Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Diversidade de Phytophthora parasitica isolados de Citrus usando seqüências de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA

Realizou-se estudo para caracterização e verificação da diversidade genética de Phytophthora parasitica, agente causador da gomose dos citros. Quatorze isolados de Phytophthora parasitica, provenientes do Estado de São Paulo, foram seqüenciados a partir das regiões internas transcritas (ITS1 e ITS2) do gene 5.8S. Obtiveram-se seqüências de 812 pb a 860 pb que foram comparadas com seqüências de outras espécies de Phytophthora spp depositadas no NCBI. Foram feitos estudos filogenéticos, utilizando-se o método "neighbor-joining" com 1000 "bootstrap" e construído o dendrograma mais representativo. Obtiveram-se os resultados de 98,88% a 100% de similaridade genética entre os 14 isolados paulistas, e 99,5% a 98,8% entre estes e a seqüência de P. nicotianae (gi| 8927482) obtida do GenBank NCBI.

Characterization of Citrus tristeza virus isolates from grapefruit (Citrus paradisi Macf.) accessions of Citrus Active Germplasm Bank

Citrus tristeza virus (CTV) isolates from 35 grapefruit accessions belonging to Citrus Active Germplasm Bank of the "Instituto Agronômico de Campinas" located at the "Centro APTA Citros Sylvio Moreira", Cordeirópolis, São Paulo state, Brazil, were characterized and evaluated through symptoms in the trees, biological indexing, immunological diagnosis with different monoclonal antibodies and SSCP analysis (single-strand conformation polymorphism) of the coat protein gene. Symptomatology indicated that, in general, the group of plants with smaller canopy volume and severe stem pitting differed significantly from the group that presented greater vegetative development and mild to moderate stem pitting. However, the isolates from most of the accessions induced mild reaction on Mexican lime. The serological evaluation through the DAS-ELISA using monoclonal antibodies did not reveal any association between virus titer in the plant tissue and symptoms. The reaction with different monoclonal antibodies and the distinct electrophoresis patterns obtained through SSCP showed that there is a high degree of diversity among the isolates that infect these grapefruit accessions. High complexity within the same isolate was also observed in the SSCP profiles. This finding indicates that the CTV isolates from these plants are a complex mixture of CTV haplotypes. Similar SSCP banding patterns were observed among some plants with strong stem pitting symptoms, and among some plants with weak or moderate stem pitting symptoms.

Identidade molecular dos fitoplasmas associados aos enfezamentos do tomateiro e da berinjela com base na análise do gene 16S rDNA

Doenças de hortaliças de ocorrência no território brasileiro e em outras áreas do mundo têm sido associadas a diversos fitoplasmas. Na região de Piracicaba-SP e Bragança Paulista-SP, em plantas de tomate e berinjela foram observados sintomas típicos de enfezamento caracterizados por porte reduzido, clorose foliar, superbrotamento de ramos, desenvolvimento anormal do cálice, encurtamento de entre-nós, redução no tamanho de folhas, flores e frutos. Através de duplo PCR, utilizando os iniciadores R16 mF1/mR2 e R16 F2n/R2, fragmentos de DNA de 1,2 kb foram amplificados de amostras sintomáticas, demonstrando a presença de fitoplasma nos tecidos das plantas. O uso de iniciadores específicos demonstrou que estes fitoplasmas eram afiliados ao grupo 16SrIII. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, HpaII, KpnI, MboI, MseI e RsaI confirmaram que os fitoplasmas detectados eram representantes do grupo 16SrIII. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados em Escherichia coli, sequenciados e comparados, por homologia de seqüência, entre si e com outros fitoplasmas do grupo 16SrIII. Um índice de similaridade de seqüência acima de 95% foi encontrado quando seqüências dos fitoplasmas detectados em tomate e berinjela foram comparadas com aquelas de outros representantes do grupo 16SrIII. Um índice de 98-99% foi obtido quando seqüências dos fitoplasmas encontrados em tomate e berinjela foram comparadas entre si. Estes resultados evidenciaram que o enfezamento do tomateiro e da berinjela podem estar associados a um mesmo fitoplasma, com base na análise de seqüências do gene do 16S rDNA.

Caracterização de um vírus baciliforme isolado de Solanum violaefolium transmitido pelos ácaros Brevipalpus phoenicis e Brevipalpus obovatus (Acari: Tenuipalpidae)

Solano-violeta (Solanum violaefolium) é uma planta ornamental rasteira usada para cobrir solos de áreas sombreadas. Um vírus que induz manchas anelares nas folhas desta planta, tentativamente designado Solanum violaefolium ringspot virus - SvRSV, transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae) foi encontrado em Piracicaba, SP. Trata-se de um vírus baciliforme que se assemelha a outros vírus do tipo citoplasmático transmitidos por Brevipalpus sp. Este trabalho teve como objetivo relatar propriedades biológicas e estabelecer uma caracterização molecular parcial do SvRSV. O vírus pode ser transmitido mecanicamente a várias outras espécies botânicas, causando lesões localizadas. Entre as espécies avaliadas, Datura stramonium mostrou-se a melhor hospedeira experimental. Observou-se também a manifestação de sintomas nestas plantas após infestação das mesmas por B. obovatus previamente alimentado em lesões de SvRSV, confirmando esta outra espécie de ácaro como vetor do vírus. Suas propriedades físicas in vitro foram: temperatura de inativação 40-45 ºC; ponto final de diluição 10-3-10-4; longevidade in vitro 12 dias. Em secções ultrafinas, as partículas do SvRSV mostraram-se levemente mais delgadas e mais longas que as de outros vírus do mesmo grupo. A partir do dsRNA do SvRSV foi construída uma biblioteca de cDNA e foram identificadas duas possíveis regiões codificadoras das proteínas de movimento e replicase viral. Baseado nestas regiões foram desenhados "primers" para amplificação do RNA do SvRSV por RT-PCR. Sondas baseadas nas seqüências obtidas hibridizaram com ss- e dsRNA de D. stramonium infectadas pelo vírus. Ensaios preliminares de RT-PCR e hibridização não resultaram em reação com o vírus da leprose dos citros, tipo citoplasmático (CiLV-C).

Variabilidade biológica de isolados do Citrus leprosis virus (CiLV) oriundos de cultivares de laranjeira

A leprose, causada pelo Citrus leprosis virus (CiLV), é uma das principais doenças presentes em pomares cítricos fluminenses. O objetivo deste trabalho foi comparar o quadro sintomatológico desenvolvido por isolados de CiLV obtidos de cultivares comerciais de laranjeira (Lima, Pêra e Seleta), inoculados mecanicamente em Chenopodium amaranticolor, em três diluições. Após cinco a sete dias da inoculação foram observadas lesões necróticas, com pequeno halo clorótico quando observadas contra a luz. O maior número de lesões, nas três diluições, foi obtido do isolado de 'Seleta', seguido por 'Pêra' e 'Lima'. A melhor diluição utilizada para a observação das lesões foi de 1:10. Os resultados demonstram uma possível variabilidade biológica entre os isolados virais e/ou uma menor ou maior replicação viral, dependendo da cultivar, indicando um possível mecanismo de resistência da planta ao vírus.

Mapas de zonas de risco de epidemias e zoneamento agroclimático para o Cancro Cítrico no Estado de São Paulo

O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri Valterin et alii 1995, é uma doença conhecida mundialmente e sempre constituiu séria ameaça para a citricultura brasileira. O objetivo do presente trabalho foi analisar as condições climáticas do Estado de São Paulo e desenvolver mapas de zonas de maior risco de epidemias de cancro cítrico. Foram utilizados dados meteorológicos referentes aos anos de 2002 a 2005, os quais foram baseados no modelo de previsão desenvolvido por Campbell & Madden (4) e Hau & Kranz (10). A freqüência dos dados foi horária e quando alguma estação apresentava falha, esses eram extrapolados da estação mais próxima. Foram contabilizados os índices de favorabilidade e posteriormente calculadas as porcentagens de dias favoráveis à ocorrência da doença no período de um ano. A partir destas informações, foram gerados os mapas temáticos do Estado de São Paulo, com a distribuição espacial da porcentagem de dias favoráveis à ocorrência de cancro cítrico. A região Noroeste do Estado foi a que apresentou a maior porcentagem de dias favoráveis à ocorrência de cancro cítrico.

Patogenicidade cruzada de Ceratobasidium spp. do caquizeiro (Diospyros kaki) e do chá(Camellia sinensis) e reação de cultivares de caqui ao patógeno

O fungo Ceratobasidium spp. é o agente causal da doença mal-do-fio ou queima-do-fio em várias plantas frutíferas, em cafeeiro e em chá. Esta doença ocorre com maior freqüência em zonas de alta precipitação e temperaturas elevadas, típicas de regiões de florestas tropicais como a Amazônica e a Mata Atlântica. Em São Paulo, o primeiro relato do mal-do-fio em caquizeiro ocorreu na região de Mogi das Cruzes. O objetivo deste estudo foi testar a patogenicidade cruzada de isolados de Ceratobasidium spp. de caquizeiro e chá para ambas as culturas e também para o cafeeiro e citros. Avaliou-se, também, a reação de oito cultivares de caquizeiro, sob condições controladas, a isolados de Ceratobasidium spp. obtidos da mesma cultura. Constatou-se que os isolados de caquizeiro e de chá, embora filogeneticamente distintos, foram patogênicos para ambas as culturas, além de afetarem cafeeiro e citros. Não foram verificados indícios de reação de resistência aos isolados de Ceratobasidium spp. para as oito cultivares de caquizeiro testadas.

Anatomia de lesões foliares causadas pelo vírus da Mancha Clorótica do Clerodendrum, transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis em diferentes espécies

O gênero botânico Clerodendrum pertence à família Lamiaceae e compreende várias espécies ornamentais, Manchas cloróticas e necróticas em folhas de coração-sangrento foram observadas pela primeira vez em um jardim de Piracicaba, SP, associadas à infestação com Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). Exames de secções de tecidos das lesões foliares ao microscópio eletrônico revelaram ocorrência de efeitos citopáticos do tipo nuclear e concluiu-se que os sintomas eram causados por um vírus transmitido por Brevipalpus (VTB), o qual foi designado de mancha clorótica de Clerodendrum (Clerodendrum Chlorotic Spot Virus- ClCSV). O ClCSV é transmitido mecanicamente de coração-sangrento para coração-sangrento. Em ensaios preliminares foi transmitido por B. phoenicis e mecanicamente para várias outras plantas, além da ocorrência de sua disseminação natural por este ácaro para outras espécies. Visando complementar a caracterização do ClCSV foram feitos estudos sobre alterações anatômicas em folhas de plantas infectadas pelo ClCSV. Foram examinadas secções histológicas de folhas sadias e infectadas pelo ClCSV de C. x speciosum e de outras hospedeiras como Hibiscus schizopetalus, Salvia leucantha, Malvaviscus arboreus e Annona muricata. Constatou-se que o ClCSV causa alterações celulares semelhantes nas diferentes hospedeiras e os sintomas causados por este vírus são similares aos causados por outros vírus transmitidos por Brevipalpus como o vírus da leprose dos citros citoplasmático (Citrus Lepros Virus Cytoplasmic- CiLV-C) e nuclear (Citrus Leprosis Virus Nuclear- CiLV-N), mancha anular do cafeeiro (Coffee Ringspot Virus- CoRSV), mancha anular de Solanum violaefolium (Solanum violaefolium Ringspot Virus- SvRSV) e "Orchid Fleck Vírus" (OFV), representadas por hipertrofia e hiperplasia frequentemente acompanhadas de necrose nos tecidos do parênquima paliçádico e lacunoso.

Interferência da redução no volume de aplicação sobre o controle da mancha preta (Guignardia citricarpa Kiely) em frutos de laranja 'Valência'

O controle químico do agente causal da mancha-preta-dos-citros (MPC) tem merecido destaque pelo excessivo número de pulverizações, elevando sobremaneira os custos de produção na citricultura. A busca por melhorias na eficiência das pulverizações e reduções na quantidade dos produtos fitossanitários já tem sido realizada, mas os resultados dessa prática ainda não são consistentes para que possa ser aplicado em escala comercial. Sendo assim, essa pesquisa objetivou avaliar a interferência da redução no volume de aplicação, sobre o controle químico da mancha preta em frutos cítricos. O experimento foi conduzido em pomar comercial com plantas de 16 anos de idade, da variedade Valência durante o ano agrícola 2007. Os tratamentos consistiram de três volumes de calda, 3,5; 4,5 e 8,5 L planta-1, aplicados por pulverizador de jato transportado Arbus 2000/Export, com ramal especial de bicos, utilizando-se fungicidas e períodos recomendados para o controle da doença em um total de quatro pulverizações e mais um tratamento testemunha (sem pulverização). As avaliações de incidência e severidade da doença ocorreram através de escala visual diagramática de notas em duas épocas (pré-colheita e colheita), em três alturas (baixo, médio e alto) da planta e mais três setores horizontais (entrada, frontal e saída) em dois lados da planta. Os frutos caídos foram contados quinzenalmente, em plantas previamente selecionadas, do início da maturação até a colheita com a quantificação da produção (kg planta-1). A incidência e severidade da doença foram menores quando as pulverizações foram realizadas com 8,5 L planta-1 na primeira época de avaliação (pré-colheita), porém na colheita, não houve diferenças entre os mesmos parâmetros, quando pulverizados 4,5 ou 8,5 L planta-1. Nenhum tratamento reduziu a doença no setor alto da planta, em comparação a testemunha. Os setores da planta com os frutos mais expostos aos raios solares, lado direito e alto da planta, apresentaram maior incidência e severidade da doença. A redução no volume de 8,5 para 4,5 L planta-1 pode ser praticada na citricultura sem prejuízo do nível de controle da MPC.

Avaliação da resistência de variedades de Citrus spp. à Xanthomonas citri subsp. citri na região Noroeste Paranaense, em condições de campo

A identificação de cultivares com determinados níveis de resistência ao cancro cítrico, com características agronômicas e comerciais desejáveis, assume grande importância para o manejo desta doença. A avaliação de genótipos promissores pode ser fetuada em condições controladas ou em campo. O trabalho teve como objetivo avaliar genótipos de laranja doce (Citrus sinensis), tangerinas (Citrus reticulata) e híbridos quanto à resistência ao cancro cítrico, em diferentes épocas de avaliação. O experimento foi conduzido em pomar experimental no município de Maringá, Paraná. Para a determinação da severidade média da doença, foram utilizadas escalas diagramáticas, sendo avaliadas quatro plantas por bloco e amostrados ramos na porção mediana de cada planta. Além disso, foi calculada a Área Abaixo da Curva de Progresso da Severidade (AACPS). De acordo com os dados obtidos, ocorreram diferenças significativas na severidade e na AACPS, ao longo das avaliações, sendo que a severidade variou de 0,25% a 4,88% e a AACPS de 49,80 a 742,65. As variedades cítricas Tang. Ponkan, Rosehaugh Nartjee, Harris, De wildt, Dekopon, Lee, África do Sul, Tarocco#23, Solid Scarlet, Satsuma Okitsu SPA 29, Cristalina, Shamouti e Pêra Olimpia se destacaram e apresentaram as menores médias de severidade, sendo essas classificadas como resistentes. Os resultados sugerem que esses genótipos podem ser importantes ferramentas nos programas de melhoramento de genótipos de citros, visando resistência a Xanthomonas citri subsp. citri.

Correlação entre o número de fêmeas e o número de juvenis de Tylenchulus semipenetrans em amostras de solo e raiz de laranjeira 'Pera Rio' enxertada em limoeiro 'Cravo'

Várias espécies de fitonematoides já foram relatadas em pomares de citros, porém poucas são consideradas praga-chave para a cultura. No Brasil, Tylenchulus semipenetrans é o principal nematoide em citros, amplamente disseminado nos pomares brasileiros. Diferentes variáveis são utilizadas para determinar o nível de dano desse nematoide. Sendo assim, esse experimento teve por objetivo correlacionar o número de fêmeas com o número de juvenis de T. semipenetrans em amostras de solo e raiz de laranja 'Pera Rio' enxertada em limoeiro 'Cravo'. O trabalho foi realizado em pomar de 14 anos, localizado na Fazenda São Gabriel, distrito de Vitoriana, município de Botucatu - SP. A coleta das amostras foi realizada em setembro de 2011, numa profundidade de 0-30 cm, em 10 plantas sem sintomas, 10 com sintomas e as adjacentes das plantas sintomáticas, totalizando 60 plantas. Para extração dos nematoides presentes no solo seguiu-se a metodologia de flutuação em centrífuga e para a dos nematoides nas raízes seguiu-se a técnica do liquidificador e centrifugação. Para contagem das fêmeas, 1 g de raiz de cada amostra foi colorida. Os dados de nematoide no solo, nematoide na raiz, soma de nematoide no solo e raiz e fêmeas por grama de raiz foram submetidos à análise de correlação de Pearson e posteriormente à análise de matriz de correlações. Dentre os dados analisados, pode-se verificar uma forte correlação entre o número de juvenis presentes na raiz e a soma do número de juvenis no solo e na raiz. Entretanto, não foi constatado correlação desta variável com o número de fêmeas na raiz e o número de juvenis no solo. O número de fêmeas na raiz não apresentou correlação com nenhuma das outras variáveis analisadas. Conclui-se que a melhor variável para determinar a população de T. semipenetrans é o número de juvenis por 10 g de raiz.

Fitotoxidez de cádmio para Eucalyptus maculata e E. urophylla em solução nutritiva

Estudaram-se os efeitos de doses crescentes de Cd em solução nutritiva no crescimento e absorção mineral de mudas de Eucalyptus maculata e E. urophylla e respectivos sintomas de fitotoxidez em casa de vegetação. Mudas foram mantidas por cinco semanas em vasos contendo 2 L de solução nutritiva de Clark, adicionando-se 0, 45, 90, 135 e 180 miM de Cd fornecido como CdSO4. Após uma semana de exposição aos tratamentos, E. maculata exibiu pontuações avermelhadas nas nervuras, clorose internerval, necrose, murchamento das folhas e escurecimento das raízes. Além desses sintomas, E. urophylla apresentou morte das gemas apicais e acentuada queda de folhas. A dose crítica de Cd para reduzir em 10% a matéria seca da parte aérea foi baixa; 2,4 miM e 1,5 miM de Cd para E. maculata e E. urophylla, respectivamente. Os níveis críticos de toxidez na parte aérea foram de 14,5 mg kg-1 em E. maculata e 10,8 mg kg-1 de Cd em E. urophylla. Esses resultados indicaram que E. maculata é provavelmente menos sensível ao Cd do que E. urophylla. Foi também observado que o Cd reduziu a translocação de Cu em até 24 e 43% em E. maculata e E. urophylla, respectivamente. A translocação de Fe caiu de 36% em média, nas duas espécies no controle para apenas 12% com 180 miM Cd. A elevação nas doses de Cd reduziu os teores de Ca e Mg na parte aérea das espécies, atingindo-se teores de Mg abaixo da faixa considerada adequada em E. urophylla. Ficaram evidenciadas a fitotoxidez de Cd no Eucalyptus e a relação desta com a diminuição da translocação de Cu e Fe e com a diminuição dos teores foliares de Mg.

Multiplicação de gemas axilares de Acacia mearnsii de wild. Sob diferentes meios de cultura

A propagação de indivíduos superiores de acácia-negra (Acacia mearnsii De Wild.) visando ao estabelecimento de florestas mais produtivas, homogêneas, resistentes a pragas e doenças é uma necessidade nos dias atuais. Este estudo objetivou determinar o melhor meio de cultura, a concentração dos seus principais sais e a utilização de carvão ativado para multiplicação in vitro de gemas axilares de A. mearnsii. Plântulas germinadas in vitro forneceram explantes que foram inoculados em diferentes meios de cultura B5, MS, SP e WPM. Foram testadas diversas concentrações do meio MS: ¼, ½, ¾ e 1/1 (concentração original), 5/4, 3/ 2, 7/4 e 2/1, com e sem carvão ativado. Utilizou-se o delineamento de blocos casualizados com cinco, sete e quatro repetições, respectivamente, com quatro explantes por parcela. As avaliações foram feitas em intervalos de 30 dias, através da contagem do número de folhas e gemas e da presença de calos e clorose. Entre os meios utilizados em sua composição original, o MS promoveu a maior multiplicação de gemas (3,7 gemas/explante) aos 30 dias. Entre as concentrações de macronutrientes do meio MS, a diluição para 3/4 da concentração original com a adição de carvão ativado apresentou as melhores respostas para a multiplicação de gemas axilares de acácia-negra (7,7 gemas/explante) aos 60 dias.

Respostas morfofisiológicas de plantas de açacu (Hura crepitans L.) provenientes de várzeas do rio Amazonas: efeito da anoxia do solo

Neste trabalho foram avaliadas as respostas morfofisiológicas de plantas de açacu (Hura crepitans) sob a anoxia do solo com diferentes idades (90 e 120 dias) e períodos de inundação (0, 10, 20 e 30 dias). O estudo identificou que as plantas desenvolveram mecanismos adaptativos (estruturas morfológicas como lenticelas hipertróficas e raízes adventícias) e apresentaram comportamento fisiológico que lhes propiciaram tolerância à anoxia. As respostas das plantas ao excesso de água no solo incluíram inibição do crescimento vegetativo, clorose e senescência foliar. O estresse hídrico por anoxia comprometeu a viabilidade das plantas de 90 dias de idade, enquanto as plantas de açacu de 120 dias de idade mostraram-se tolerantes ao alagamento.