Identificação do potencial amilolítico de linhagens mutantes do fungo filamentoso Aspergillus nidulans

As amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais, apresentando grande importância biotecnológica, principalmente na indústria alimentícia. Com o avanço no conhecimento das enzimas, a utilização dos fungos como fonte de enzimas vem adquirindo um status de destaque nas mais variadas áreas industriais e comerciais. Diante disso, o presente estudo procurou identificar a presença de atividade amilolítica em quatro linhagens do fungo filamentoso Aspergillus nidulans, selvagem, PAT, biA1methG1 e CLB3, utilizando dois meios distintos de cultura, BDA e Meio Completo a 2% amido, variando os tratamentos com adição ou não de glicose. Foram determinados o diâmetro médio da colônia, o diâmetro médio do halo e o Índice Enzimático. Como resultados, todas as linhagens testadas foram capazes de degradar o amido quando na ausência de glicose, porém o tratamento que obteve estatisticamente melhor crescimento e maior degradação do amido foi o MC sem glicose a 2% amido e a linhagem que se demonstrou potencialmente degradadora de amido foi o mutante CLB3. Conclui-se, portanto, que Aspergillus nidulans pode ser considerado como um produtor de amilases.

Identificação de Aspergillus spp: toxigênico em arroz

A composição química e o modo de cultivo do arroz o tornam susceptível à contaminação fúngica e, consequentemente, por micotoxinas. Considerando-se o expressivo consumo de arroz e a possibilidade de ser potencial fonte de micotoxinas, especial atenção deve ser dispensada quanto à qualidade do produto adquirido. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar espécies do gênero Aspergillus quanto à capacidade toxigênica, em diferentes subgrupos de arroz. As amostras constituíram-se de 31 marcas de arroz referentes aos subgrupos branco polido (21) e parboilizado (10), mais comumente comercializadas na cidade de Lavras - MG. Ao contrário dos outros subgrupos, a incidência de Aspergillus flavus e Aspergillus niger em amostras de arroz branco polido aumentou significativamente após a desinfecção. Pôde-se observar que, 50% dos Aspergillus flavus e 50% dos Aspergillus niger encontrados, foram considerados toxigênicos para o subgrupo branco polido. Na amostra de arroz parboilizado, 67% dos Aspergillus flavus eram potenciais produtores. O Aspergillus ochraceus não se revelou como toxigênico. Este estudo permitiu concluir que, apesar de trabalhos isolados, a presença de fungos toxigênicos em arroz é verídico, o que se torna relevante por se tratar de um cereal importante no cenário mundial.

Análise comparativa de duas metodologias para a identificação de cilindros hemáticos urinários

INTRODUÇÃO: A presença de hemácias dismórficas na urina é um forte indicativo da origem glomerular do sangramento, sendo uma ferramenta importante no diagnóstico de glomerulonefrites. Os cilindros hemáticos geralmente acompanham as hemácias dismórficas, sendo também fortes indicadores de hematúria glomerular, embora não sejam encontrados com frequência no exame parcial de urina. OBJETIVO: Comparar duas técnicas de concentração de amostras em uma série de exames de urina com hematúria dismórfica. MATERIAL E MÉTODOS: Foram selecionadas 249 amostras com hematúria dismórfica a partir de 4.277 amostras de urina de rotina. As amostras foram processadas utilizando-se duas técnicas: a convencional e a de concentração. O percentual de identificação dos cilindros hemáticos foi comparado de acordo com a metodologia utilizada. RESULTADOS: A presença de cilindros hemáticos pela técnica de concentração foi estatisticamente maior (52,6%) em comparação com a positividade pela metodologia convencional (8,4%) (p < 0,001). DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: Sugere-se que a técnica convencional não concentrou suficientemente a amostra de urina e os cilindros hemáticos ficaram no sobrenadante, sendo descartados. A utilização da técnica de concentração aumentou a sensibilidade técnica para a pesquisa dos cilindros hemáticos. Portanto, a técnica de concentração, associada à presença de hemácias dismórficas, mostrou-se útil para aumentar a concordância dos dois parâmetros laboratoriais para a detecção da hematúria de origem glomerular como auxílio diagnóstico das glomerulopatias, importante causa de doença renal crônica.

Análise de RAPD na identificação de cultivares: uma metodologia útil?

Caracteres morfológicos têm sido utilizados tradicionalmente como assinaturas da identidade e pureza varietal e genética. Esses descritores se constituem em uma base pobre, por ser uma medida indireta da composição genética do material. Uma vez que caracteres moleculares revelam diferenças genéticas mais rapidamente, com maior precisão e sem o obscurecimento causado pelo efeito ambiental, oferecem vantagens significantes em termos de discriminação, confiabilidade, rapidez e custo reduzido. Um método molecular relativamente novo, DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD), baseado na reação em cadeia da polimerase (PCR), tem sido adotado por alguns pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de métodos de identificação de cultivares principalmente por ser uma técnica simples que não requer nenhuma informação prévia sobre seqüências de nucleotídeos do genoma da espécie, além de ser bastante acessível e de custo relativamente baixo. Mas, infelizmente, a análise de RAPD apresenta sérios problemas, principalmente em relação à reprodutibilidade e caracterização da homologia dos produtos. Se esses problemas podem ser efetivamente resolvidos então a análise de RAPD pode se tornar um método eficiente e aplicável, mas talvez o investimento em tempo e dinheiro seja mais útil no desenvolvimento e adaptação de técnicas mais promissoras. Há um grande volume de publicações sobre a técnica de RAPD na literatura, todas evidenciando o mesmo problema: a variabilidade inerente aos produtos de amplificações com primers decâmeros limita a sua utilização na indústria e em programas de certificação. O objetivo deste trabalho foi discorrer sobre a eficiência da técnica de RAPD na identificação de cultivares, ressaltando as suas vantagens e limitações.

Padrões eletroforéticos de hordeínas e isoenzimas para identificação de cultivares de cevada

O objetivo deste trabalho foi determinar os padrões de eletroforese em gel de poliacrilamida das hordeínas e isoenzimas de cinco cultivares brasileiras de cevada (Hordeum vulgare L.): Embrapa 43, Embrapa 127, Embrapa 128, Embrapa 129 e BR 2, visando a identificação das cultivares. A uniformidade (homogeneidade) desses padrões também foi determinada por meio da análise individual de 90 amostras de sementes de cada cultivar. A maioria das cultivares foi prontamente discriminada pelos eletroforegramas de hordeínas. Três cultivares apresentaram padrões únicos de hordeínas, enquanto as outras duas (Embrapa 128 e BR 2) apresentaram padrões diferentes de esterases (EC 3.1.1.1). As medidas de similaridade calculadas a partir dos dados de hordeínas e esterases conjugados, utilizando o coeficiente de Jaccard, possibilitaram discriminar todas as cultivares e biótipos encontrados. A cultivar Embrapa 43 apresentou dois biótipos bem definidos de hordeínas e esterases. A variação do perfil de hordeínas nessa cultivar foi diretamente relacionada com a variação nos zimogramas de esterase. Essa relação não foi observada em todas as cultivares que apresentaram biótipos. Pode-se constatar que a análise de dados de eletroforese de hordeínas e esterases em conjunto é um método útil para a identificação de cultivares de cevada.

Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho

Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de alfa-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de "random primers". A amplificação por PCR de uma porção do gene da alfa-amilase foi realizada com os "primers": "sense" - CGACATCGACCACCTCAAC; "antisense" - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de alfa-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação.

Identificação do estádio adequado para realização de análises isoenzimáticas na caracterização de cultivares de arroz

Os sistemas enzimáticos comumente utilizados na caracterização de cultivares são produtos da expressão gênica, e, portanto, altamente influenciados pelo estádio de desenvolvimento da plântula, pelo tecido vegetal e pelo ambiente. Esses fatores normalmente não são considerados no momento de realizar uma análise conjunta de vários sistemas enzimáticos para uma determinada espécie, decorrendo assim numa inadequada e ineficiente leitura e interpretação dos resultados. No presente trabalho objetivou-se determinar o momento adequado no qual cada sistema enzimático apresenta máxima expressão fenotípica para ser utilizado na caracterização isoenzimática de cultivares de arroz. Dois lotes, um de alta e um de baixa qualidade fisiológica, para cada uma das variedades de arroz El Paso L144, IRGA 417 e EEA 406, foram analisados utilizando-se os sistemas enzimáticos Esterase, Fosfatase Ácida, Glutamato Desidrogenase, Glutamato Oxalacetato Transaminase, e Malato Desidrogenase. Seis estádios de desenvolvimento (0, 2, 4, 6, 8 e 10 dias) foram avaliados para a extração de proteínas. Dos resultados obtidos pode se inferir que: cada sistema enzimático analisado apresenta um momento adequado para extração de proteínas; não foi possível identificar um estádio de desenvolvimento onde coincidira a máxima expressão fenotípica de todos os sistemas enzimáticos; a análise simultânea de vários sistemas isoenzimáticos, a partir de uma única extração de proteína não é recomendada. A qualidade fisiológica das sementes da cultivar EEA 406 afetou a análise isoenzimática dos sistemas Esterase e Glutamato Oxalacetato Transaminase.

Identificação de cultivares de milho, feijão, algodão e soja por meio de enzimas e proteínas resistentes ao calor

Nesta pesquisa foram avaliados o polimorfismo e a estabilidade de isoenzimas e de proteínas resistentes ao calor em sementes de cultivares de milho, feijão, algodão e soja, com diferentes níveis de qualidade fisiológica. As isoenzimas ,álcool desidrogenase, catalase, esterase e superóxido dismutase analisadas conjuntamente, foram eficientes na separação de oito cultivares de milho. Para as cultivares de feijão, pela enzima peroxidase foi possível diferenciar a cultivar Carioca, no entanto, este padrão mostrou-se variável em sementes com baixa germinação. Não foi possível diferenciar as cultivares de algodão pelas enzimas esterase, superóxido dismutase, diaforase e malato desidrogenase. A cultivar Conquista, de soja, foi diferenciada pelos sistemas enzimáticos esterase e superóxido dismutase e a 'BRS-154' pela esterase. Proteínas resistentes ao calor são polimórficas e estáveis para a identificação de cultivares de milho.

cDNA-AFLP na identificação de genes relacionados a qualidade fisiológica

Alguns trabalhos têm evidenciado a existência de genótipos de soja contrastantes para qualidade fisiológica de semente. Tais diferenças existem em virtude da presença de sementes com total ou parcial impermeabilidade do tegumento à água, o que as tornam menos susceptíveis aos danos mecânicos, as adversidades climáticas e a deterioração por umidade. A característica de tegumento semi-permeável pode ser incorporada às cultivares de alta produção por meio dos programas de melhoramento. No entanto, há necessidade de caracterizar os genes ou as regiões genômicas envolvidas com esta característica. Nesse contexto, ferramentas da biologia molecular, como a técnica de cDNA-AFLP, podem auxiliar a identificação de genes relacionados a qualidade fisiológica de sementes. O objetivo desse estudo foi verificar a eficácia da técnica de cDNA-AFLP, na obtenção de fragmentos de genes diferencialmente expressos entre tegumentos de sementes de soja com permeabilidade contrastante. Sementes provenientes dos genótipos CD-202 (tegumento amarelo, permeável e susceptível a deterioração) e TP (tegumento preto, semi-permeável e resistente a deterioração) foram cultivadas em casa-de-vegetação, sob condições homogêneas. Realizou-se a coleta das sementes em diferentes estágios de desenvolvimento (25, 30, 35, 40 e 55 dias após a antese). Procedeu-se à extração do RNA total utilizando-se três métodos, sendo o reagente Pure Link Plant RNA o mais eficiente. Para obtenção do cDNA dupla fita utilizou-se o kit Double Stranded cDNA Synthesis. A partir do cDNA obtido, aplicou-se a técnica de AFLP testando-se um total de 64 combinações de primers. Foram obtidos 47 fragmentos de cDNA diferencialmente expressos entre os tegumentos de sementes dos dois genótipos, os quais poderão ter suas funções reveladas pelo sequenciamento e análise in sílico. De acordo com os resultados obtidos, a técnica de cDNA-AFLP demonstra ser uma alternativa promissora para estudos que visem à identificação de genes relacionados a qualidade de sementes.

Ajuste de metodologias para a identificação de cultivares de soja quanto à tolerância ao glifosato

Os bioensaios constituem numa alternativa prática e eficiente para detecção de sementes de soja geneticamente modificada (GM), tolerante ao glifosato. Contudo, deve ser verificada sua utilização na identificação das sementes quando o lote é de soja GM, ou seja, quando sementes de soja convencional são a minoria. Objetivou-se com este trabalho ajustar a metodologia de dois bioensaios de detecção de sementes de soja GM e testar os melhores protocolos, um de cada bioensaio, na detecção e quantificação de misturas simuladas, contendo genótipos contrastantes quanto à tolerância ao herbicida. Nos bioensaios, foram testadas três umidades do substrato (2,0; 2,5 e 3,0 vezes o seu peso seco), cinco soluções do herbicida (0; 0,01; 0,03; 0,06 e 0,12 %) no método papel umedecido com glifosato e quatro soluções (0; 0,3; 0,6 e 1,2 %) no método pré - embebição de sementes. A umidade 3,0 e solução 0,03 % constituíram o protocolo mais eficiente para detecção no método do papel umedecido. A umidade 2,0 e solução 0,3 % se destacaram no método da pré-embebição das sementes. Foi mais prático e rápido detectar plântulas tolerantes do que plântulas sensíveis em ambos os testes. Em amostras com maior taxa de contaminação, foi mais fácil detectar e mais difícil quantificar misturas com exatidão. Os erros foram relativamente raros considerando os acertos.

Produção de sementes, qualidade fisiológica e identificação de genótipos de alface termotolerantes

A alface (Lactuca sativa L.) é uma das folhosas de maior importância na cadeia produtiva de hortaliças. O estabelecimento da lavoura de alface pode ser feito por meio da semeadura direta ou transplantio de mudas. As sementes apresentam particular sensibilidade às variações de temperatura do meio onde germinam. Condições de alta temperatura, por exemplo, afetam negativamente a germinação e o estabelecimento de plântulas. O objetivo neste trabalho foi identificar as diferenças de germinação de sementes de vinte cultivares de alface em condições de temperatura ideal 20 ºC, temperatura intermediária 27,5 ºC e temperatura crítica 35 ºC. Utilizaram-se sementes comerciais adquiridas de empresas, bem como sementes das mesmas cultivares produzidas na Embrapa Hortaliças, em condições de casa de vegetação. Alguns genótipos termotolerantes Vitória de Verão e Camila foram identificados, obtendo germinação acima de 90% nas temperaturas: favorável e crítica máxima. Estes genótipos poderiam ser utilizados como fonte genética de tolerância à germinação a altas temperaturas. Para as sementes produzidas na casa de vegetação, a maioria não germinou satisfatoriamente em condições de altas temperaturas.