Identificação sorológica do vírus do mosaico das nervuras da videira no Brasil

Em São Paulo, ocorrem quatro isolados do vírus que induz o mosaico das nervuras da videira (Vitis spp.), os quais são diferenciados pelos sintomas que provocam em algumas variedades. Para confirmar a identidade desse vírus e o relacionamento existente entre os quatro isolados, foram aplicados os testes DAS-ELISA e TAS-ELISA usando anti-soros comerciais contra o Grapevine fleckvirus (GFkV). As fontes de antígeno foram tecidos de floema de ramos dormentes e de folhas jovens da brotação de primavera de videiras sabidamente infetadas. As reações nos testes imuno-enzimáticos envolvendo os quatro isolados do vírus foram positivas para o anti-soro contra o GFkV. Os resultados foram também positivos para amostras de 66 plantas infetadas de 26 variedades de videira procedentes de 11 regiões vitícolas de São Paulo e de 24 plantas de 12 variedades provenientes dos estados de Minas Gerais, Paraná, Pernambuco, Rio Grande do Norte e Santa Catarina. Extratos de folhas novas e tenras apresentaram valores de absorbância mais consistentes do que extratos de ramos dormentes. Plantas não infetadas foram empregadas como controle negativo. Os resultados obtidos confirmaram que os quatro isolados virais possuem relacionamento sorológico com o GFkV, sugerindo que os mesmos pertencem ao complexo viral que causa o "grapevine fleck disease".

Seqüenciamento e variabilidade do fragmento genômico de Xylella fastidiosa amplificado pelos iniciadores RST31/33

Xylella fastidiosa é agente causal de diversas doenças de importância econômica como a clorose variegada dos citros (Citrus spp.) (CVC), mal de Pierce da videira (Vitis vinifera), escaldadura da ameixeira (Prunus salicina) e requeima do cafeeiro (Coffea arabica). A seqüência nucleotídica do fragmento genômico, específico de X. fastidiosa, amplificado pelo par de iniciadores RST31/33 foi determinada para 38 isolados de citros e para isolados de videira, cafeeiro e ameixeira objetivando avaliar o nível de polimorfismo entre isolados e a identidade genômica do fragmento. Não foi observado polimorfismo de seqüência nucleotídica entre isolados de citros, mas foi detectado polimorfismo entre isolados de citros e de videira, cafeeiro e ameixeira. A presença do sítio de clivagem RsaI, que distingue isolados de citros e videira de isolados de ameixeira e outras espécies arbóreas, foi identificada em um isolado de ameixeira proveniente dos EUA mas não em outro proveniente do Brasil.

Detecção de um isolado de Grapevine virus A e caracterização do gene da proteína capsidial

O Grapevine virus A (GVA) está associado à "Acanaladura do lenho de Kober", uma doença do complexo rugoso da videira (Vitis spp.). Neste trabalho, um isolado brasileiro de GVA (GVA-RS) foi caracterizado biologicamente por transmissão mecânica para cinco hospedeiras herbáceas e por enxertia na videira indicadora cv. Kober 5BB, e também por sorologia. O RNA total foi extraído de videira infetada cv. Pirovano 65. Para a RT-PCR, dois pares de oligonucleotídeos foram utilizados. Dois fragmentos de DNA, 430 e 451 pb, apresentando sobreposição parcial de nucleotídeos, foram amplificados por PCR. A seqüência do gene da proteína capsidial do GVA-RS com 597 nucleotídeos e 198 aminoácidos deduzidos, com massa molecular calculada de 21,6 kDa, foi alinhada a outros isolados virais. As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos do GVA-RS apresentaram maior identidade, 91,4% e 95,4%, respectivamente, com um isolado italiano. O GVA-RS apresentou expressiva divergência dos Vitivirus Heracleum latent virus (HLV), Grapevine virus B (GVB) e Grapevine virus D (GVD), com identidade de nucleotídeos variando de 76% a 83,1%.

Caracterização do gene da proteína capsidial de dois isolados, patologicamente distintos e sorologicamente semelhantes, do Grapevine virus B em videiras no Estado de São Paulo

No presente trabalho, descreve-se a caracterização do gene codificador da proteína capsidial de dois isolados sintomatologicamente distintos do Grapevine virus B (GVB). Para isto, RNA totais foram extraídos de folhas e pecíolos de videiras (Vitis spp.) infetadas, cultivares Rubi (GVB-C SP) e Itália (GVB-I SP) e utilizados para amplificar, por RT/PCR, um fragmento entre as posições 6425 e 7118 (694 nucleotídeos, nt) do RNA do GVB ("GenBank", acesso X75448). O fragmento obtido inclui o gene da proteína capsidial (594 nt) codificando 197 aminoácidos com massa molecular estimada em aproximadamente 21.600 Da. A seqüência do GVB-C SP apresentou maior similaridade de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos com o isolado italiano (acesso X75448), enquanto que o GVB-I SP foi mais similar a um outro isolado brasileiro do GVB descrito no Rio Grande do Sul (GVB BR1, acesso AF438410). Os dois isolados paulistas do GVB podem ser diferenciados por digestão com a enzima de restrição EcoRI, uma vez que há um sítio interno no GVB-C SP que está ausente no isolado GVB-I SP.

Caracterização do gene da proteína capsidial do Grapevine virus A em videiras afetadas pela acanaladura do lenho de Kober no Estado de São Paulo

O presente trabalho caracteriza o gene codificador da proteína capsidial do isolado do Grapevine virus A (GVA) encontrado no Estado de São Paulo (GVA-SP). RNA total foi extraído de folhas e pecíolos de plantas de videira (Vitis spp.) da variedade 'Kober 5BB' e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar um fragmento entre as posições 6409 e 7175 do RNA do GVA ("GenBank", acesso X75433). Foi obtido um fragmento de tamanho esperado (767 nt) que inclui o gene da proteína capsidial, codificando 198 aminoácidos. A seqüência do GVA-SP apresentou similaridade de nucleotídeos e aminoácidos de, respectivamente, 86-92,3% e 94,5-98% com isolados do GVA da Europa, África e Japão (Acessos X75433, AF441234, AF007415, AB039841) e da região Sul do Brasil (Acesso AF494187), sendo, entretanto, mais similar aos isolados africano e italiano.

Detecção e caracterização biológica e molecular de Rupestris stem-pitting associated virus e seu efeito na fotossíntese de videiras

Rupestris stem pitting associated virus (RSPaV) é o agente causal das "caneluras do tronco de Rupestris" da videira (Vitis spp.). Neste trabalho, um isolado de RSPaV, encontrado em videiras cv. Cabernet Franc no Rio Grande do Sul, foi estudado. O vírus foi detectado biologicamente, por enxertia em videira indicadora cv. Rupestris du Lot, em 26,2% das amostras avaliadas. A seqüência parcial do gene da replicase do RSPaV, isolado sul-brasileiro, com 831 nucleotídeos amplificados por RT-PCR e 276 aminoácidos deduzidos, apresentou maior identidade de nucleotídeos (98,1%) e aminoácidos deduzidos (99,6%), com dois isolados norte-americanos. O RSPaV estudado apresentou baixa homologia (37-41%) com outros vírus do gênero Foveavirus. A maioria das mudas de videira cv. C. Franc infetadas com RSPaV apresentou diminuição no potencial fotossintético (2,68 a 5,12 vezes) e aumento na taxa respiratória no escuro quando comparadas a mudas sadias, salientando os impactos que esse vírus pode proporcionar no potencial produtivo de videiras.

Fungos associados com o declínio e morte de videiras no estado do Rio Grande do Sul

Diversas são as causas bióticas e abióticas responsáveis pelo declínio e morte de videiras (Vitis spp.) no Rio Grande do Sul. Dentro do primeiro grupo temos vários fungos fitopatogênicos. O objetivo do trabalho foi levantar as principais espécies de fungos presentes em videiras com os sintomas desta moléstia em vinhedos da Serra Gaúcha. A partir de 107 amostras coletadas em diferentes cultivares e municípios, observou-se uma maior incidência de declínio nas cultivares de uvas americanas, Vitis labrusca (Bordô, Concord e Niágara), do que nas cultivares de uvas européias, V. vinifera. As principais espécies de fungos encontradas foram: Cylindrocarpon sp., Phaeoacremonium sp., Verticillium sp., Botryosphaeria sp., Fusarium oxysporum f.sp. herbemontis, Graphium sp. e Cylindrocladium sp.

Grape rust caused by Phakopsora euvitis, a new disease for Brazil

A ferrugem da videira foi constatada pela primeira vez no Brasil, ocorrendo em parreirais (Vitis spp.)comerciais no estado do Paraná tendo recentemente atingido também o Estado de São Paulo. O fungo Phakopsora euvitis foi identificado como o agente causal da doença. Esta ferrugem ocorre preferencialmente em folhas maduras causando a desfolha precoce das plantas infetadas.

Cylindrocarpon destructans causador do "pé-preto" da videira no Rio Grande do Sul

Desde 1999 tem sido observada a morte de videiras (Vitis labrusca) americanas no Rio Grande do Sul. A doença é caracterizada pelo apodrecimento do colo da planta e do sistema radicular, seguindo-se o murchamento da parte áerea e, conseqüentemente, a morte da planta. Com base no isolamento, na comprovação da patogenicidade e nas características morfológicas, identificou-se o agente causal como sendo Cylindrocarpon destructans. Este é o primeiro relato no Brasil do "pé-preto" da videira.

Molecular characterization of Brazilian strains of Xanthomonas campestris pv. viticola by rep-PCR fingerprinting

Bacterial canker of grapevine (Vitis vinifera), caused by Xanthomonas campestris pv. viticola was first detected in Brazil in 1998, affecting grapevines in the São Francisco river basin, state of Pernambuco. The disease was also reported in Juazeiro, Bahia and later in Piauí and Ceará. Due to its limited geographical distribution and relatively recent detection in Brazil, very little is known about the pathogen's biology and diversity. Repetitive DNA based-PCR (rep-PCR) profiles were generated from purified bacterial DNA of 40 field strains of X. campestris pv. viticola, collected between 1998 and 2001 in the states of Pernambuco, Bahia and Piauí. Combined analysis of the PCR patterns obtained with primers REP, ERIC and BOX, showed a high degree of similarity among Brazilian strains and the Indian type strain NCPPB 2475. Similar genomic patterns with several diagnostic bands, present in all strains, could be detected. Fingerprints were distinct from those of strains representing other pathovars and from a yellow non-pathogenic isolate from grape leaves. The polymorphism observed among the Brazilian strains allowed their separation into five subgroups, although with no correlation with cultivar of origin, geographic location or year collected.

Development of a scar marker for Pierce's Disease strains of Xylella fastidiosa

The objective of this research was to develop a primer for a polymerase chain reaction specific for Xylella fastidiosa strains that cause Pierce's Disease (PD) in grapes (Vitis vinifera). The DNA amplification of 23 different strains of X. fastidiosa, using a set of primers REP1-R (5'-IIIICGICGIATCCIGGC-3') and REP 2 (5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3') using the following program: 94 ºC/2 min; 35 X (94 ºC/1 min, 45 ºC/1 min and 72 ºC/1 min and 30 s) 72 ºC/5 min, produced a fragment of 630 bp that differentiated the strains that cause disease in grapes from the other strains. However, REP banding patterns could not be considered reliable for detection because the REP1-R and REP 2 primers correspond to repetitive sequences, which are found throughout the bacterial genome. The amplified product of 630 bp was eluted from the agarose gel, purified and sequenced. The nucleotide sequence information was used to identify and synthesize an specific oligonucleotide for X. fastidiosa strains that cause Pierce's Disease denominated Xf-1 (5'-CGGGGGTGTAGGAGGGGTTGT-3') which was used jointly with the REP-2 primer at the following conditions: 94 ºC/2 min; 35 X (94 ºC/1 min, 62 ºC/1 min; 72 ºC/1 min and 30 s) 72 ºC/10 min. The DNAs isolated from strains of X. fastidiosa from other hosts [almond (Prumus amygdalus), citrus (Citrus spp.), coffee (Coffea arabica), elm (Ulmus americana), mulberry (Morus rubra), oak (Quercus rubra), periwinkle wilt (Catharantus roseus), plums (Prunus salicina) and ragweed (Ambrosia artemisiifolia)] and also from other Gram negative and positive bacteria were submitted to amplification with a pair of primers Xf-1/REP 2 to verify its specificity. A fragment, about 350 bp, was amplified only when the DNA from strains of X. fastidiosa isolated from grapes was employed.

Variability of the 3' terminal of the polymerase gene of Grapevine leafroll-associated virus 3 isolates from Vale do São Francisco, Brazil

Many viral diseases, including leafroll, which is of great economic importance, affect grapevines (Vitis spp.). A complex of eight viruses [Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV) -1 to 8] is associated with this disease. The objective of this study was to compare the variability of the 3' terminal region of the polymerase gene of three isolates of GLRaV-3 (Grapevine leafroll-associated virus-3), from Submédio do Vale do Rio São Francisco (Petrolina-PE) with that of other isolates available at the GenBank, including an isolate from North America and another from Southern Brazil. The viral RNA was extracted from three infected ELISA reactive plants and a fragment of 340 bp was amplified, by RT-PCR, using primers that recognize that portion of the polymerase gene found between nucleotides 8267 and 8606. The three isolates from Vale do Rio São Francisco named Pet-1, Pet-2 and Pet-3, showed similarities ranging from 98% and 94%, respectively to the isolates from North America (AF037268) and Southern Brazilian (AF438411). Considering the whole genome, the main variation found was one amino acid change at position 2766 (F2766Y). These preliminary data indicate the existence of a natural variation among GLRaV-3 isolates from grapevines. This could be due to the vegetative propagation and long cycle of the plant, associated with the error-prone nature of RNA-dependent RNA polymerase.

Avaliação da variabilidade do Grapevine leafroll-associated virus 1 e 3 por análise de seqüências de nucleotídeos e polimorfismo conformacional de fita simples

As principais espécies de vírus envolvidas na etiologia do enrolamento da folha da videira (Vitis spp.) são Grapevine leafroll-associated virus 1 e 3 (GLRaV-1 e -3). Neste estudo da variabilidade desses vírus, foram amplificados dois fragmentos de DNA (396 bp do GLRaV-1 e 602 bp do GLRaV-3) por RT-PCR, a partir de RNA total extraído de nervuras e pecíolos de videiras infetadas, utilizando-se dois pares de oligonucleotídeos. Os DNAs amplificados foram clonados e reamplificados, a partir dos clones recombinantes, e comparados quanto às diferenças conformacionais das fitas simples desnaturadas (SSCP). Foram observados dois padrões distintos de perfis eletroforéticos para cada vírus, tendo sido seqüenciado pelo menos um clone viral correspondente a cada padrão. As duas seqüências de nucleotídeos obtidas para o GLRaV-1 apresentaram maior homologia (79,8% e 87,4%) com um isolado australiano e as duas seqüências relativas ao GLRaV-3 exibiram maior homologia (75,1% e 81,8%) com um isolado norte-americano. Os resultados demonstraram a ocorrência de seqüências variantes destes vírus nas videiras analisadas.

Detecção do Grapevine virus A e Grapevine virus B por hibridização "dot-blot" com sondas moleculares não radioativas

O vírus A da videira (Grapevine virus A, GVA) e o vírus B da videira (Grapevirus virus B, GVB) estão associados à acanaladura do lenho de Kober ("Kober stem grooving") e ao fendilhamento cortical da videira ("grapevine corky bark"), respectivamente. Este trabalho descreve o uso de sondas moleculares de cDNA na detecção de isolados do GVA (GVA-SP) e do GVB (GVB-C-SP e GVB-I-SP) em videiras (Vitis spp.) e fumo (Nicotiana occidentalis). As sondas marcadas com digoxigenina foram produzidas por RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos para os genes da proteína capsidial. Os RNA totais foram extraídos de 45 plantas de diversas variedades de videira e de 13 plantas de fumo inoculadas mecanicamente com o GVB. Os RNA extraídos das plantas infetadas, indexadas biologicamente, hibridizaram com as sondas, não se verificando reação com plantas sadias. Para confirmar os resultados de hibridização, foram também feitos testes de RT-PCR. A utilização de hibridização "dot-blot" com sondas de cDNA mostrou-se eficaz na detecção dos vírus com especificidade e sensibilidade, ressaltando-se que, preferencialmente, folhas maduras e ramos dormentes devem ser utilizados nos testes diagnósticos para o GVB e GVA, respectivamente.

Métodos de preservação e crescimento de Xanthomonas campestris pv. viticola em meio de cultura variando temperatura, pH e concentração de NaCl

A bactéria fitopatogênica Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) causa o cancro bacteriano da videira (Vitis vinifera), que ocasiona grandes prejuízos à viticultura no Brasil. Os métodos de dessecação em papel de filtro (DPF), repicagens periódicas (RP), água destilada esterilizada (ADE) e folhas herborizadas (FH) foram utilizados para preservar duas estirpes de Xcv durante 12 meses. As variáveis viabilidade e patogenicidade foram avaliadas mensalmente e estimadas pela obtenção de crescimento bacteriano e área abaixo da curva de incidência da doença (AACID). Tanto o método de DPF como o de ADE propiciaram viabilidade constante de 100% durante 11 meses e os maiores valores de AACID. No método de RP não houve crescimento das estirpes já aos 30 dias, enquanto que, em FH, Xcv foi isolada até cinco meses. o crescimento das estirpes de Xcv em meio de cultura líquido variando temperatura (0, 5, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40 e 45 °C), pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 e 9,0) e concentração de NaCl (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7%) foi avaliado em fotocolorímetro. O crescimento de Xcv foi observado no intervalo de 5 até 35 °C, enquanto que o crescimento ótimo ocorreu de 27 a 29 °C. A Xcv não cresceu a zero e 40 °C. O pH ótimo para o crescimento desta bactéria foi 7,5. O crescimento de Xcv decresceu a partir de 3,0% de NaCl, com concentração letal de 6,0%.