Transformação genética de laranja 'Valência' com o gene cecropin MB39

O objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de laranja 'Valência' com o gene cecropin MB39 controlado pelo promotor do gene da fenilalanina-amônia-liase de citros, visando a expressão gênica específica nos vasos do xilema. A transformação genética foi realizada via Agrobacterium tumefaciens por meio do co-cultivo de segmentos de epicótilo. Onze plantas transgênicas foram identificadas por PCR, pela amplificação do fragmento esperado de 189 pb, as quais foram aclimatizadas em casa de vegetação. A integração do transgene foi confirmada em três plantas pela análise de transferência de Southern.

Etileno e peróxido de hidrogênio na formação de aerênquima em milho tolerante a alagamento intermitente

Resumo:O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do etileno e do peróxido de hidrogênio (H2O2) na formação do aerênquima em ciclos de seleção genética da cultivar de milho BRS 4154, sob alagamento. Plantas dos ciclos C1 e C18 foram submetidas a alagamento por 7 dias, com coleta das raízes aos 0 (controle, sem alagamento), 1 e 7 dias. Foram analisados: a expressão gênica das enzimas ACC sintase (ACS), ACC oxidase (ACO), dismutase do superóxido (SOD) e peroxidase do ascorbato (APX); a produção de etileno e o conteúdo de H2O2; a atividade da enzima ACO; e a proporção de aerênquima no córtex. Não houve expressão de ACS e ACO. Houve variação na atividade de ACO e na produção de etileno. A expressão da SOD foi maior em plantas C1 e a da APX, em C18, com redução aos 7 dias. O conteúdo de H2O2 não diferiu entre os tratamentos. A proporção de aerênquima aumentou com o tempo, tendo sido maior em plantas C18 e relacionada à taxa de formação do aerênquima. O tempo de alagamento e o nível de tolerância do ciclo de seleção influenciam a produção do etileno. A expressão da APX indica maior produção de H2O2 no início do alagamento.

Carcinoma de mama: novos conceitos na classificação

O carcinoma de mama é a neoplasia maligna mais comum em mulheres. Estudos moleculares do carcinoma de mama, baseados na identificação do perfil de expressão gênica por meio do cDNA microarray, permitiram definir pelo menos cinco sub-grupos distintos: luminal A, luminal B, superexpressão do HER2, basal e normal breast-like. A técnica de tissue microarray (TMA), descrita pela primeira vez em 1998, permitiu estudar, em várias amostras de carcinoma, os perfis de expressão protéica de diferentes neoplasias. No carcinoma de mama, os TMAs têm sido utilizados para validar os achados dos estudos preliminares, identificando, desta forma, os novos subtipos fenotípicos do carcinoma de mama. Dentre os subtipos classicamente descritos, o grupo basal constitui um dos mais intrigantes subtipos tumorais e é freqüentemente associado com pior prognóstico e ausência de alvos terapêuticos definidos. A classificação histopatológica do carcinoma de mama tem pobre valor preditivo. Portanto, a associação entre o diagnóstico histológico com técnicas moleculares nos laboratórios de anatomia patológica, por meio do estudo imunoistoquímico, pode determinar o perfil molecular do carcinoma de mama, buscando melhorar a resposta terapêutica. Este estudo visou resumir os mais recentes conhecimentos em que se baseiam os novos conceitos da classificação do carcinoma de mama.

Produção de progesterona in vitro pelas células do corpo lúteo bovino ao longo da gestação

O presente trabalho foi desenvolvido para testar a hipótese de que células luteínicas bovinas em cultivo, provenientes dos três terços de gestação, comportam-se da mesma maneira que células in vivo em relação à produção de P4. Foram coletadas amostras de corpos lúteos (CL) de 90 (n=3), 150 (n=3) e 210 (n=3) dias de gestação obtidos em abatedouro. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 poços. Após 24 horas de cultivo foram feitas a lavagem dos poços e a adição do precursor pregnenolona. Os tratamentos foram realizados em octuplicata para cada tempo de tratamento (24, 48 e 96 horas) com três repetições de cada período gestacional. As amostras de meio de cultura e as células foram coletadas 24, 48 e 96 horas após adição do precursor e acondicionadas em freezer a -20ºC até o processamento. A progesterona foi dosada através de radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os resultados foram analisados estatisticamente e considerados diferentes quando p<0.05. Foi observada maior produção de P4 aos 90 dias de gestação (35,277±0,075), posterior decréscimo aos 150 dias (28,820±0,231) e novo aumento aos 210 dias (32,777±0,099). A produção de P4 em células cultivadas por 24 horas foi maior (p<0,05) em células oriundas do grupo de 90 dias (2,912±0,047) quando comparado a 150 (2,669±0,137) e 210 dias (2,741±0,088). As 48 e 96 horas de cultivo, células luteínicas bovinas de 90 dias produziram mais P4 que células de 210 dias (2,934±0,029 e 2,976±0,121 respectivamente x 2,760±0,059 e 2,695±0,149, respectivamente; p<0,05), que por sua vez produziram mais do que células de 150 dias (2,334±0,084 para 48 horas e 2,205±0,136 para 96 horas). Aos 150 dias de gestação a produção de progesterona apresentou diminuição gradativa ao longo das 96 horas de cultivo. Essas diferenças podem ser explicadas pela expressão gênica diferencial de enzimas ou também de fatores presentes na cascata esteroidogênica de acordo com a idade gestacional. Este modelo de cultura celular luteínica poderá ser utilizado em estudos funcionais uma vez que o padrão de secreção de P4 mimetizou o que ocorre in vivo.

Seleção, caracterização e clonagem dos genes fljB e groEL agonistas dos receptores de reconhecimento de padrão do sistema imune inato das aves

A produção recombinante de agonistas dos receptores do reconhecimento de padrão do sistema imune inato tem fornecido uma nova ferramenta para a produção de imunoestimulantes para animais. O padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), flagelina, codificado pelo gene fljB de Salmonella Typhimurium e o padrão molecular associado ao dano (DAMP) HSP60, codificado pelo gene groEL da S. Typhimurium e S. Enteritidis, são reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrões (RRPs) do sistema imune inato das aves. No presente estudo, foi feita a clonagem de fragmentos genéticos dos genes fljB de S. Typhimurium e groEL de S. Typhimurium e S. Enteritidis inseridos no vetor de expressão pET100/D-TOPO e transformados em células de E. coli TOP10. Os clones foram avaliados pela PCR de colônia, PCR de DNA plasmidial e sequenciamento genômico para a confirmação da presença desses genes. Na PCR de colônia, foram identificadas em 80%, 60% e 80% das colônias transformadas, a presença dos genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) e fljB (S. Typhimurium) respectivamente. O sistema de clonagem adotado possibilitou a produção de clones dos fragmentos genéticos da HSP60 e flagelina das cepas de Salmonella, permitindo a utilização posterior desses clones em ensaios de expressão gênica, com potencial futuro de serem utilizados como imunoestimulante inespecífico das aves.

Identificação do estádio adequado para realização de análises isoenzimáticas na caracterização de cultivares de arroz

Os sistemas enzimáticos comumente utilizados na caracterização de cultivares são produtos da expressão gênica, e, portanto, altamente influenciados pelo estádio de desenvolvimento da plântula, pelo tecido vegetal e pelo ambiente. Esses fatores normalmente não são considerados no momento de realizar uma análise conjunta de vários sistemas enzimáticos para uma determinada espécie, decorrendo assim numa inadequada e ineficiente leitura e interpretação dos resultados. No presente trabalho objetivou-se determinar o momento adequado no qual cada sistema enzimático apresenta máxima expressão fenotípica para ser utilizado na caracterização isoenzimática de cultivares de arroz. Dois lotes, um de alta e um de baixa qualidade fisiológica, para cada uma das variedades de arroz El Paso L144, IRGA 417 e EEA 406, foram analisados utilizando-se os sistemas enzimáticos Esterase, Fosfatase Ácida, Glutamato Desidrogenase, Glutamato Oxalacetato Transaminase, e Malato Desidrogenase. Seis estádios de desenvolvimento (0, 2, 4, 6, 8 e 10 dias) foram avaliados para a extração de proteínas. Dos resultados obtidos pode se inferir que: cada sistema enzimático analisado apresenta um momento adequado para extração de proteínas; não foi possível identificar um estádio de desenvolvimento onde coincidira a máxima expressão fenotípica de todos os sistemas enzimáticos; a análise simultânea de vários sistemas isoenzimáticos, a partir de uma única extração de proteína não é recomendada. A qualidade fisiológica das sementes da cultivar EEA 406 afetou a análise isoenzimática dos sistemas Esterase e Glutamato Oxalacetato Transaminase.

Expressão de mediadores neurotróficos e pró-inflamatórios na endometriose de reto e sigmoide

OBJETIVO: Avaliar a expressão de mediadores neurotróficos (NGF, NPY E VIP) e pró-inflamatórios (TNF-α) em fragmentos de reto e sigmoide comprometidos por endometriose. MÉTODOS: Foram selecionadas 24 pacientes submetidas ao tratamento cirúrgico de endometriose de reto e sigmoide com técnica de ressecção segmentar, seguido de anastomose mecânica término-terminal, com grampeador circular, no período de janeiro de 2005 a dezembro de 2007. Neste estudo incluímos mulheres no menacme que se submeteram a tratamento cirúrgico por endometriose profunda infiltrativa com acometimento do reto e sigmoide, atingindo o nível da camada muscular, submucosa ou mucosa. Para o grupo de estudo foram utilizados 24 fragmentos de reto e sigmoide com endometriose confirmada histologicamente, sendo um fragmento de cada uma das 24 pacientes selecionadas. Para o grupo controle, utilizou-se um fragmento da margem distal da ressecção, denominado anel de anastomose, de cada uma das 24 pacientes selecionadas e incluídas no estudo. As amostras foram agrupadas em blocos de Tissue Micro Array (TMA) e submetidas à reação imunoistoquímica para avaliar a expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), do fator de crescimento neural (NGF), do neuropeptídeo Y (NPY) e do peptídeo intestinal vasoativo P (VIP), e posterior análise semiquantitativa da imunomarcação por meio da leitura da densidade ótica relativa (DO). RESULTADOS: Observou-se maior densidade ótica relativa da imunomarcação para TNF-α e NGF no grupo de estudo (amostras com endometriose intestinal), DO= 0,01, respectivamente, para as duas proteínas (p<0,05), em relação aos controles sem endometriose. Não houve diferença estatística na densidade ótica da imunomarcação do NPY e VIP. CONCLUSÃO: Identificou-se o aumento da imunomarcação dos anticorpos TNF-α e NGF em fragmentos de reto e sigmoide comprometidos por endometriose em relação aos controles livres da doença. Não identificamos diferença estatística na imunomarcação das proteínas NPY e VIP.

Expressão de glicoesfingolipídeos no carcinoma espinocelular do trato aerodigestivo superior

Os glicoesfingolipídios (GSLs) são importantes componentes da membrana celular, organizados em microdomínios, relacionados a receptores de membrana e comportamento anti-social da célula neoplásica como crescimento descontrolado, invasão e ocorrência de metástases. OBJETIVO: Como a expressão de GSLs no carcinoma espinocelular (CEC) é tema pouquíssimo estudado decidiu-se realizar estudo prospectivo visando avaliar a expressão de GSLs no CEC do trato aerodigestivo superior. MÉTODO: Coletou-se 33 amostras de CEC e mucosa normal e GSLs extraídos e purificados por cromatografia de fase reversa em coluna de C-18 e hidrólise alcalina em metanol. Os GSLs foram quantificados por densitometria das placas de cromatografia de alta resolução em camada delgada coradas com orcinol. RESULTADOS: Observou-se aumento significativo de GSLs no CEC (3,57µg/mg) em comparação à mucosa normal (1,92µg/mg), principalmente do monosialogangliosídeo (GM3), trihexosilceramida (CTH), dihexosilceramida (CDH), globosídeo (Gb4). A expressão de monohexosilceramida (CMH) foi semelhante no CEC e na mucosa normal. O aumento do GM3 no CEC foi demonstrado por métodos imunoquímicos empregando-se MAb DH2 (anti-GM3). Analisando-se os carboidratos do CMH por cromatografia gasosa acoplado a espectrômetro de massa constatou-se que a mucosa normal expressa glucosilceramida e o CEC glucosilceramida e galactosilceramida. CONCLUSÃO: O aumento de GSLs no tecido tumoral pode representar alterações dos microdomínios da membrana celular resultantes do processo de transformação maligna, responsáveis por uma maior interação célula-célula e célula-matriz aumentando seu potencial de infiltração e metástase, possibilitando o emprego dos GSLs e de MAbs no diagnóstico e no tratamento do CEC, a exemplo do que ocorre no melanoma.

Expressão de ciclina D1 e presença de metástase cervical de carcinoma epidermóide de boca

A metástase cervical é o fator de prognóstico mais relevante do carcinoma epidermóide de boca. Fatores clínicos e histológicos estão associados com o desenvolvimento da metástase cervical, porém a pesquisa de fatores moleculares está sendo amplamente realizada nos últimos anos. OBJETIVO: Observar a associação da expressão da ciclina D1 como fator de risco para a presença de metástase cervical. MATERIAL E MÉTODO: A expressão da ciclina D1 foi estudada e verificada sua associação com a metástase em 45 pacientes com câncer de boca. A leitura da expressão da ciclina D1 foi realizada pelo método estereológico. Características clínicas e histológicas foram pesquisadas e associadas com a presença de metástase. RESULTADOS: A expressão da ciclina D1 foi encontrada em 15 pacientes (33,4%) e não esteve associada a fatores clínicos, histológicos e com a presença de metástase cervical, sendo sua expressão independente. O estadiamento clínico e as embolizações vasculares foram os fatores preditivos de maior relevância para o desenvolvimento de metástase. CONCLUSÕES: A expressão da ciclina D1, embora seja independente, não está associada com a presença de metástase cervical, enquanto que o estadiamento clínico e as embolizações vasculares estão.

Expressão da laminina na membrana basal em carcinoma escamocelular oral

A membrana basal é uma estrutura dinâmica que sofre modificações qualitativas e quantitativas durante a progressão do carcinoma escamocelular, e este processo é de fundamental importância na invasão neoplásica e metástase. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi investigar o comportamento da membrana basal em carcinomas escamocelulares de boca com diferentes graus de malignidade histológica através da expressão imuno-histoquímica da laminina. FORMA DE ESTUDO: Coorte histórica com corte transversal. MATERIAL E MÉTODO: Trinta e um casos de carcinoma escamocelular de boca foram submetidos à graduação histológica para tumores malignos. Através do método da streptavidina-biotina, foi verificada a expressão imuno-histoquímica da laminina em relação à sua intensidade e integridade nas lesões com diferentes graus de malignidade. RESULTADOS: Foram observadas diferenças estatisticamente significativas dos valores médios da intensidade e da continuidade de marcação da laminina em relação aos diferentes graus de malignidade. CONCLUSÃO: Ficou demonstrado que a laminina, uma glicoproteína presente na membrana basal, sofreu modificações diferenciadas em carcinomas escamocelulares de boca nos diferentes graus de malignidade histológica.

Expressão da proteína nm23 em carcinoma de células escamosas de língua metastático e não-metastático

O carcinoma de células escamosas oral (CCEO) exibe prognóstico desfavorável em decorrência da capacidade de invasão aos tecidos vizinhos e elevada incidência de metástases. OBJETIVO: O presente trabalho objetiva analisar a expressão imunohistoquímica da proteína nm23 em CCEs de língua metastáticos e não-metastáticos. METODOLOGIA: A técnica da imunohistoquímica para a proteína nm23-h1 foi realizada em 35 casos de CCE de língua com metástase em 15 casos. Atribuiu-se escore 0, para ausência de marcação; 1, marcação focal e 2 para marcação difusa. RESULTADOS: Observou-se marcação focal para a proteína nm23 em 9 casos, difusa em 15, e ausência de marcação em 11 espécimes. O teste exato de Fischer foi aplicado, não havendo diferença estatisticamente significativa para positividade desta proteína nos casos metastáticos e não-metastáticos (p=0.365), apesar de que em 66.7% dos casos com metástase não houve marcação. CONCLUSÕES: A presença da proteína nm23 não esteve relacionada de forma positiva aos casos de CCE de língua sem metástase. Dessa forma, vários outros fatores inerentes à célula neoplásica e ao hospedeiro podem estar relacionados aos mecanismos supressores do processo metastático nesta entidade.

Eficiência na produção de frutos e alocação relativa de nutrientes em cultivares de cafeeiro

Considerando a baixa produtividade das plantas em solos de menor fertilidade natural e o alto custo dos insumos agrícolas, torna-se necessária a seleção de cultivares mais eficientes na absorção e utilização dos nutrientes minerais. Foram avaliados quatro cultivares de cafeeiro arábica (Acaiá IAC 474 19, Icatu Amarelo IAC 3282, Rubi MG 1192 e Catuaí Vermelho IAC 99) quanto à eficiência na produção de frutos e alocação relativa de nutrientes. O experimento foi conduzido em Viçosa MG, em condições de campo, no delineamento experimental em blocos ao acaso, envolvendo quatro cultivares, quatro repetições e três níveis de adubação (baixo, normal e alto). As parcelas úteis constituíram-se de nove plantas espaçadas de 2 x 1 m. O cultivar Icatu Amarelo IAC 3282 foi o mais produtivo no ambiente com restrição de nutrientes, enquanto Rubi MG 1192 e Catuaí Vermelho IAC 99 mostraram-se mais produtivos em ambientes com alto suprimento de nutrientes. A eficiência de produção de café em coco por unidade de P, Ca, Mg e B acumulados na planta foi maior no nível alto de adubação. Os cultivares Rubi MG-1192 e Catuaí Vermelho IAC 99 apresentaram maior eficiência de utilização de nutrientes para produção de frutos no nível alto de adubação. Considerando a média de alocação relativa de nutrientes nos frutos para os quatro cultivares, no nível normal de adubação, verificou-se que eles possuem 38,1% do N, 46,34% do P, 40,19% do S, 42,68% do K, 13,19% do Ca, 25,04% do Mg, 40,63% do Cu, 19,49% do Zn e 17,73% do B.

Influência dos diferentes períodos de colheita na expressão de isoenzimas em sementes de cevada

O objetivo foi avaliar os padrões isoenzimáticos de Esterase (EST - EC 3.1.1.1), Fosfatase Ácida (ACP - EC 3.1.3.2), Malato Desidrogenase (MDH - EC 1.1.1.37), Álcool Deshidrogenase (ADH - EC 1.1.1.1) e Glutamato Oxalacetato Transaminase (GOT - EC 2.6.1.1), em sementes e plântulas de dois cultivares de cevada (MN 721 e Scarlett). As sementes foram fornecidas pela empresa Westermann, localizada no município de Piratini, Rio Grande do Sul, onde foi realizado o cultivo da cevada em 2007. Foram colhidas em três épocas com diferentes percentuais de umidade, secas a 13% de umidade e armazenadas em câmara fria. Os cinco sistemas isoenzimáticos analisados apresentaram variações na expressão, principalmente quando comparados entre sementes e plântulas. Concluiu-se que há variação no padrão de expressão das enzimas EST, ACP, MDH, ADH e GOT entre sementes e plântulas. A expressão das enzimas EST e GOT foi pouco e muito influenciada pela época de colheita, respectivamente.

Expressão de caracteres de tubérculos em função do tamanho de recipiente usado no cultivo de batata na geração de plântulas

No melhoramento genético de batata, para alguns caracteres, é possível eliminar genótipos inferiores já nas gerações iniciais, o que permite reduzir o número de genótipos avaliados a campo, proporcionando redução de custos. O objetivo deste trabalho foi verificar a influência do tamanho de vaso na expressão de caracteres de tubérculo, em famílias de batata, na geração de plântula. Em casa de vegetação, dez famílias de batata foram avaliadas em dois tamanhos de recipientes, vaso grande (1 L) e vaso pequeno (250 ml). Os caracteres de tubérculos avaliados foram: cor, aspereza, profundidade de olho, sobrancelha, formato, uniformidade de formato, apontamento, curvatura, achatamento, aparência geral, massa por planta, massa média e número de tubérculos. O vaso grande proporciona maior expressão da variação genética para os caracteres profundidade de olho, sobrancelha, curvatura, achatamento, aparência geral e todos os componentes de rendimento. As maiores médias de produção de tubérculos em número, tamanho e massa foram obtidas no vaso grande, enquanto o maior coeficiente de variação genético para os caracteres formato, uniformidade de formato e apontamento de tubérculo foi obtido no vaso pequeno.

Características físico-químicas de bebidas de café tipo expresso preparadas a partir de blends de café arábica e conilon

Nos últimos anos tem sido crescente a procura por bebidas de café diferenciadas, como o tipo expresso. Nessa bebida, é essencial um alto teor de extrato aquoso para garantir um bom corpo, o que pode ser obtido utilizando-se o café conilon. O Estado do Espírito Santo é o maior produtor nacional de café conilon. Ainda que existam vários estudos sobre a composição físico-química do café brasileiro, pouco se sabe sobre características físico-químicas das bebidas de café expresso obtidas com blends entre o café arábica e o conilon capixaba. Neste trabalho teve-se como objetivo realizar a caracterização físico-química da bebida de café expresso formulada a partir de blends de café arábica e conilon produzido no Espírito Santo (nas proporções de arábica e conilon de 100:0; 80:20; 60:40; 40:20; e 0:100, respectivamente), com diferentes tipos de processamento (natural e descascado). Foram realizadas análises de umidade, pH, acidez titulável total e extrato aquoso. Constatou-se que a utilização de conilon no blend com arábica, nas duas formas de processamento, acarreta em bebidas com maior valor de pH, menor acidez e maior teor de extrato aquoso. Um maior teor de extrato aquoso é interessante para o preparo de café tipo expresso. Sendo assim, os resultados demonstram a viabilidade da utilização do café conilon em blends com arábica no preparo do café tipo expresso, quando se desejam bebidas com maior teor de extrato aquoso.