Comparação entre três escores embrionários como fator prognóstico do sucesso em fertilização in vitro

OBJETIVO: avaliar três sistemas de escore embrionário para embriões de 3º dia e correlacioná-los com resultados positivos da técnica de fertilização in vitro. MÉTODO: estudo retrospectivo desenvolvido pelo programa de fertilização in vitro do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP. Foram incluídas 137 pacientes submetidas a fertilização in vitro e transferência de 439 embriões. Os principais resultados avaliados foram taxa de gravidez e taxa de implantação. RESULTADOS: nos três métodos observou-se diferença significativa no escore embrionário entre o grupo de grávidas (n=53) e não grávidas (n=84) (p<0,0001). No escore 1, avaliando-se apenas o número de células, observou-se maior taxa de gravidez (70%) e taxa de implantação (42%) nas transferências de embriões com média dos blastômeros acima de 8. O escore 2, baseado num escore total de quatro pontos (clivagem, número de blastômeros, fragmentação e simetria), mostrou aumento nas taxas de gravidez (52,8%) e implantação (31%) nos escores acima de 2. No escore 3, baseado no número de células e no grau morfológico, também as taxas de gravidez e de implantação elevaram-se de acordo com o aumento do escore médio dos embriões transferidos. CONCLUSÃO: Os três sistemas de escore avaliados em embriões de 3º dia, correlacionaram-se positivamente com taxa de gravidez e taxa de implantação.

Avaliação da cavidade uterina com hístero-sonografia em pacientes com falha de implantação após fertilização in vitro

OBJETIVO: analisar a acurácia da hístero-sonografia (HSoG) na avaliação da cavidade uterina nas pacientes que tiveram falha de implantação na primeira tentativa de fertilização in vitro. MÉTODOS: foram analisadas prospectivamente, em estudo duplo-cego, pacientes previamente submetidas à transferência de pelo menos um embrião e que apresentaram falha de implantação. As pacientes foram submetidas a HSoG e em seguida a histeroscopia diagnóstica, realizadas por equipes diferentes, não havendo troca de informações sobre os resultados das mesmas. Os resultados foram agrupados e interpretados somente após o término da pesquisa. A HSoG foi realizada após cateterização do colo uterino por sonda uretral nº 8 e injeção de soro fisiológico. A interface anecóica proporcionada pela solução salina permite determinar as anormalidades, tais como pólipos uterinos ou miomas submucosos. A histeroscopia diagnóstica foi realizada com equipamento Karl Storz, óptica rígida de 4 mm a 30°, e distensão da cavidade uterina com soro fisiológico. Não utilizou-se anestesia local nem houve a necessidade de realizar dilatação cervical. RESULTADOS: foram estudadas 28 pacientes das 33 inicialmente selecionadas para o presente estudo. A HSoG diagnosticou anormalidades em 8 pacientes, sendo que em cinco pacientes foram encontrados pólipos endometriais (62,5%), pólipos endocervicais em duas pacientes (25,0%) e mioma submucoso em uma (12,5%). A histeroscopia (padrão-ouro) diagnosticou alterações em 7 pacientes, sendo que em duas pacientes (28,6%) foram encontrados pólipos endometriais, em outras duas pacientes (28,6%) pólipos cervicais e em uma paciente, mioma submucoso (14,2%). A HSoG, quando comparada com a histeroscopia diagnóstica, apresentou sensibilidade de 71,4%, especificidade de 85,7%, valor preditivo positivo de 62,5% e valor preditivo negativo de 90%. CONCLUSÕES: por apresentar valor preditivo positivo baixo, todas as vezes que a HSoG for anormal, sugerimos confirmar o exame pela histeroscopia diagnóstica. Pelo fato de a HSoG apresentar boa especificidade e bom valor preditivo negativo, poderíamos sugerir que diante de HSoG normal não há necessidade de indicação de se avaliar a cavidade uterina pela histeroscopia diagnóstica antes de realizar a fertilização in vitro. Concluímos que a histero-sonografia é bom método para rastreamento de lesões polipóides da cavidade uterina que possam responder pela falha de implantação nas técnicas de fertilização in vitro.

Viabilidade e fertilização in vitro de oócitos bovinos após vitrificação

OBJETIVOS: avaliar a técnica de criopreservação por vitrificação em DMSO 6 M para oócitos bovinos maturados in vitro e os efeitos do tempo de exposição às soluções de vitrificação (SV). MÉTODOS: estudo experimental tipo coorte. Ovários de bovinos foram obtidos em frigorífico e transportados ao laboratório. Os oócitos foram aspirados. A partir da SV contendo DMSO 6 M (SV 100%), foram preparadas soluções a 25 e 65%. Oócitos foram maturados in vitro por 18-22 horas. Para vitrificação, os oócitos foram colocados em SV 25%, por 5 minutos, transferidos à SV 65%, pipetados em SV 100% para palhetas e estocados em nitrogênio líquido. No primeiro grupo experimental, a exposição à SV 65% tomou até 60 segundos e no segundo grupo não ultrapassou 30 segundos. Para descongelamento, as palhetas foram expostas ao ar por 10 segundos, colocadas em banho-maria por 10 segundos e seu conteúdo expelido e mantido em solução de sacarose por 5 minutos. No terceiro grupo, os oócitos passaram por todas SV menos pelo nitrogênio líquido. Os oócitos recuperados foram inseminados. Para controle, oócitos frescos, maturados in vitro, foram inseminados. RESULTADOS: após vitrificação, foram recuperados 69,1 e 59,8% dos oócitos nos grupos de 30 segundos e 60 segundos, respectivamente, e 24 horas após inseminação pareceram morfologicamente normais 93 e 89,1% deles, respectivamente. No grupo de oócitos expostos às SV sem vitrificação, foram recuperados 75,6%, sendo 84,6% destes viáveis 24 horas após inseminação. Não ocorreu fertilização nos grupos experimentais. Entre os controles frescos, foram fertilizados 65,4% dos oócitos. CONCLUSÕES: a técnica de vitrificação utilizando DMSO 6 M não é aplicável para criopreservação de oócitos bovinos maturados in vitro. A redução do tempo de exposição às SV não superou o efeito deletério sobre a capacidade fertilizadora dos oócitos. Aprimoramentos da técnica são necessários para proteção da zona pelúcida e do oolema.

Resultados de fertilização in vitro em mulheres submetidas previamente à laqueadura tubária

OBJETIVOS: avaliar os efeitos da laqueadura tubária sobre os resultados de fertilização in vitro com transferência de embrião. MÉTODOS: estudo retrospectivo, no qual foram analisadas 98 mulheres submetidas a ciclos consecutivos de fertilização in vitro. Grupo LT, 55 mulheres com antecedente de laqueadura tubária bilateral, sem outros fatores de infertilidade associados, e grupo IM, 43 mulheres com infertilidade devido a fator masculino leve. As variáveis analisadas foram: idade, taxa de suspensão do ciclo de indução da ovulação, resposta à indução da ovulação (dias de indução, unidades de gonadotrofinas, número de folículos recrutados e oócitos captados), taxas de fertilização e de clivagem, número de embriões transferidos e gravidez clínica por ciclo de transferência. RESULTADOS: não houve diferença entre as taxas de suspensão de ciclo de indução da ovulação, as respostas à indução da ovulação, as taxas de fertilização e de clivagem, o número de embriões transferidos e as taxas de gravidez clínica por ciclo transferido, entre os grupos LT e IM. Considerando-se isoladamente a variável idade no grupo LT, evidenciou-se que pacientes com idade superior a 35 anos utilizaram mais unidades de gonadotrofinas (2445 versus 2122 UI), tiveram menor número de folículos recrutados (11,3 versus 15,8) e menos oócitos foram captados (6,1 versus 8,5), quando comparadas às mulheres com idade de 34 anos ou menos. CONCLUSÕES: a laqueadura tubária não interferiu nos resultados da fertilização in vitro. Observamos uma piora da resposta à indução da ovulação nas pacientes submetidas à laqueadura tubária com idade superior a 35 anos.

Gestação heterotópica: possibilidade diagnóstica após fertilização in vitro. A propósito de um caso

A gestação heterotópica, caracterizada pela presença de gestação tópica associada à ectópica, era até pouco tempo um evento raro, ocorrendo em 1:30.000 gestações. Com o advento das técnicas de reprodução assistida, essa incidência aumentou para 1:100-500 gestações. O seu diagnóstico precoce é difícil, sendo freqüentemente realizado quando já ocorreu a ruptura da tuba uterina. Apresentamos um caso de gestação heterotópica, diagnosticado frente ao quadro de abdome agudo hemorrágico, mas com boa evolução da gravidez tópica, resultando em nascimento de feto a termo. Aponta-se a importância de se lembrar esta complicação na avaliação de mulheres submetidas a fertilização in vitro, visando ao tratamento precoce.

A idade como fator prognóstico in vitro

OBJETIVO: avaliar a idade da paciente como fator indicador de resultados em um programa de fertilização in vitro. MÉTODOS: estudo transversal que incluiu 302 mulheres, com idade variando entre 24 e 46 anos, submetidas ao tratamento com fertilização in vitro (FIV), no período de Maio de 2005 a Julho de 2007. As pacientes foram divididas em três grupos, de acordo com a faixa etária: G<35 (n=161), G36-39 (n=89) e G>40 (n=52). Foram avaliados: número de oócitos aspirados, taxas de fertilização, número de embriões transferidos, qualidade embrionária e taxas de gravidez. A análise estatística foi realizada pela análise de variância de Kruskal-Wallis e pelo teste do χ2. RESULTADOS: no Grupo G<35, obteve-se a média de 8,8 oócitos por paciente; no Grupo G36-39, a média foi de 7,4 oócitos por paciente; e no Grupo G>40, 1,6 oócitos por paciente. O número de oócitos obtidos no Grupo G>40 foi significantemente menor que nos Grupos G<35 e G36-39 (p<0,001). As taxas de fertilização nos três grupos foram semelhantes: 61,4%, 65,8% e 64,6%, respectivamente (p=0,2288). O percentual de embriões de boa qualidade também não foi estatisticamente diferente entre os grupos estudados, encontrando-se, respectivamente, taxas de 57,4%, 63,2% e 56,0% (p=0,2254). O número médio de embriões transferidos em cada grupo foi de 3,1 (G<35), 2,8 (G36-39) e 1,5 (G>40), havendo redução estatisticamente significante no Grupo G>40 (p<0,001). Com relação às taxas de gravidez, o Grupo G>40 apresentou taxa de 9,6%, resultado significantemente inferior (p=0,0339) aos Grupos G<35 e G36-39 (26,1 e 27,0%, respectivamente), que não apresentaram diferenças significantes entre si. CONCLUSÕES: embora a qualidade embrionária, do ponto de vista morfológico, não seja diferente entre mulheres de diferentes faixas etárias, o número de oócitos coletados, o número de embriões transferidos e as taxas de gravidez confirmam que a idade da mulher é um importante fator preditivo das taxas de sucesso das técnicas de reprodução assistida e deve ser levada em consideração no momento da proposta desse tipo de tratamento para mulheres com mais de 40 anos.

Avaliação da aplicabilidade da técnica de maturação in vitro de oócitos humanos e posterior fertilização

OBJETIVO: avaliar a aplicabilidade da técnica de maturação in vitro de oócitos humanos e posterior fertilização. MÉTODOS: estudo prospectivo não randomizado descritivo realizado no período de novembro de 1999 a março de 2001 no qual foram incluídas 15 pacientes com infertilidade tubária e 20 ciclos de fertilização in vitro. Todas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes de iniciar o estudo. As pacientes tinham idade entre 18 e 32 anos incompletos, obstrução tubária como causa exclusiva de infertilidade e índice de massa corporal inferior a 25 kg/m². As pacientes receberam 300 UI de hormônio folículo estimulante (FSH) recombinante por via intramuscular no segundo dia do ciclo e doses adicionais de 150 UI no quarto e no sexto dia do ciclo. A coleta ovular foi realizada no sétimo dia do ciclo. Os oócitos foram colocados em meio TCM 199 acrescido de antibióticos, piruvato, FSH, gonadotrofina coriônica humana e soro (Serum Substitute Supplement - Irvine Scientific®). Após 48 h de cultivo, os oócitos que atingiram o estágio de metáfase II foram inseminados e os fertilizados foram transferidos. RESULTADOS: foram puncionados 144 folículos com a coleta de 67 oócitos imaturos (46,5%). Quarenta e três oócitos atingiram o estágio de metáfase II (64,2%) e foram inseminados. Destes, 30 fertilizaram e 25 embriões foram transferidos para 10 pacientes. Houve uma gravidez com nascimento de um bebê. CONCLUSÃO: concluiu-se que a técnica de maturar oócitos humanos in vitro previamente à fertilização in vitro é técnica exeqüível, capaz de gerar gravidez.

Gestações espontâneas após punção ovariana para maturação in vitro em mulheres com síndrome dos ovários policísticos

OBJETIVO: relatar três casos de gestações espontâneas em portadoras da síndrome dos ovários policísticos (SOP) que ocorreram nos meses subsequentes à realização de punção ovariana transvaginal para captação oocitária para a maturação in vitro. MÉTODOS: foram incluídas no estudo três pacientes inférteis portadoras de SOP submetidas à maturação in vitro dos oócitos sem estimulação ovariana prévia. Durante o procedimento da coleta dos oócitos, cada ovário foi perfurado de quatro a oito vezes. RESULTADO: nenhuma paciente engravidou com a técnica da maturação in vitro. Avaliando o seguimento dos casos, em sete meses após o procedimento, as três pacientes engravidaram sem o auxílio de técnicas de reprodução assistida, resultando em três nascimentos. CONCLUSÕES: as múltiplas perfurações nos ovários destas pacientes portadoras da SOP, durante o procedimento de coleta dos oócitos, podem ter contribuído para a obtenção da gestação nos meses subsequentes ao procedimento.

Avaliação do Tratamento Clínico da Endometriose

Objetivo: o objetivo do presente trabalho é apresentar um perfil das pacientes com endometriose, estadio e resultados do tratamento entre as pacientes atendidas no nosso Serviço. Métodos: foram revistos 155 prontuários médicos de pacientes portadoras de endometriose atendidas no período de 1991 a 1996 segundo um protocolo preestabelecido. Resultados: a média de idade das pacientes foi de 31 anos, sendo que a maioria era branca e com ciclos menstruais regulares. Os sintomas mais observados foram a dismenorréia, dor pélvica e infertilidade, sendo esses sinais e sintomas de grau leve na maioria dos casos. Os métodos diagnósticos utilizados foram a laparoscopia ou ultra-sonografia. Houve concordância entre a ultra-sonografia e a laparoscopia em 96% das vezes. Em 28% dos casos houve necessidade de realização de laparotomia para elucidação diagnóstica e/ou tratamento. O achado de endometrioma ocorreu em 37% das vezes e em apenas 74% das biópsias das lesões houve a confirmação de endometriose pelo estudo anatomopatológico. Houve melhora significativa com o tratamento clínico independente da droga utilizada, com melhora dos sintomas em cerca de 50% delas. Foram realizadas técnicas de fertilização assistida em 34 pacientes, das quais 80% foram fertilização in vitro (FIV), com taxa de 27% de gravidez/paciente. Conclusões: o método diagnóstico de escolha deve ser a laparoscopia, embora a ultra-sonografia apresente um alto índice de concordância. O estudo anatomopatológico das lesões deve ser utilizado como método auxiliar no diagnóstico, pois ele não é positivo em todos os casos. O tratamento clínico com reprodução assistida é uma boa opção terapêutica, principalmente com o uso de FIV.

Avaliação da Reserva Ovariana: Comparação entre a Dosagem do FSH Basal e o Teste do Clomifeno

Objetivo: avaliar a reserva ovariana por meio da dosagem do FSH no 3º dia do ciclo menstrual, comparando-o com o teste do clomifeno, e correlacionar os resultados com a resposta ovariana à hiperestimulação controlada com gonadotrofinas para a fertilização in vitro. Métodos: foram selecionadas 49 pacientes com idade superior a 30 anos que apresentavam quadro clínico de infertilidade há pelo menos 1 ano. Foi realizada avaliação da reserva ovariana destas pacientes pelo teste do citrato de clomifeno. Posteriormente, 26 das 49 pacientes foram submetidas à hiperestimulação ovariana controlada com gonadotrofinas. Destas 26 pacientes, 18 tiveram boa resposta à hiperestimulação ovariana e 8, má resposta. Foram calculadas as médias e os desvios-padrão referentes aos valores do FSH do 3º dia, do 10º dia e do somatório de ambos, no grupo das pacientes que responderam favoravelmente à estimulação ovariana. Posteriormente foi realizada a correlação dos valores obtidos com a resposta ovariana após a estimulação dos ovários com gonadotrofinas. Resultados: empregando-se a dosagem do FSH no 10º dia (média somada a 2 desvios-padrão) com valor >16,1 UI/mL para predizer a má resposta ovariana ao teste do clomifeno, observaram-se sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivo e negativo de 50, 100, 100 e 81,8%, respectivamente. Considerando-se o teste do clomifeno positivo quando o valor do somatório das dosagens do FSH do 3º e do 10º dia somado a dois desvios-padrão foi > 22,6 UI/mL, obtiveram-se sensibilidade de 62,5%, especificidade de 100%, valor preditivo positivo de 100% e valor preditivo negativo de 85,7% . O uso da dosagem única do FSH no 3º dia do ciclo acima de 10 UI/mL para predizer a má resposta ovariana mostrou sensibilidade de 87%, especificidade de 100%, valor preditivo positivo de 100% e valor preditivo negativo de 94,7%. Conclusão: no presente estudo, a dosagem única do FSH no 3º dia do ciclo apresentou maior sensibilidade quando comparada ao teste do clomifeno para a avaliação da reserva ovariana.

A taxa de gestação em mulheres submetidas a técnicas de reprodução assistida é menor a partir dos 30 anos

OBJETIVO: avaliar as taxas de gestação diagnosticada química (beta-HCG > 25 mUI/mL sérica obtida 14 dias após transferência embrionária) ou clinicamente (saco gestacional visualizado por ultra-sonografia quatro a seis semanas após transferência embrionária) e aborto em mulheres submetidas a fertilização in vitro (FIV) ou injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) em serviço terciário de reprodução assistida e correlacionar estas taxas com a idade. MÉTODOS: estudo transversal retrospectivo, com análise de 1016 ciclos de hiperestimulação ovariana controlada de 932 mulheres inférteis com indicação para FIV (370 ciclos) ou ICSI (646 ciclos). A idade das pacientes variou entre 22 e 46 anos. Todas as mulheres com idade superior a 35 anos incluídas no estudo apresentavam FSH<15 UI/L. Os ciclos estudados foram divididos em dois grupos: o primeiro incluindo os referentes às mulheres com 22 a 30 anos e o segundo grupo, com aquelas dos 31 aos 46 anos. As variáveis analisadas foram: taxas de gravidez (química ou clínica) e aborto. O teste do chi2 foi empregado para comparar estas taxas entre os grupos. RESULTADOS: a taxa total de gravidez foi 36,4%, com redução significativa a partir dos 30 anos (p=0,0001). Dos 22 aos 30 anos (303 ciclos) a taxa de gestação foi de 45,4%, enquanto que no grupo dos 31-46 anos (713 ciclos) foi de 25,1%. As taxas de aborto foram, respectivamente, 10,2 e 11,6% (p=0,6854). CONCLUSÃO: apesar de não ter ocorrido diferença na taxa de aborto entre os grupos, observamos redução significativa na taxa de gestação de mulheres inférteis submetidas a FIV ou ICSI a partir dos 30 anos. Assim, recomendamos aos ginecologistas que não posterguem a investigação e o encaminhamento para tratamento da infertilidade.

Limitações e controvérsias na determinação do valor preditivo de critérios de morfologia oocitária e embrionária

Com o objetivo de aumentar as taxas de sucesso das pacientes que são submetidas a técnicas de reprodução humana assistida (RHA), numerosos estudos apresentam como foco a identificação do embrião com maior potencial de implantação. Apesar dos avanços tecnológicos significativos da Medicina Reprodutiva baseados no advento da era da genômica, proteômica e metabolômica (OMICS), técnicas rotineiramente aplicáveis ainda não estão disponíveis. Dessa forma, laboratórios de fertilização in vitro(FIV) de todo o mundo selecionam para transferência embriões humanos cultivados in vitrobaseados em parâmetros morfológicos avaliados em microscopia de luz. Diversos parâmetros morfológicos podem ser avaliados desde o estágio pronuclear até o estágio de blastocisto para embriões humanos cultivados in vitro. De modo geral, independentemente do dia da transferência, tais critérios parecem apresentar valor preditivo de viabilidade embrionária quando avaliados individualmente ou coletivamente. No entanto, a subjetividade da avaliação morfológica, bem como a ampla diversidade de sistemas de classificação embrionária aplicados por diferentes clínicas, implica em resultados contraditórios, tornando extremamente difícil a implementação de um consenso do valor preditivo dos diferentes parâmetros morfológicos avaliados. A otimização da seleção embrionária representa um grande potencial de aumento das taxas de sucesso do tratamento, além de possibilitar a realização da transferência de um número reduzido de embriões, minimizando os riscos derivados de estações múltiplas.

Correlação entre os métodos de concepção, ocorrência e formas de tratamento das onfalopatias em bovinos: estudo retrospectivo

Alguns problemas têm sido observados nos bezerros produtos da técnica fertilização in vitro, dentre esses a elevada casuística de onfalopatias. A partir dessa observação, objetivou-se com este trabalho realizar um estudo retrospectivo da correlação entre os métodos de concepção e a ocorrência de onfalopatias em bovinos e descrever os resultados obtidos a partir dos tratamentos conservativo e cirúrgico. Foram utilizados 44 bovinos atendidos no Hospital Veterinário da Unesp, Campus de Araçatuba, com idade variando de um dia a 12 meses entre os anos de 2003 e 2007. Desses bovinos 27 eram provenientes de fertilização in vitro (FIV), 12 de inseminação artificial (IA), dois de monta natural (MN) e três de transferência de embriões (TE). O diagnóstico clínico-cirúrgico revelou que todos apresentavam afecções umbilicais, sendo 22 casos de persistência de úraco, oito de onfaloflebite, oito de hérnias umbilicais, cinco de onfalites e um de fibrose umbilical. Inicialmente e no pós-operatório administrou-se em todos os animais, uma vez ao dia, durante dez dias, 3mg/kg de ceftiofur sódico pela via intravenosa (IV). Nos casos de infecção grave ou irresponsiva a terapia antimicrobiana inicial, acrescentou-se 6,6mg/kg, durante sete dias de sulfato de gentamicina IV. A antissepsia do umbigo, com tintura de iodo a 2%, foi instituída duas vezes ao dia, nos casos tratados conservativamente, enquanto que os bovinos submetidos à cirurgia receberam 1,1mg/kg de flunixin meglumine IV, uma vez ao dia, por cinco dias consecutivos. Dos 22 animais diagnosticados com persistência de úraco, 10 apresentavam drenagem de urina pelo umbigo e receberam 2mL de tintura de iodo 10% no interior do úraco, sendo 15 tratados com a excisão cirúrgica, especialmente, devido à formação de divertículo vésico-uracal. Todos os animais que apresentavam onfaloflebite e hérnia umbilical foram submetidos à cirurgia. Já dos cinco casos de onfalite, três foram tratados conservativamente. A análise dos diferentes métodos de concepção, correlacionados à ocorrência de onfalopatias, sugere que os animais provenientes de FIV, apresentam maior frequência de persistência de úraco (66,7%), e aqueles concebidos por IA, maior frequência de hérnia umbilical (58,4%), O tratamento cirúrgico foi mais eficiente que a terapia conservativa. Essa última apresentou melhores resultados nos casos descomplicados e precocemente diagnosticados.

Viabilidade "in vitro" de grãos de pólen de bacurizeiro - Clusiaceae

O bacurizeiro (Platonia insignis Mart.) é uma frutífera nativa da Amazônia, que apresenta alogamia acentuada e autoincompatibilidade esporofítica. A viabilidade in vitro tem sido utilizada para representar a capacidade potencial do pólen em completar o processo de fertilização O objetivo do presente trabalho foi estudar a viabilidade de polens de bacurizeiro por meio da germinação in vitro , por ser esta uma técnica em que o comportamento germinativo é semelhante in vivo . Os ensaios foram conduzidos em laboratório, em um delineamento inteiramente casualizado, analisados em esquema fatorial 2 x 3 x 4, em que: 2=formas de propagação (pé-franco e enxertada); 3=estágios da antese (pré-antese, antese e pós-antese), e 4=concentrações de sacarose (0; 7,5; 10 e 20%), com 10 repetições. Houve diferença significativa na germinação do pólen, sendo que, via polinização manual, o pólen deve ser coletado na antese, enquanto o melhor meio para a germinação in vitro é com 7,5 g de sacarose.