados, porém sem relação com sua região de origem. Este trabalho revelou a ocorrência de diversidade genética e de agressividade dentro da espécie X. albilineans, evidenciando uma possível relação entre ocorrência de variantes do patógeno e reação de variedades de cana cultivadas no estado de São Paulo.

Caracterização, compatibilidade e ocorrência de reprodução sexual entre isolados de Pyricularia grisea de diferentes hospedeiros

A brusone, causada por Pyricularia grisea (teleomorfa Magnaphorthe grisea), possui uma ampla gama de hospedeiros. No Brasil, arroz, trigo, triticale e cevada são as culturas que sofrem quedas significativas de produtividade devido ao ataque desse patógeno. Além desses cereais, outras gramíneas também têm apresentado sintomas dessa doença. Os objetivos dessa pesquisa foram: a) caracterizar sexualmente isolados de P. grisea desses hospedeiros baseado na determinação do "mating type", fertilidade, sexualidade, compatibilidade sexual, b) analisar o grau de compatibilidade sexual entre isolados de brusone de trigo e de outras gramíneas, c) estudar a ocorrência da reprodução sexual em isolados de trigo. Os resultados obtidos através de ensaios "in vitro" constataram: 1) compatibilidade sexual de P. grisea do trigo com Bromus catharticus, Phalaris canariensis e X. triticosecal; 2) desbalanço entre porcentagem de MAT1-1 e MAT1-2, com predominância de MAT1-1 na população de P. grisea do trigo; 3) existência de um campo de isolados de trigo com baixa habilidade de cruzamento; 4) baixa possibilidade de ocorrência de reprodução sexual de P. grisea em campos de trigo, mesmo com existência de ambos "mating type" num mesmo campo.

Caracterização morfofisiológica de isolados do gênero Cylindrocladium

Com o objetivo de caracterizar o "complexo" gênero anamórfico Cylindrocladium, dezoito isolados foram cultivados em meios de cultura distintos, mantidos sob diferentes temperaturas, além de ter conídios e vesículas terminais analisados morfologicamente para identificação correta das culturas. Inoculações em diferentes hospedeiros foram, também, realizadas para avaliação do comportamento patogênico dos isolados estudados. Com relação aos caracteres morfológicos, pôde-se observar que ocorrem alterações nas dimensões de conídios e na morfologia da vesícula terminal devido, provavelmente, à mudança do substrato de cultivo. Porém, a variabilidade natural nas características dessas estruturas é tão elevada que dificulta a identificação correta dos isolados. Em uma mesma cultura, por exemplo, foram observadas vesículas terminais de diferentes morfologias. Pôde-se constatar que existem diferenças patogênicas e fisiológicas entre os isolados, uma vez que houve a formação de grupos distintos quando tais características foram consideradas. Estas diferenças, provavelmente, sejam devidas à constituição genética distinta existente entre os isolados.

Caracterização fisiológica, patogênica e análise isoenzimática de isolados monospóricos e multispóricos de Colletotrichum gloeosporioides

Foram caracterizados isolados monospóricos, obtidos de seis isolados multispóricos de Colletotrichum gloeosporioides, de cajueiro e mangueira, quanto à morfologia das colônias, crescimento micelial em BDA, patogenicidade e análise isoenzimática. As colônias dos isolados multispóricos apresentaram diversidade quanto à cor e aspecto, mas não foram observadas variações expressivas na morfologia dos 60 isolados monospóricos, quando comparados aos respectivos multispóricos, e apenas em dois isolados foi possível observar características morfológicas diferentes. Os isolados estudados exibiram bom crescimento em BDA, aos seis dias de incubação. Alguns isolados monospóricos, obtidos de quatro multispóricos de cajueiro e mangueira, foram heterogêneos no crescimento micelial. A patogenicidade foi o parâmetro que melhor caracterizou a variação entre isolados monospóricos e multispóricos de C. gloeosporioides. Diferentes níveis de agressividade foram observados entre e dentro dos isolados monospóricos e multispóricos. Os padrões eletroforéticos de isoesterases demonstraram que não houve variação, quanto à análise isoenzimática, entre os isolados monospóricos e os multispóricos dos quais foram originados. Os resultados deste trabalho sugerem que a escolha do tipo de isolado de C. gloeosporioides para estudos em cajueiro e mangueira deve ser precedida da comparação entre isolados monospóricos e multispóricos com base no crescimento micelial e patogenicidade.

Reação de cultivares, efeito da quantidade de pontos e da época de inoculação e idade da espata no desenvolvimento da antracnose em antúrio

O antúrio é uma planta semi-herbácea de folhas verdes vistosas, formato cordiforme e inflorescências com espatas de diversas cores de acordo com a cultivar, onde tanto a folhagem quanto as inflorescências são de importância ornamental. A antracnose causada por Colletotrichum gloeosporioides é uma das principais doenças nessa cultura, estando presente em vários plantios comerciais brasileiros. Os sintomas manifestam-se sobre as folhas, na forma de lesões pardas predominantes nas bordas ou junto às nervuras. Nas espatas ocorrem pequenas manchas escuras, que evoluem para uma podridão encharcada, prejudicando a comercialização das hastes. Essa pesquisa objetivou verificar o efeito da idade da espata, da quantidade de pontos e época de inoculação no desenvolvimento dos sintomas da antracnose, bem como a reação de cultivares de antúrio quando inoculadas com diferentes isolados de C. gloeosporioides (Cg). A idade da espata influenciou o desenvolvimento da lesão para os dois isolados avaliados. Em espatas no estádio 1, sem a completa abertura, as lesões formadas foram significativamente maiores do que aquelas formadas em espatas nos estádios 4 e 5. As maiores lesões causadas pelos isolados do patógeno foram formadas com cinco pontos de ferimento nas duas cultivares de antúrio (cvs. Tropical e Cananéia). A época de inoculação não influenciou no tamanho da lesão, nas duas cultivares avaliadas. Os menores períodos de incubação (PI) para o isolado Cg 1 foram observados nas cultivares Astral, Tropical, Netuno e Farao, diferindo significativamente das demais cultivares. Nas cultivares Sonate, Astral, Tropical, Netuno e Farao foram observados os menores PI para o isolado Cg 2. A menor área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) resultante da inoculação com Cg 1 foi observada em Sonate, que diferiu das demais cultivares. As menores AACPD ocasionadas pelo isolado Cg 2 foram observadas em Laguna e Midori, que diferiram das cultivares Cananéia, Sonate, Astral, Tropical e Netuno.

Análise da diversidade genética de isolados de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum do algodoeiro

A mancha angular do algodoeiro, causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam), é uma doença de importância econômica e pode causar perdas apreciáveis no rendimento. A doença pode ser controlada por resistência varietal desde que haja conhecimento sobre a variabilidade das populações do patógeno. A variabilidade genética e a estabilidade patogênica entre os isolados deste patógeno não foram suficientemente estudadas, principalmente considerando a introdução de novas cultivares e a expansão da cultura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a variabilidade genética entre os 61 isolados de Xam, provenientes de diversas cultivares e regiões do Brasil, através de ensaios moleculares. Análises de ERIC e REP-PCR demonstraram dois grupos distintos de Xam associados a região geográfica de origem. Não foram observadas diferenças nos perfis dos isolados através de PCR-RFLP da região 16S-23S rDNA. A região espaçadora 16S-23S rDNA de três linhagens de Xam foi analisada através de clonagem e sequenciamento e seis diferenças nas seqüências foram encontradas. A técnica de RAPD revelou um maior nível de polimorfismo, distinguindo 6 grupos de Xam a 85% de similaridade. Os resultados indicam a existência de variabilidade muito restrita entre os isolados analisados.

Variabilidade genética entre isolados de Colletotrichum gossypii do algodoeiro

O algodoeiro é atacado por Colletotrichum gossypii (CG) e C. gossypii var. cephalosporioides (CGC). Ambos os patógenos são transmitidos pela semente e sua distinção morfológica é extremamente difícil e inconsistente. Tentativas foram feitas no presente trabalho para verificar a variabilidade genética entre CG e CGC através de RAPD-PCR, ERIC- e REP-PCR e PCR-RFLP da região ITS rDNA. Foram utilizados 53 isolados coletados de sementes e folhas de plantas de diferentes cultivares nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais, e Paraiba, entre 1999 e 2003. Baseado em testes de patogenicidade, vinte e um isolados foram classificados como CG e 32 como CGC. Os resultados obtidos por RAPD-PCR, utilizando-se oito primers, revelaram dois grupos distintos sendo que o primeiro foi formado por 94% dos isolados de sementes e o segundo por 95% dos isolados de folhas. Na análise de ERIC- e REP-PCR, resultados semelhantes a RAPD foram obtidos, sendo que o primeiro grupo foi formado por 93% dos isolados provenientes das sementes e o segundo por 78% dos isolados provenientes das folhas. Quando o produto de amplificação da região ITS rDNA foi digerido com oito enzimas de restrição, um perfil de bandas semelhante para todos os isolados foi obtido. Resultados de RAPD, ERIC- e REP-PCR demonstraram que existem diferenças genéticas entre os isolados provenientes das sementes e aqueles provenientes de parte aérea, e esses dois grupos foram claramente distintos. Estudos futuros devem ser realizados utilizando outras técnicas moleculares para a obtenção de marcadores capazes de distinguir entre isolados de CG e CGC.