Otimização e validação da extração sólido-líquido e purificação em baixa temperatura de HPAs em lodo de esgoto

In this study, a method of solid-liquid extraction and purification at low temperature (SLE-PLT) to determine 16 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in sewage sludge was optimized and validated. The analyses were performed by HPLC-UV. The extraction phase, homogenization procedure, influence of pH, ionic strength and clean-up of the extracts were optimized. Recoveries were higher than 63.4% for 11 PAHs. The correlation coefficients were greater than 0.99 and limits of detection and quantitation were less than 0.060 and 0.15 µg g-1, respectively. These values were lower than the maximum residue limits of PAHs established by European legislation. SLE-PLT proved a more practical, economical method with fewer steps compared to Soxhlet extraction (reference method) for PAHs in sewage sludge.

DISTRIBUIÇÃO, ATIVIDADE BIOLÓGICA, SÍNTESE E MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE PODOFILOTOXINA E SEUS DERIVADOS

Podophyllotoxin is the most studied lignan because of its use as an antimitotic agent and because it is a precursor of pharmacologically active derivatives. This review describes the anticancer activities of podophyllotoxin and the different processes that have been developed for its extraction and purification from Podophyllum spp. In addition, the synthesis routes of this compound and the development of three semi-synthetic procedures to obtain etoposide, teniposide, and Etopophos are detailed.

Purificação de metabólitos fúngicos com efeitos tóxicos sobre Meloidogyne incognita

Objetivando o desenvolvimento de novas metodologias de controle de fitonematóides, este trabalho buscou purificar as substâncias nematicidas produzidas por Cunninghamella elegans, Fusarium sp., Paecilomyces lilacinus eP. variotii. Esses fungos foram cultivados em meio líquido Czapek-Dox durante 15 dias, a 25 ºC, em agitador orbital. Em seguida, filtraram-se as misturas, o que permitiu a obtenção de soluções que foram concentradas sob vácuo e submetidas à purificação direcionada por testes in vitro com Meloidogyne incognita. Observou-se que os filtrados de P. lilacinus e P. variotii perdiam suas atividades nematicidas após a concentração sob vácuo, sugerindo que as substâncias ativas produzidas por esses fungos são consideravelmente voláteis. Para o filtrado de Fusarium sp., observou-se perda total da atividade contra M. incognita após fracionamento em coluna de sílica gel, indicando instabilidade da substância nematicida frente às condições empregadas.Do filtrado de C. elegans isolou-se uma substância que, em solução aquosa na concentração de 250 ppm, imobilizou 94% dos juvenis do segundo estádio de M. incognita expostos a tal solução durante 48 h.

Extratos vegetais com propriedades nematicidas e purificação do princípio ativo do extrato de Leucaena leucocephala

Inicialmente buscou-se identificar plantas com extratos metanólicos ativos in vitro contra o nematóide Panagrellus redivivus. Das 24 espécies vegetais estudadas, constatou-se que os melhores resultados foram obtidos com Leucaena leucocephala, que causou mortalidade de 93% dos indivíduos expostos ao seu extrato por 24 h. Em seguida, submeteu-se o referido extrato a fracionamento direcionado pelos testes in vitro com P. redivivus, o que possibilitou isolar uma substância nematicida que, segundo análises preliminares, correspondia a um alcalóide.

Purificação parcial de inibidores de tripsina de sementes de Caesalpinia ferrea e Swartzia polyphylla e o efeito dos extratos protéicos sobre fungos fitopatogênicos

Sementes de leguminosas apresentam alta concentração de inibidores de tripsina; estas proteínas estão envolvidas no metabolismo celular e também em mecanismos de defesa vegetal. A fim de confirmar ou não, a possível ação fungicida destas proteínas a partir de extratos de sementes de leguminosas arbóreas, o objetivo deste estudo foi detectar inibidores de tripsina em sementes de Caesalpinia ferrea (CfTI) e Swartzia polyphylla (SpTI) e testar os extratos contra os fungos fitopatogênicos Colletotrichum guaranicola, Corynespora cassiicola, Fusarium oxysporum e Sclerotium rolfsii, avaliando o crescimento micelial e a esporulação. Para tanto, amostras do material biológico vegetal, sementes finamente pulverizadas, foram submetidas à extração em NaCl 150 mM. Os extratos protéicos foram parcialmente purificados em coluna Sephadex G-100, submetidos à detecção dos inibidores e SDS-PAGE (12,5%) e, utilizados nos bioensaios contra os fungos. O perfil eletroforético revelou uma única banda em CfTI e oito bandas em SpTI. Os extratos de C. ferrea e S. polyphylla exibiram efeito na diminuição da esporulação dos fungos testados, mas S. rolfsii foi inibido apenas por C. ferrea. Quanto ao crescimento micelial, os dois extratos tiveram efeito sobre F. oxysporum e S. rolfsii, ao passo que C. guaranicola foi inibido apenas por S. polyphylla, e C. cassiicola por C. ferrea. Concluiu-se que sementes de C. ferrea e S. polyphylla apresentam inibidores de tripsina. Além disso, os resultados sugerem que estas espécies de leguminosas arbóreas são promissoras no que concerne à prospecção de fungicidas naturais, uma vez que os extratos diminuíram o crescimento micelial e a esporulação de C. guaranicola, C. cassiicola, F. oxysporum e S. rolfsii.

Efeitos da purificação e do enriquecimento do creosoto vegetal na preservação da madeira de Eucalyptus grandis, após 48 meses de instalação do ensaio de campo

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da purificação e do enriquecimento do creosoto vegetal contra xilófagos, após 48 meses de instalação do ensaio de campo. Por destilação do alcatrão vegetal, obteve-se o creosoto vegetal bruto (creosoto 1), recuperado à temperatura de 110-255 °C. Uma fração dos destilados foi lavada com solução a 9% de bicarbonato de sódio, para obter o creosoto vegetal purificado (creosoto 2). Os creosotos 1 e 2 foram enriquecidos com 3% de naftenato de cobre; 3% de naftenato de zinco; 3% de naftenato de cobalto; 2% de TBTO; 2% de tribromofenato de tributil-estanho; 2% de pentaclorofenol; ou 0,4% de trióxido de arsênico. Estacas obtidas do alburno de Eucalyptus grandis foram tratadas pelo processo de célula cheia. A eficiência das soluções de creosoto vegetal foi comparada com a do creosoto mineral. O ensaio foi instalado em três localidades (Viçosa, Ponte Nova e Leopoldina). Os resultados indicam que o creosoto 2 + pentaclorofenol foi superior aos creosotos 1 e 2 + TBTO, aos creosotos 1 e 2 + naftenato de zinco e ao creosoto 1 puro, sendo semelhante ao creosoto mineral. O creosoto 2 foi superior ao creosoto 1 apenas para a localidade de Leopoldina. De modo geral, a vida média da madeira não-tratada ficou entre 12 e 24 meses, a da madeira tratada com o creosoto 1 + TBTO entre 24 e 37 meses e a da tratada com o creosoto 1 + naftenato de zinco entre 37 e 48 meses e a com o creosoto 1 + naftenato de cobalto, creosoto 2 puro e creosoto 2 + naftenato de zinco ou TBTO foi de 48 meses. No atual estágio da pesquisa, não é possível estimar a vida média da madeira tratada com as demais soluções preservativas testadas, pois ainda não atingiram os 60% das estacas quebradas.

Purificação e caracterização de alfa-galactosidases de sementes de Platymiscium pubescens Micheli

Este trabalho objetivou foi determinar a composição bioquímica de sementes de espécies florestais e caracterizar a enzima alfa-galactosidase de sementes germinadas de Platymiscium pubescens. Os maiores teores de lipídios foram determinados em sementes de Chorisia speciosa, Caesalpinia peltophoroides, Tabebuia serratifolia e Tabebuia velanedae, enquanto sementes de Enterolobium contortisiliquum, Schizolobium parahyba e Cassia grandis apresentaram os maiores teores protéicos. A alfa-galactosidase catalisa a hidrólise dos oligossacarídeos de rafinose, em sementes de leguminosas, durante a germinação. A maior atividade da alfa-galactosidase foi detectada em sementes de Platymiscium pubescens após 72 h de embebição. Duas formas de alfa-galactosidases, C1 e C2, foram purificadas de sementes germinadas de P. pubescens, usando-se fracionamento com sulfato de amônio e cromatografias de filtração em gel e de afinidade. Essas enzimas apresentaram atividade máxima em pH 5,5 e a 50-55 ºC. Os valores de Km ap das formas C1 e C2, para o substrato ro-nitrofenil-alfa-D-galactopiranosídeo, foram de 0,54 mM e 0,78 mM, e para a rafinose, de 4,64 mM e 5,09 mM, respectivamente. Essas enzimas exibiram estabilidade térmica moderada, mantendo 70% da atividade original após 3 h de incubação a 45 ºC. A atividade enzimática da C1 e C2 foi totalmente perdida na presença de CuSO4 e dodecil sulfato de sódio (SDS). Tais enzimas também hidrolisaram melibiose, rafinose e estaquiose, indicando potencial para aplicações biotecnológicas.

Purificação e caracterização da VDAC de mitocôndrias corticais aviares: identificação de modificações pós-traducionais nas porinas neuronais murinas e aviares

A VDAC é uma porina presente na MME cuja função é crucial no metabolismo energético, sobrevivência e morte celular. A caracterização da VDAC torna-se importante para a compreensão das inter-relações da mitocôndria com os diferentes componentes citosólicos, tais como a HK. A ligação HK-VDAC favorece a utilização do ATP intramitocondrial em células neuronais, a HK cerebral pode interagir de formas diferentes com a VDAC, o que resulta em diferentes sítios de ligação (sítios A e B). Os variados papéis metabólicos das isoformas da VDAC podem ser explicados pela presença de alterações pós-traducionais. No presente trabalho purificamos a VDAC1 mitocondrial neuronal proveniente de cérebro aviar. Paralelamente, comprovamos que a presença de múltiplas formas das VDACs 1 e 2 em cérebros murino e aviar, seja devida à presença de modificações pós-traducionais, nomeadamente a fosforilação. A proteína isolada apresentou peso molecular de 30KDa. Quando submetida à eletroforese e posteriormente à coloração para a identificação de fosfoproteínas, a mesma mostrou-se desfosforilada. O conhecimento da presença, ou ausência de fosforilação das VDACs, reside na importância de estabelecer-se as bases moleculares ligadas à existência de sítios A e B nas mitocôndrias neuronais.

Produção e purificação de imunoglobulinas Y policlonais anti-Leptospira spp.

Objetivou-se verificar se galinhas imunizadas com uma solução de Leptospira interrogans inativadas e proteínas de membrana externa do sorovar Hardjo, poderiam produzir anticorpos policlonais específicos anti-leptospiras, detectáveis em testes ELISA. Foram imunizados oito galinhas com 25 semanas de idade, da raça White Leghorn, sendo três imunizadas com uma suspensão de leptospiras inativadas, três com uma solução de proteínas de membrana externa extraída do sorovar Hardjo e duas controle. Coletas de sangue foram realizadas quinzenalmente e de ovos diariamente. A IgY foi purificada a partir da gema dos ovos utilizando para a delipidação o método de diluição em água ácida e a precipitação com sulfato de amônio. Nos testes ELISA realizados para verificar a especificidade da IgY, foi demonstrada a produção de anticorpos anti-Leptospira, tanto no soro quanto nas gemas purificadas. O pico de produção de anticorpos específicos ocorreu na 5º semana após a primeira imunização. Ficou demonstrada a possibilidade da indução da produção de anticorpos específicos em galinhas imunizadas com leptospiras do sorovar Hardjo inativadas, bem como, com proteínas de membrana externa (PME) extraidas desse sorovar. As galinhas imunizadas com uma suspensão de leptospiras inativadas ou com PME de Leptospira interrogans do sorovar Hardjo produziram anticorpos reativos a PME Hardjo detectáves por teste ELISA.

Produção e purificação parcial de PPD-maleína para diagnóstico do mormo em equídeos

Objetivou-se com este estudo produzir e purificar parcialmente a PPD-maleína a partir de amostras de Burkholderia mallei isoladas de equídeos no Brasil com potencial para uso no diagnóstico do mormo. As linhagens de B. mallei fenotipicamente caracterizadas e de virulência comprovada foram inoculadas em caldo Dorset-Henley para crescer e metabolizar. Em seguida, as proteínas foram separadas por precipitação com ácido tricloroacético e precipitadas com sulfato de amônia. As PPDs-maleínas foram concentradas em 1,0mg/mL e na avaliação realizada em cobaios foi eficaz no desenvolvimento da hipersensibilidade do tipo tardia e consequentemente na identificação de animais verdadeiro positivos e exclusão dos verdadeiro negativos, sendo uma possibilidade em potencial para utilização no diagnóstico do mormo.

Purificação e caracterização parcial de uma lectina da alga marinha vermelha Vidalia obtusiloba C. Agardh

A lectina da alga marinha vermelha Vidalia obtusiloba foi purificada através da combinação de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose e cromatografia de afinidade em goma de guar reticulada. A lectina preferencialmente aglutinou eritrócitos do grupo humano O, nativos e tratados com bromelaina. A atividade hemaglutinante revelou que a lectina era dependente de cátions divalentes (Ca++ ou Mn++) e inibida por N-acetil-galactosamina, D-galactosamina, alfa-lactose and D-galactose e pela glicoproteína mucina de estômago de porco. A massa molecular da lectina, estimada por filtração em gel, foi de 78,9 kDa, enquanto por SDS-PAGE, em presença de beta-mercaptoetanol, a lectina exibiu duas subunidades protéicas diferentes com Mr de 59,6 e 15,2 kDa, sugerindo que a lectina é uma proteína dimérica. Focalização isoelétrica revelou a presença de uma proteína ácida simples, com um ponto isoelétrico entre 4 e 5. A lectina purificada exibiu um conteúdo de carboidrato de 43,2% e uma predominância dos aminoácidos Asp/Asn, Glu/Gln e Leu. A energia de ativação (deltaG') para a desnaturação da lectina foi calculada como sendo 25,4 kcalm.mol-1 a 90 ºC. Ensaios imunoquímicos usando um anti-soro de coelho produzido contra a lectina purificada de V. obtusiloba mostraram que foi possível detectar a presença da lectina em diferentes etapas do processo de purificação. Western blotting de géis de SDS-PAGE mostraram imunocoramento apenas da maior das subunidades da lectina.

Purificação de três diferentes beta-galactosidades microbianas por partição em sistemas de duas fases aquosas

Este trabalho tratou da investigação do efeito do peso molecular de polietilenoglicol (PEG) sobre a partição de enzimas beta-galactosidases de diferentes origens microbianas: Escherichia coli, Klueveromyces lactis e Aspergillus orizae em sistemas de duas fases aquosas (SDFA).Foi observado que os melhores sistemas para purificação da enzima de E. coli foram os formados por PEG 4000, 6000 e 8000/fosfato, fornecendo os mais elevados fatores de purificação da enzima. As enzimas de Klueveromyces lactis e Aspergillus orizae não foram eficientemente purificadas nestes sistemas sendo insensíveis à alterações do peso molecular do PEG. Portanto, um outro sistema de duas fases aquosas foi desenvolvido contendo um ligante específico, p-aminofenil 1-tio-beta-D-galactopiranosídeo (APGP), acoplado ao PEG para purificar a enzima de Klueveromyces lactis. Uma etapa simples de partição no SDFA formado por 6% APGP-PEG4000 + 12% dextrana T505.000 foi capaz de recuperar 83% da enzima na fase superior do sistema e de aumentar 1,6 vezes o fator de purificação.

DESENVOLVIMENTO E PROJETO DE UMA UNIDADE DE EXTRAÇÃO SUPERCRÍTICA PARA PURIFICAÇÃO DE ÓLEOS VEGETAIS

Este estudo investiga os diferentes arranjos de equipamentos para o desenvolvimento de uma unidade industrial para purificação de óleos vegetais utilizando extração com CO2 sob condições supercríticas. Objetivando a concepção de uma planta comercial a partir da unidade de laboratório o estudo deve iniciar-se através da determinação de alguns parâmetros experimentais e um estudo energético do processo. Em trabalho anterior foram definidas as condições ótimas (T, P) para purificação de óleos vegetais por CO2 supercrítico [7]. A etapa de otimização energética envolve um número máximo de variações possíveis nas condições de operação, visando fornecer dados adequados para a definição do rendimento e qualidade do produto, assim como do tempo de extração. A representação do processo nos diagramas de estado do solvente são muito úteis para a determinação das propriedades termodinâmicas em cada estágio do processo. Os diagramas Temperatura-Entropia (TxS) são particularmente apropriados para determinação da energia requerida ou removida no processo reversível. Com a determinação das condições de operação e do tempo para cada etapa individual é possível plotar a variação da pressão e da temperatura versus tempo, assim como definir e dimensionar os equipamentos necessários para o processo de extração supercrítica.

PURIFICAÇÃO DE ÓLEOS VEGETAIS POR EXTRAÇÃO COM CO2 SUPERCRÍTICO

Este estudo constatou a possibilidade de extrairem-se ácidos graxos livres de óleos vegetais com CO2 supercrítico. Utilizou-se neste trabalho óleos de soja e de castanha do Pará. A pesquisa desenvolveu-se em duas etapas, inicialmente investigou-se a possibilidade de se extrairem os ácidos graxos destes óleos em condições de extração que variaram de 50-140 bar e de 40-80oC durante 40-160 minutos. Concluiu-se que é possível realizar a desacidificação de óleos vegetais. A eficiência da extração foi de aproximadamente 30% a 140 bar e 80oC para ambos os óleos. Após esta primeira etapa, o próximo passo foi a tentativa de obter-se um aumento na eficiência do processo promovendo a pré-degomagem nos óleos brutos como uma etapa anterior ao processo de desacidificação com CO2 supercrítico. A degomagem foi realizada através de dois métodos diferentes, um para extrair as gomas hidratáveis e outro para extrair tanto as hidratáveis como as não-hidratáveis. Os resultados experimentais foram obtidos a 140 bar e 80oC durante 40-160 minutos, mostrando que a pré-degomagem é realmente necessária, pois a eficiência da extração aumentou para 57% para o óleo de soja e 42% para o de castanha do Pará totalmente degomados, sendo que o método escolhido deve extrair tanto as gomas hidratáveis como as não-hidratáveis. Finalmente, utilizou-se cossolvente (etanol a 1-5% do peso do óleo) para auxiliar a extração, observando-se um aumento na eficiência para aproximadamente 65% para o óleo de soja e 56% para o de castanha do Pará totalmente degomados a 140 bar e 80oC por 40-160 minutos.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE COM CORANTE RED A versus TROCA IÔNICA-PERMEABILIDADE EM GEL: COMPARAÇÃO DA PRATICIDADE NA PURIFICAÇÃO DE ENTEROTOXINA ESTAFILOCÓCICA A

O presente trabalho compara processos de purificação de enterotoxina estafilocócica A, utilizando cromatografia de afinidade com corante Red A em relação a troca iônica (SP - Sephadex C-25) - permeabilidade em gel (Sephadex G-75). Aplicou-se nas colunas o sobrenadante da cultura de Staphylococcus aureus 722 em caldo contendo 3% de triptona e suplementado com 1% de extrato de levedura, previamente concentradas com Amberlite CG-50. O processo capturou rapidamente a EEA, porém a proporção de 15 mg de resina para 150 mg de toxina causou saturação, recuperando apenas 10 a 30% de toxina do sobrenadante. A cromatografia de afinidade com Red A permitiu a recuperação de 60,87% de toxina aplicada em 76 horas, em relação a 114 horas requeridas para purificação utilizando coluna de troca iônica e permeabilidade em gel, com rendimento de 6,5%. O perfil eletroforético das amostras purificadas indicaram que, a toxina obtida da coluna Red A apresentou teor de pureza superior, na ordem de 90%, em relação a 60% atingida pelo método clássico.