Antimicrobial resistance profiles and genetic characterisation of macrolide resistant isolates of Streptococcus agalactiae

In this study, 100 clinical isolates of Streptococcus agalactiae recovered from genitourinary tract specimens of non-pregnant individuals living in Rio de Janeiro were submitted for antimicrobial susceptibility testing, detection of macrolide resistance genes and evaluation of the genetic diversity of erythromycin-resistant isolates. By agar diffusion method, all isolates were susceptible to ceftazidime, penicillin and vancomycin. Isolates were resistant to levofloxacin (1%), clindamycin (5%), erythromycin (11%) and tetracycline (83%) and were intermediated to erythromycin (4%) and tetracycline (6%). Erythromycin-resistant and intermediated isolates presented the following phenotypes: M (n = 3), constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLS B, n = 5) and inductive MLS B (n = 7). Determinants of macrolide resistance genes, erm and mef, were detected in isolates presenting MLS B and M phenotypes, respectively. Randomly amplified polymorphic DNA profiles of erythromycin-resistant isolates were clustered into two major groups of similarity.

The genetic diversity and phenotypic characterisation of Streptococcus agalactiae isolates from Rio de Janeiro, Brazil

Streptococcus agalactiae isolates are more common among pregnant women, neonates and nonpregnant adults with underlying diseases compared to other demographic groups. In this study, we evaluate the genetic and phenotypic diversity in S. agalactiae strains from Rio de Janeiro (RJ) that were isolated from asymptomatic carriers. We analysed these S. agalactiae strains using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), serotyping and antimicrobial susceptibility testing, as well as by determining the macrolide resistance phenotype, and detecting the presence of the ermA/B, mefA/E and lnuB genes. The serotypes Ia, II, III and V were the most prevalent serotypes observed. The 60 strains analysed were susceptible to penicillin, vancomycin and levofloxacin. Resistance to clindamycin, chloramphenicol, erythromycin, rifampin and tetracycline was observed. Among the erythromycin and/or clindamycin resistant strains, the ermA, ermB and mefA/E genes were detected and the constitutive macrolides, lincosamides and streptogramin B-type resistance was the most prevalent phenotype observed. The lnuB gene was not detected in any of the strains studied. We found 56 PFGE electrophoretic profiles and only 22 of them were allocated in polymorphism patterns. This work presents data on the genetic diversity and prevalent capsular serotypes among RJ isolates. Approximately 85% of these strains came from pregnant women; therefore, these data may be helpful in developing future prophylaxis and treatment strategies for neonatal syndromes in RJ.

Genetic diversity and antimicrobial resistance in Streptococcus agalactiae strains recovered from female carriers in the Bucharest area

For the first time, we used multilocus sequence typing (MLST) to understand how Romanian group B streptococcus (GBS) strains fit into the global GBS population structure. Colonising isolates recovered from adult human females were tested for antibiotic resistance, were molecularly serotyped based on the capsular polysaccharide synthesis (cps) gene cluster and further characterised using a set of molecular markers (surface protein genes, pilus-encoded islands and mobile genetic elements inserted in the scpB-lmb intergenic region). Pulsed-field gel electrophoresis was used to complement the MLST clonal distribution pattern of selected strains. Among the 55 strains assigned to six cps types (Ia, Ib, II-V), 18 sequence types (STs) were identified by MLST. Five STs represented new entries to the MLST database. The prevalent STs were ST-1, ST-17, ST-19 and ST-28. Twenty molecular marker profiles were identified. The most common profiles (rib+GBSi1+PI-1, rib+GBSi1+PI-1, PI-2b and alp2/3+PI-1, PI-2a) were associated with the cps III/ST-17 and cps V/ST-1 strains. A cluster of fluoroquinolone-resistant strains was detected among the cps V/ST-19 members; these strains shared alp1 and IS1548 and carried PI-1, PI-2a or both. Our results support the usefulness of implementing an integrated genotyping system at the reference laboratory level to obtain the reliable data required to make comparisons between countries.

Antimicrobial susceptibility patterns, emm type distribution and genetic diversity of Streptococcus pyogenes recovered in Brazil

Streptococcus pyogenes is responsible for a variety of infectious diseases and immunological complications. In this study, 91 isolates of S. pyogenes recovered from oropharynx secretions were submitted to antimicrobial susceptibility testing, emm typing and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis. All isolates were susceptible to ceftriaxone, levofloxacin, penicillin G and vancomycin. Resistance to erythromycin and clindamycin was 15.4%, which is higher than previous reports from this area, while 20.9% of the isolates were not susceptible to tetracycline. The macrolide resistance phenotypes were cMLSB (10) and iMLSB (4). The ermB gene was predominant, followed by the ermA gene. Thirty-two emm types and subtypes were found, but five (emm1, emm4, emm12, emm22, emm81) were detected in 48% of the isolates. Three new emm subtypes were identified (emm1.74, emm58.14, emm76.7). There was a strong association between emm type and PFGE clustering. A variety of PFGE profiles as well as emm types were found among tetracycline and erythromycin-resistant isolates, demonstrating that antimicrobial resistant strains do not result from the expansion of one or a few clones. This study provides epidemiological data that contribute to the development of suitable strategies for the prevention and treatment of such infections in a poorly studied area.

Interferon-γ inhibits group B Streptococcus survival within human endothelial cells

Endothelial dysfunction is a major component of the pathophysiology of septicaemic group B Streptococcus (GBS) infections. Although cytokines have been shown to activate human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), the capacity of interferon (IFN)-γ to enhance the microbicidal activity of HUVECs against GBS has not been studied. We report that the viability of intracellular bacteria was reduced in HUVECs activated by IFN-γ. Enhanced fusion of lysosomes with bacteria-containing vacuoles was observed by acid phosphatase and the colocalisation of Rab-5, Rab-7 and lysosomal-associated membrane protein-1 with GBS in IFN-γ-activated HUVECs. IFN-γ resulted in an enhancement of the phagosome maturation process in HUVECs, improving the capacity to control the intracellular survival of GBS.

Desempenho e hematologia de tilápias-do-nilo alimentadas com Saccharomyces cerevisiae e vacinadas contra Streptococcus agalactiae

O objetivo deste trabalho foi avaliar a inter-relação entre a suplementação alimentar com parede celular de Saccharomyces cerevisae e a vacinação contra Streptococcus agalactiae e seu efeito sobre o desempenho produtivo e as variáveis hematológicas de tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus). Oitenta e quatro tilápias-do-nilo foram distribuídas em 12 caixas de fibra (n=7), em arranjo fatorial 2x2x3, correspondente a dois níveis de suplementação com parede celular de levedura, dois tipos de inoculação e três tempos de avaliação. Os peixes foram alimentados durante 77 dias. A vacinação dos peixes foi realizada 60 dias após o início da alimentação. Quinze dias após a vacinação, todos os peixes foram submetidos ao desafio com cepa viva de S. agalactiae, e 6, 24 e 48 horas após o desafio, o sangue foi colhido da veia caudal para avaliações. Peixes alimentados com ração suplementada apresentam maior ganho de peso e taxa de crescimento específico, e a interação entre os efeitos da dieta e da vacinação resulta em maiores taxas de hematócrito, hemoglobina e leucócitos.

Streptococcus agalactiae em gestantes: prevalência de colonização e avaliação da suscetibilidade aos antimicrobianos

OBJETIVOS: verificar a ocorrência de colonização por Streptococcus agalactiae em gestantes e avaliar a suscetibilidade das amostras isoladas aos antimicrobianos. MÉTODOS: foram avaliadas 167 grávidas entre a 32ª e a 41ª semana de gestação, independente da presença ou não de fatores de risco, atendidas no ambulatório de pré-natal entre fevereiro de 2003 e fevereiro de 2004. O material vaginal/anal, colhido com um único swab, foi inoculado em caldo Todd-Hewitt acrescido de ácido nalidíxico (15 µg/mL) e gentamicina (8 µg/mL), com posterior subcultura no meio de ágar sangue. A identificação foi feita por meio da avaliação da morfologia e tipo de hemólise das colônias no meio de ágar sangue, teste da catalase, teste de cAMP e testes sorológicos. A avaliação da suscetibilidade aos antimicrobianos foi realizada pelos testes de difusão e de diluição em ágar. A análise estatística foi realizada por meio do teste de chi2; valores de p<0,05 foram considerados significativos. RESULTADOS: a freqüência de colonização foi de 19,2%, sem diferenças significativas com relação à idade, número de gestações, ocorrência de abortos e presença ou ausência de diabete melito (p>0,05). Todas as 32 amostras isoladas foram sensíveis a penicilina, cefotaxima, ofloxacina, cloranfenicol, vancomicina e meropenem. A resistência a eritromicina e clindamicina foi detectada em 9,4 e 6,2% das amostras, respectivamente. CONCLUSÕES: a incidência relativamente elevada (19,2%) de colonização por S. agalactiae entre as gestantes avaliadas e o isolamento de amostras resistentes, especialmente aos antimicrobianos recomendados nos casos de alergia à penicilina, enfatizam a importância de detectar esta colonização no final da gravidez, associada à avaliação da suscetibilidade aos antimicrobianos, para uma prevenção eficaz da infecção neonatal.

Prevalência de colonização por Streptococcus agalactiae em gestantes atendidas em maternidade do Ceará, no Brasil, correlacionando com os resultados perinatais

OBJETIVO: Analisar a prevalência de Streptococcus agalactiae, um estreptococo do Grupo B, em gestantes e seus possíveis fatores de risco, bem como o impacto perinatal e a suscetibilidade antimicrobiana das colonizadas. MÉTODOS: Foram avaliadas 213 gestantes a partir de 20 semanas de gestação, independente dos fatores de risco, atendidas em um hospital-escola terciário da zona Norte do Estado de Ceará, no Brasil. O cálculo do tamanho amostral ocorreu por conveniência. Foi utilizada técnica do swab estéril único para coleta de secreção das regiões vaginal e perianal. As amostras recém-obtidas eram armazenadas em meio de transporte Stuart e, no laboratório, inoculadas em meio seletivo Todd-Hewitt adicionado de gentamicina (8 ug/mL) e ácido nalidíxico (15 ug/mL), com posterior subcultivo em placas em ágar-sangue. Nos materiais eram realizados teste de Gram, catalase com peróxido de oxigênio e CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen), sendo confirmados sorologicamente com Streptococcal Grouping Kit, Oxoid®. As positivas foram submetidas a testes de suscetibilidade antimicrobiana. Foram também avaliadas variáveis socioeconômicas, reprodutivas, clínico-obstétricas e neonatais. Os dados foram analisados utilizando o programa Epi-Info 6.04. RESULTADOS: A prevalência de colonização encontrada foi de 9,8% pelo teste de CAMP, embora apenas 4,2% pelo sorológico. O único fator de proteção observado foi cor da pele branca (p=0,01, 0.45>OR>0.94, IC95%). Não foi observada diferença de prevalência do estreptococo do Grupo B com outras variáveis reprodutivas ou obstétricas. Ocorreu infecção em apenas um dos recém-nascidos de mães colonizadas, entretanto revelou-se infecção por Pseudomonas spp. Foi encontrada resistência para ampicilina (4/9) e cefalotina (4/9), penicilina (4/9 casos), eritromicina (3/9), clindamicina (7/9) e cloranfenicol (1/9). CONCLUSÕES: A taxa de infecção foi inferior à encontrada em outros estudos, embora também notou-se grande taxa de resistência aos antibióticos mais utilizados no tratamento. São necessários novos estudos no Brasil, com grupos geograficamente semelhantes, para a validação desses resultados.

Taxa de infecção e sorotipos de Streptococcus agalactiae em amostras de recém-nascidos infectados na cidade de Campinas (SP), Brasil

OBJETIVO: Descrever os casos e o perfil microbiológico dos sorotipos de Streptococcus agalactiae provenientes de recém-nascidos em um Centro de Referência da Saúde da Mulher na cidade de Campinas, São Paulo, Brasil. MÉTODOS: Estudo transversal clínico-laboratorial realizado de janeiro de 2007 a dezembro de 2011. As cepas suspeitas, isoladas em amostras de sangue e líquor, foram identificadas a partir da hemólise em ágar sangue, coloração de Gram, provas de catalase, teste de CAMP, hidrólise do hipurato ou por automação microbiológica Vitek 2 BioMerieux®. A seguir, estas cepas foram tipadas por PCR utilizando sucessivamente primers específicos para espécie e para nove sorotipos de S. agalactiae. RESULTADOS: Foram isoladas sete amostras de sangue, uma de líquor e uma de secreção ocular provenientes de nove recém-nascidos com infecções causadas pelo S. agalactiae, sendo sete casos de infecção de início precoce e duas de início tardio. Apenas um destes casos foi positivo para amostras pareadas mãe-filho. Para um total de 13.749 partos no período, os 7 casos correspondem a 0,5 caso de infecção precoce por Streptococcus do Grupo B a cada 1 mil nascidos vivos (ou 0,6 casos por 1 mil, incluindo os 2 de infecção tardia), tendo ocorrido 1, 3, 2, nenhum e 3 casos (um precoce e dois tardios), respectivamente, nos anos de 2007 a 2011. Foi possível realizar o PCR para sete amostras, sendo duas de cada um dos sorotipos Ia e V e o sorotipo III em três amostras, uma delas em um recém-nascido e outras duas em amostra pareada mãe-filho. CONCLUSÕES: Embora com casuística limitada, os sorotipos encontrados coincidem com os mais prevalentes na literatura mundial, mas diferem dos estudos brasileiros, exceto para o sorotipo Ia.

Sorotipagem de amostras de Streptococcus suis isoladas de suínos em granjas dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Paraná

Infecções causadas por Streptococcus suis são muito comuns em países onde a indústria de carne suína é desenvolvida. Estas infecções estão relacionadas a casos clínicos de broncopneumonia, meningite, artrite, pericardite, miocardite, endocardite, poliserosite fibrinosa, septicemia, rinite e aborto. Esta bactéria também foi descrita como patógeno de ruminantes e humanos. No Brasil há evidências clínicas da existência de processos infecciosos causados por S. suis afetando mais de 50% das granjas em Estados como São Paulo, Minas Gerais e Paraná. No presente estudo foram isoladas 51 amostras de S. suis de granjas do Estados acima referidos, coletadas de diferentes casos clínicos como septicemia, meningite, artrite e pneumonia, tendo sido obtidas ou em cultura pura ou como patógeno de maior predominância nos tecidos de suínos. Este material foi semeado em Columbia ágar sangue adicionado de 5% de sangue bovino e incubado a 37°C por 24 horas. Para a identificação bioquímica as colônias que apresentavam a-hemólise, bem como as amostras padrão, foram submetidas a testes convencionais para a confirmação da espécie S. suis, tais como: hidrólise de arginina, teste de Voges-Proskauer, e produção de ácido a partir de vários carboidratos (inulina, salicina, trealose, lactose, sacarose, sorbitol, manitol e glicerol). As amostras também foram testadas para habilidade de crescimento em meio de TSA com 6,5% de NaCl e para a produção de amilase. Todas as amostras que fizeram parte desta pesquisa foram testadas pelo sistema Api 20 Strep para confirmação dos resultados obtidos nos testes convencionais. Para a sorotipagem foram produzidos antissoros de 1 a 8. Outras amostras não pertencentes a estes sorotipos também foram sorotipadas. O antissoro produzido em coelhos foi titulado pelo teste de aglutinação em tubo com 2-mercaptoetanol e pelo teste de reação capsular e, quando adequados, foram usados no teste de co-aglutinação, para a sorotipagem das amostras de S. suis. A sorotipagem das 51 amostras isoladas mostraram os seguintes resultados: 30 (58,8%) foram classificadas como sorotipo 2, 11 (21,6%) das amostras como sorotipo 3, sete (13,72%) como sorotipo 7, duas (3,92%) como sorotipo 1 e uma amostra como pertencente ao sorotipo14 (1,96%). Este é o primeiro relato do isolamento de um grande número de amostras de S. suis no Brasil, de casos típicos de processos infecciosos causados por esta bactéria. Também foi realizada a sorotipagem dos isolados, mostrando uma alta prevalência do sorotipo 2, quando comparada com a dos demais sorotipos encontrados.

Perfil fenotípico e susceptibilidade antimicrobiana de Streptococcus equi isolados de equinos da região Sul do Brasil

As características fenotípicas [morfológicas, bioquímicas, susceptibilidade aos antimicrobianos, índice de resistência múltipla aos antimicrobianos (IRMA), concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) da benzilpenicilina] de 38 isolados de Streptococcus equi oriundos de amostras clínicas de animais com adenite equina foram alvo deste estudo. A fenotipia demonstrou três padrões de colônias, três biotipos de fermentação de carboidratos e variação de 0 a 0,4 no IRMA. Todos os isolados de S. equi demonstraram sensibilidade à penicilina, tanto pelo método de disco difusão quanto pelo método de microdiluição. A CIM e CBM média de benzilpenicilina foi de 0,0095μg/mL e 0,0267μg/mL para S. equi subesp. equi e de 0,0128μg/mL e 0,0380μg/mL para S. equi subesp. zooepidemicus. Os valores de CIM e CBM diferiram entre as subespécies (p<0,05). O diâmetro do halo de inibição de penicilina demonstrou relação com a CIM (ì=0,03638 - 0,00072x) para S. equi subesp. equi. Também foi demonstrada relação entre o diâmetro do halo de inibição de penicilina com a CBM para S. equi subesp. equi (ì=0,10931- 0,00223x). Entretanto para as amostras de S. equi subesp. zooepidemicus esta relação somente foi verificada para a CBM (ì=0,1322 - 0,00271x). A CIM de benzilpenicilina frente às amostras isoladas da região Central, Planalto e Sul do estado do Rio Grande do Sul foram estatisticamente semelhantes, mas diferiram do isolado do estado do Paraná, sugerindo o caráter atípico desta cepa. Todos os isolados de S. equi são sensíveis à penicilina e sulfazotrim, confirmando a eleição destes antimicrobianos para o tratamento das infecções por este agente na clínica veterinária. Os resultados obtidos não dispensam a utilização prudente dos antimicrobianos.

Improvement of the indirect hemagglutination test for the detection of antibodies to Streptococcus pyogenes

An indirect hemagglutination test for a seroepidemiological survey of Streptococcus pyogenes infection was standardized. This is an improved modification of the indirect hemagglutination test which utilizes an unstable reagent prepared with fresh blood cells. Two types of bacterial antigens represented by extracellular products and purified streptolysin O were assayed, but only the former antigen gave good results. Pretreatment of the bacterial antigen with 0.15 M NaOH and neutralization to pH 5.5, as well as postfixation of sensitized red cells with 0.1% glutaraldehyde at 56oC for 30 min were found to be essential to give long stability to the reagent in liquid suspension, at least 9 months at 4oC. A total of 564 serum samples with high, moderate and low anti-streptolysin O antibodies as determined by the neutralization assay were studied by the indirect hemagglutination test using the new reagent. The sensitivity, specificity, efficiency, positive predictive value and negative predictive value of the test in relation to the neutralization assay were 0.950, 0.975, 0.963, 0.973, and 0.955, respectively. The kappa agreement index between the two techniques was high (0.926) and ranked as "almost perfect". Antibody levels detected by both techniques also presented a high positive correlation (rs = 0.726). Five reagent batches successively produced proved to be reproducible. Thus, the improved indirect hemagglutination test seems to be useful for public health laboratories.

Toluene permeabilization differentially affects F- and P-type ATPase activities present in the plasma membrane of Streptococcus mutans

Streptococcus mutans membrane-bound P- and F-type ATPases are responsible for H+ extrusion from the cytoplasm thus keeping intracellular pH appropriate for cell metabolism. Toluene-permeabilized bacterial cells have long been used to study total membrane-bound ATPase activity, and to compare the properties of ATPase in situ with those in membrane-rich fractions. The aim of the present research was to determine if toluene permeabilization can significantly modify the activity of membrane-bound ATPase of both F-type and P-type. ATPase activity was assayed discontinuously by measuring phosphate release from ATP as substrate. Treatment of S. mutans membrane fractions with toluene reduced total ATPase activity by approximately 80% and did not allow differentiation between F- and P-type ATPase activities by use of the standard inhibitors vanadate (3 µM) and oligomycin (4 µg/mL). Transmission electron microscopy shows that, after S. mutans cells permeabilization with toluene, bacterial cell wall and plasma membrane are severely injured, causing cytoplasmic leakage. As a consequence, loss of cell viability and disruption of H+ extrusion were observed. These data suggest that treatment of S. mutans with toluene is an efficient method for cell disruption, but care should be taken in the interpretation of ATPase activity when toluene-permeabilized cells are used, because results may not reflect the real P- and F-type ATPase activities present in intact cell membranes. The mild conditions used for the preparation of membrane fractions may be more suitable to study specific ATPase activity in the presence of biological agents, since this method preserves ATPase selectivity for standard inhibitors.

Streptococcus mutans GlnK protein: an unusual PII family member

Streptococcus mutans is a Gram-positive bacterium present in the oral cavity, and is considered to be one of the leading causes of dental caries. S. mutans has a glnK gene, which codes for a PII-like protein that is possibly involved in the integration of carbon, nitrogen and energy metabolism in several organisms. To characterize the GlnK protein of S. mutans, the glnK gene was amplified by PCR, and cloned into the expression vectors pET29a(+) and pET28b(+). The native GlnK-Sm was purified by anion exchange (Q-Sepharose) and affinity (Hi-Trap Heparin) chromatography. The GlnK-His-Sm protein was purified using a Hi-Trap Chelating-Ni2+ column. The molecular mass of the GlnK-His-Sm proteins was 85 kDa as determined by gel filtration, indicating that this protein is a hexamer in solution. The GlnK-His-Sm protein is not uridylylated by the Escherichia coli GlnD protein. The activities of the GlnK-Sm and GlnK-His-Sm proteins were assayed in E. coli constitutively expressing the Klebsiella pneumoniae nifLA operon. In K. pneumoniae, NifL inhibits NifA activity in the presence of high ammonium levels and the GlnK protein is required to reduce the inhibition of NifL in the presence of low ammonium levels. The GlnK-Sm protein was unable to reduce NifL inhibition of NifA protein. Surprisingly, the GlnK-His-Sm protein was able to partially reduce NifL inhibition of the NifA protein under nitrogen-limiting conditions, in a manner similar to the GlnK protein of E. coli. These results suggested that S. mutans GlnK is functionally different from E. coli PII proteins.