Over expression of AdeABC and AcrAB-TolC efflux systems confers tigecycline resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae

Abstract: INTRODUCTION: Due to the wide use of tigecycline in the treatment of severe infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacteria, clinical resistance to tigecycline has increased in recent years. Here, we investigated the relationship between tigecycline resistance and the expression of efflux pumps. METHODS: Clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae were consecutively collected from hospitalized patients in three hospitals. The minimum inhibitory concentration (MIC) of tigecycline was determined using the broth microdilution method. Expression levels of efflux pump genes and regulators were examined by quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction. The correlations between tigecycline MICs and gene expression levels were analyzed. RESULTS: Overall, 1,026 A. baumannii and 725 K. pneumoniae strains were collected. Most strains were isolated from sputum. The tigecycline resistance rate was 13.4% in A. baumannii isolates and 6.5% in K. pneumoniae isolates. Overexpression of AdeABC and AcrAB-TolC efflux systems was observed found in clinical tigecycline-resistant isolates. The tigecycline MIC had a linear relationship with the adeB expression level in A. baumannii isolates, but not with the acrB expression level in K. pneumoniae isolates. There were significant linear trends in the overexpression of ramA as the tigecycline MIC increased in K. pneumoniae isolates. CONCLUSIONS: Tigecycline resistance in A. baumannii and K. pneumoniae was strongly associated with the overexpression of efflux systems. More studies are needed to elucidate whether there are other regulators that affect the expression of adeB in A. baumannii and how ramA affects the expression of acrB in K. pneumoniae.

Secular trends in Klebsiella pneumoniae isolated in a tertiary-care hospital: increasing prevalence and accelerated decline in antimicrobial susceptibility

Abstract: INTRODUCTION Klebsiella pneumoniae has become an increasingly important etiologic agent of nosocomial infections in recent years. This is mainly due to the expression of virulence factors and development of resistance to several antimicrobial drugs. METHODS This retrospective study examines data obtained from the microbiology laboratory of a Brazilian tertiary-care hospital. To assess temporal trends in prevalence and antimicrobial susceptibility, K. pneumoniae isolates were analyzed from 2000 to 2013. The relative frequencies of K. pneumoniae isolation were calculated among all Gram-negative bacilli isolated in each period analyzed. Susceptibility tests were performed using automated systems. RESULTS: From 2000-2006, K. pneumonia isolates comprised 10.7% of isolated Gram-negative bacilli (455/4260). From 2007-2013, this percentage was 18.1% (965/5331). Strictly considering isolates from bloodstream infections, the relative annual prevalence of K. pneumoniae increased from 14-17% to 27-32% during the same periods. A progressive decrease in K. pneumoniae susceptibility to all antimicrobial agents assessed was detected. Partial resistance was also observed to antimicrobial drugs that have been used more recently, such as colistin and tigecycline. CONCLUSIONS Our study indicates that K. pneumoniae has become a major pathogen among hospitalized patients and confirms its recent trend of increasing antimicrobial resistance.

A determinação da uréia em fertilizantes, pelo método volumétrico da urease

A presença de uréia nas misturas de fertilizantes é, atualmente, muito comum em virtude do citado material apresentar elevado teor de nitrogênio (46% de N, aproximadamente), ao lado de outras características físico-químicas desejáveis. O presente trabalho relata a determinação da uréia em mistura de fertilizantes pelo método da urease. A uréia do extrato aquoso do fertilizante é convertida em amônia através da urease. A amônia é neutralizada por uma quantidade conhecida e em excesso de ácido sulfúrico. O excesso de ácido sulfúrico é determinado e a quantidade de uréia é calculada através do conhecimento do numero de equivalentes de ácido sulfúrico neutralizado pela amônia. A aplicação do método da urease em 4 misturas de fertilizantes contendo nitrogênio amoniacal, nitrogênio nítrico, superfosfato e quantidades variáveis de uréia, evidenciou que o método em aprêço apresenta precisão e exatidão razoáveis, além de ser muito mais rápido do que os demais métodos.

Estudo de Klebsiella e seu envolvimento em diarréia infantil: uma avaliação

Foi investigado o possível papel da Klebsiella na patologia da infecção intestinal. De um total de 230 amostras isoladas durante o período de 1979 e 1980 provenientes de diferentes hospitais na Cidade do Rio de Janeiro, 91,0% foram identificados como Klebsiella pneumoniae e 9,0% como Klebsiella ozaenae. Em aproximadamente 10,0% dos casos das amostras Kleibsiella foram encontradas em associação a potogênicos intestinais definidos, pertencentes a outros gêneros. Os exames parasitológicos feitos paralelamente em 43 pacientes revelaram helmintos e/ou protozoários em 14,0% das amostras. Foi também investigado o significado patogênico de outros mecanismos, excluindo cápsulas. Em 1987 amostras foi pesquisada enterotoxina termo estável mas, somente dois casos revelaram resultados duvidosos, sendo sem significado nas demais amostras. A enterotoxina termo lábil foi investigada em 110 amostras, com nenhum resultado positivo. Finalmente, o fator de colonização CFA/1 não foi encontrado nas 21 amostras testadas.

Biotipagem e resistotipagem para o traçado epidemiológico da origem fecal de Klebsiella pneumoniae em infecções urinárias

Em 24 (82,7%) de 29 pacientes com infecção urinária por Klebsiella pneumoniae isolamos a mesma espécie a partir de amostras fecais. Estudamos 24 cepas urinárias e 219 cepas fecais encontrando 50 biótipos distintos (em média quatro biótipos por amostra fecal). Em dez (34,4%) dos 29 pacientes o biótipo de uma ou mais cepas fecais corresponderam ao biotipo da cepa urinária - sem encontrarmos associação entre a simultaneidade e a prévia cateterização vesical (p>0,05). Na resistotipagem - utilizando quatro substâncias químicas previamente escolhidas entre 34 produtos testados (verde brilhante, verde malaquita, telurito de potássio e cloreto mercúrico) encontramos 16 resistotipos distintos. Em 14 (58,3%), dos 24 casos houve detecção do mesmo resistotipo em cepa(s) fecal(is) e urinária do mesmo paciente, entretanto, só em cinco (20,9%) dos casos houve concordância com a biotipagem na indicação de simultaneidade. A concordância de resultados quanto à ausência ou presença de biotipos ou resistotipos simultâneos, na urina e nas fezes, foi de somente 54,2%. A presença de resistência aos íons telurito e mercúrio, entre cepas fecais e cepas urinárias, no mesmo paciente, estava significativamente associada (p<0,001).

Evidences of gentamicin resistance amplification in Klebsiella pneumoniae isolated from faeces of hospitalized newborns

The intestinal microbiota, a barrier to the establishment of pathogenic bacteria, is also an important reservoir of opportunistic pathogens. It plays a key role in the process of resistance-genes dissemination, commonly carried by specialized genetic elements, like plasmids, phages, and conjugative transposons. We obtained from strains of enterobacteria, isolated from faeces of newborns in a university hospital nursery, indication of phenothypical gentamicin resistance amplification (frequencies of 10-3 to 10-5, compatible with transposition frequencies). Southern blotting assays showed strong hybridization signals for both plasmidial and chromossomal regions in DNA extracted from variants selected at high gentamicin concentrations, using as a probe a labeled cloned insert containing aminoglycoside modifying enzyme (AME) gene sequence originated from a plasmid of a Klebsiella pneumoniae strain previously isolated in the same hospital. Further, we found indications of inactivation to other resistance genes in variants selected under similar conditions, as well as, indications of co-amplification of other AME markers (amikacin). Since the intestinal environment is a scenario of selective processes due to the therapeutic and prophylactic use of antimicrobial agents, the processes of amplification of low level antimicrobial resistance (not usually detected or sought by common methods used for antibiotic resistance surveillance) might compromise the effectiveness of antibiotic chemotherapy.

Clinical outcome and risk factors related to extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella spp. infection among hospitalized patients

Over the past two decades, nosocomial infections caused by extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella spp. have become a major problem all around the world. This situation is of concern because there are limited antimicrobial options to treat patients infected with these pathogens, and also because this kind of resistance can spread to a wide variety of Gram-negative bacilli. Our objectives wereto evaluate among in-patients at a publicuniversity tertiary-care hospital with documented infection due to Klebsiella spp., which were the risk factors (cross-sectional analysis) and the clinical impact (prospective cohort) associated with an ESBL-producing strain. Study subjects were all patients admitted at the study hospital between April 2002 and October 2003, with a clinically and microbiologically confirmed infection caused by Klebsiella spp. at any body site, except infections restricted to the urinary tract. Of the 104 patients studied, 47 were infected with an ESBL-producing strain and 57 with a non-ESBL-producing strain. Independent risk factors associated with infection with an ESBL-producing strain were young age, exposure to mechanical ventilation, central venous catheter, use of any antimicrobial agent, and particularly use of a 4th generation cephalosporin or a quinolone. Length of stay was significant longer for patients infected with ESBL-producing strains than for those infected with non-ESBL-producing strains, although fatality rate was not significantly affected by ESBL-production in this cohort. In fact, mechanical ventilation and bacteremia were the only variables withindependent association withdeath detected in this investigation.

blaCTX-M-2 and blaCTX-M-28 extended-spectrum β-lactamase genes and class 1 integrons in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae from Brazil

Twenty-eight Klebsiella pneumoniae clinical isolates that exhibited an extended-spectrum cephalosporin-resistance profile from a city in the Northeast of Brazil were analysed by PCR and DNA sequencing in order to determine the occurrence of blaCTX-M genes and class 1 integrons. We determined the occurrence of the blaCTX-M-2 gene in six K. pneumoniae isolates and describe the first detection of the blaCTX-M-28 gene in South America. Seven isolates carried class 1 integrons. Partial sequencing analysis of the 5'-3'CS variable region in the class 1 integrons of three isolates revealed the presence of aadA1, blaOXA-2 and dfr22 gene cassettes.

Outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae: two-year epidemiologic follow-up in a tertiary hospital

This study describes a carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) outbreak that occurred from October 2008-December 2010. Polymerase chain reaction assays were performed to detect the blaKPC gene and molecular typing was performed using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). There were 33 CRKP infections; PFGE revealed five genotypes: genotype A in five (15%), B in 18 (55%), C in eight (24%) and two unique profiles. Genotype B was disseminated in all hospital units and belonged to the same clone identified in 11 different hospitals in the state of São Paulo. Sixteen (48%) patients died. Seven isolates (21%) were resistant to polymyxin B and 45% were resistant to tigecycline and amikacin.

Whole genome sequence of Klebsiella pneumoniae U25, a hypermucoviscous, multidrug resistant, biofilm producing isolate from India

Klebsiella pneumoniae U25 is a multidrug resistant strain isolated from a tertiary care hospital in Chennai, India. Here, we report the complete annotated genome sequence of strain U25 obtained using PacBio RSII. This is the first report of the whole genome of K. pneumoniaespecies from Chennai. It consists of a single circular chromosome of size 5,491,870-bp and two plasmids of size 211,813 and 172,619-bp. The genes associated with multidrug resistance were identified. The chromosome of U25 was found to have eight antibiotic resistant genes [blaOXA-1,blaSHV-28, aac(6’)1b-cr,catB3, oqxAB, dfrA1]. The plasmid pMGRU25-001 was found to have only one resistant gene (catA1) while plasmid pMGRU25-002 had 20 resistant genes [strAB, aadA1,aac(6’)-Ib, aac(3)-IId,sul1,2, blaTEM-1A,1B,blaOXA-9, blaCTX-M-15,blaSHV-11, cmlA1, erm(B),mph(A)]. A mutation in the porin OmpK36 was identified which is likely to be associated with the intermediate resistance to carbapenems in the absence of carbapenemase genes. U25 is one of the few K. pneumoniaestrains to harbour clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) systems. Two CRISPR arrays corresponding to Cas3 family helicase were identified in the genome. When compared to K. pneumoniaeNTUHK2044, a transposase gene InsH of IS5-13 was found inserted.

Atividade da urease em latossolos sob influência da cobertura vegetal e da época de amostragem

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do tipo de vegetação e da época de amostragem na atividade da urease em dois diferentes solos tropicais. O experimento foi instalado em Latossolo Vermelho Aluminoférrico típico e Latossolo Vermelho distrófico típico sob cinco diferentes culturas: pinus, eucalipto, citrus, soja e milho. As amostragens de solo foram efetuadas mensalmente, de abril de 1990 a março de 1991, determinando-se a atividade da urease, o N-total e o C-orgânico. A atividade da urease variou de acordo com a época de amostragem, apresentando valores mais elevados nos meses mais quentes e úmidos. A cobertura vegetal influenciou a conversão de N-uréia a N-NH4, observando-se maior atividade da urease nas amostras de solo sob pinus e eucalipto, embora, no início do ciclo das culturas da soja e do milho, a atividade da urease também tenha sido elevada.

Atividade de urease no solo com feijoeiro influenciada pela cobertura vegetal e sistemas de plantio

A urease é a enzima que catalisa a hidrólise da ureia em dióxido de carbono e amônia. A distribuição da urease e os fatores que a influenciam têm importância relevante em vista do uso da ureia na agricultura. Nesse sentido, este estudo teve como objetivo definir a época adequada de coleta de solo, após adubação nitrogenada no feijoeiro comum, para medir a atividade de urease e seu perfil, considerando os efeitos residuais de diferentes plantas de cobertura e de sistema de preparo do solo. O experimento foi instalado em um Latossolo Vermelho distrófico e o feijoeiro, cultivar BRS Valente, semeado em junho de 2005, em sucessão a quatro plantas de cobertura de solo: capim-mombaça, milho em consórcio com braquiária, sorgo granífero e estilosantes, e dois sistemas de cultivo, direto e convencional. O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso em parcelas divididas. As amostras de solo foram coletadas aos 3, 6, 8, 10 e 12 dias após a aplicação da ureia em cobertura no feijoeiro. A maior atividade de urease no solo ocorreu quando o feijoeiro foi cultivado após capim-mombaça, independentemente do preparo do solo e da época de sua avaliação. A mobilização do solo em cultivo no sistema plantio direto determinou menor atividade de urease, independentemente das espécies de cobertura e das épocas de sua avaliação. O pico de atividade de urease ocorreu entre o sétimo e o oitavo dia após a aplicação de ureia, independentemente das espécies de cobertura e do preparo do solo sob cultivo irrigado do feijoeiro comum.

Volatilização de amônia do solo após a aplicação de ureia convencional ou com inibidor de urease

Volatilização de NH3 é a principal reação que diminui a eficiência de utilização pelas plantas do N proveniente da ureia, quando ela é aplicada sobre a superfície do solo. A fim de minimizar essa perda, produtos têm sido misturados à ureia para inibir temporariamente a ação da urease. Este trabalho objetivou avaliar alternativas de aplicação de um fertilizante com inibidor de urease, visando a diminuir a volatilização de NH3 relativamente à ureia convencional, em algumas condições ambientais e de solo. Foram desenvolvidos quatro experimentos, todos em condições de laboratório, em 2007 e 2008, em Cambissolo Húmico. Os tratamentos variaram em cada estudo e incluíram combinações de níveis de pH do solo (natural; 5,5; 6,3; e 6,8), umidade do solo (5, 10 ou 20 % de água) e temperaturas ambientais (18 e 35 ºC), além de estados físicos (sólido ou líquido) e de métodos de aplicação dos fertilizantes (na superfície ou incorporado ao solo). As unidades experimentais foram constituídas por bandejas plásticas (23 x 51 x 17 cm) com 12 kg de solo, numa espessura de 15 cm, sobre as quais foram instaladas câmaras coletoras de NH3. A amônia volatilizada foi determinada em várias épocas, nos primeiros 28 dias após a aplicação dos fertilizantes. O pico de volatilização diária de NH3 ocorreu sempre na primeira semana depois da adição dos fertilizantes ao solo, e aconteceu dois a três dias mais tarde para a ureia com inibidor de urease, em relação à ureia convencional. A volatilização de NH3 nem sempre foi maior para a ureia convencional em comparação ao fertilizante contendo inibidor de urease, tampouco para o estado líquido em relação ao granulado. A volatilização de NH3 aumentou com a elevação do pH, da temperatura e da dose aplicada de N e foi menor nos extremos de umidade (solo com 5 % ou com 20 % de água). Para os fertilizantes aplicados sobre a superfície do solo, a taxa máxima de perda diária foi correspondente a 14 kg ha-1 de N, e a perda total acumulada variou de 2 a 50 % do N aplicado, dependendo principalmente do estado físico em que o fertilizante foi aplicado, da umidade do solo e da temperatura ambiente. A incorporação dos fertilizantes amídicos ao solo foi a maneira mais eficaz de minimizar as perdas de N por volatilização.