Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão em meio de cultura semi seletivo

Para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em extratos de sementes inteiras e moídas de feijão, naturalmente contaminadas e sadias foram utilizados os meio de cultura semi-seletivos XCP1 e MT e o não seletivo 523 de Kado & Hesket. Os extratos de sementes foram também inoculados em folhas primárias de feijoeiro. O meio de cultura semi-seletivo XCP1 foi o mais eficiente na quantificação e detecção de Xap em extratos de sementes inteiras de feijão. Os extratos de sementes contaminadas, inoculados nas folhas primárias de feijoeiro produziram sintomas do crestamento bacteriano comum.

Natural variability in Arabidopsis thaliana germplasm response to Xanthomonas campestris pv. campestris

This work aimed to study the interaction between the model plant Arabidopsis thaliana and Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), the pathogen responsible for black rot of crucifers. The response of 32 accessions of A. thaliana to the Brazilian isolate of Xcc CNPH 17 was evaluated. No immunity-like response was observed. "CS1308", "CS1566" and "CS1643" grown in continuous light were among the accessions that showed strongest resistance when inoculated with 5 x 10(6) CFU/mL. In contrast, "CS1194" and "CS1492" were among the most susceptible accessions. Similar results were obtained when plants were grown under short-day conditions. To quantify the differences in disease symptoms, total chlorophyll was extracted from contrasting accessions at different time points after inoculation. Chlorophyll levels from controls and Xcc inoculated plants showed a similar reduction in resistant accessions, whereas Xcc-inoculated susceptible accessions showed a greater reduction compared to controls. To test the specificity of resistance, accessions CS1308, CS1566, CS1643 and CS1438 (which showed partial resistance to CNPH 17), were inoculated with a more aggressive isolate of Xcc (CNPH 77) and Ralstonia solanacearum. Among the accessions tested, "CS1566" was the most resistant to Xcc CNPH 77 and also displayed resistance to R. solanacearum. Accessions CS1308, CS1566 and CS1643 were also inoculated with a high titer of Xcc CNPH 17 (5 x 10(8) CFU/mL). No collapse of tissue was observed up to 48 h after inoculation, indicating that a hypersensitive response is not involved in the resistance displayed by these accessions.

Hospedeiros alternativos de Xanthomonas campestris pv. viticola

Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), que causa o cancro bacteriano da videira, sobrevive em plantas infectadas, epifiticamente em órgãos da parte aérea e pode ser veiculada em mudas e/ou bacelos infectados. O trabalho teve como objetivo investigar possíveis hospedeiros alternativos do patógeno, visando fornecer subsídios para o manejo da doença. A partir das plantas invasoras Alternanthera tenella, Amaranthus sp., Glycine sp. e Senna obtusifolia com sintomas similares aos do cancro bacteriano da videira, coletadas em parreirais de Juazeiro e Petrolina, no Submédio São Francisco, foram isoladas bactérias semelhantes a Xcv. No entanto, nenhuma bactéria foi isolada de plantas de Commelina benghalensis e Azadirachta indica com sintomas semelhantes. A patogenicidade dos isolados bacterianos obtidos foi confirmada em plantas de A. tenella, Amaranthus sp., Glycine sp., S. obtusifolia e em mudas de videira cv. Red Globe, em condições de casa de vegetação. As plantas invasoras Chamaesyce hirta, Dactyloctenium aegyptium, Eragrostis pilosa e Pilea sp., inoculadas artificialmente com os isolados Xcv1 e UnB1216, também desenvolveram sintomas típicos do cancro bacteriano.

Development of a molecular method for detection and identification of Xanthomonas campestris pv. viticola

In order to develop a molecular method for detection and identification of Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) the causal agent of grapevine bacterial canker, primers were designed based on the partial sequence of the hrpB gene. Primer pairs Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R, which amplified 243- and 340-bp fragments, respectively, were tested for specificity and sensitivity in detecting DNA from Xcv. Amplification was positive with DNA from 44 Xcv strains and with DNA from four strains of X. campestris pv. mangiferaeindicae and five strains of X. axonopodis pv. passiflorae, with both primer pairs. However, the enzymatic digestion of PCR products could differentiate Xcv strains from the others. None of the primer pairs amplified DNA from grapevine, from 20 strains of nonpathogenic bacteria from grape leaves and 10 strains from six representative genera of plant pathogenic bacteria. Sensitivity of primers Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R was 10 pg and 1 pg of purified Xcv DNA, respectively. Detection limit of primers RST2/Xcv3R was 10(4) CFU/ml, but this limit could be lowered to 10² CFU/ml with a second round of amplification using the internal primer Xcv1F. Presence of Xcv in tissues of grapevine petioles previously inoculated with Xcv could not be detected by PCR using macerated extract added directly in the reaction. However, amplification was positive with the introduction of an agar plating step prior to PCR. Xcv could be detected in 1 µl of the plate wash and from a cell suspension obtained from a single colony. Bacterium identity was confirmed by RFLP analysis of the RST2/Xcv3R amplification products digested with Hae III.

Detecção, transmissão e efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris na qualidade fisiológica de sementes de brócolis

A detecção, a transmissão e o efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) na qualidade fisiológica de sementes de brócolis (Brassica oleracea var. italica) foram avaliadas, a partir de sementes obtidas de plantas ("Baron, Flórida, Hana Midori Sakata, Precoce Piracicaba de Verão, Ramoso Santana e Sabre") inoculadas com a bactéria, em condições de campo. Para a detecção do patógeno nas sementes foram utilizados os meios de cultura semi-seletivos: SX ágar, NSCAA e BSCAA; a taxa de transmissão da bactéria pelas sementes às plântulas foi avaliada usando semeadura em areia e meio de cultura contido em tubo de ensaio. Para a avaliação da qualidade fisiológica das sementes foram realizados o teste padrão de germinação e os testes de vigor: envelhecimento acelerado, índice de velocidade de emergência, crescimento das plântulas e massa seca. De acordo com os resultados, o meio de cultura semi-seletivo NSCAA foi mais eficaz para detectar Xcc em sementes de brócolis; não houve diferença significativa entre os genótipos na taxa de transmissão da bactéria pelas sementes e Xcc não afetou a germinação e o vigor das sementes.

Detecção, transmissão e efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris na qualidade fisiológica de sementes de brócolis

A detecção, a transmissão e o efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) na qualidade fisiológica de sementes de brócolis (Brassica oleracea var. italica) foram avaliados, a partir de sementes obtidas de plantas ("Baron, Flórida, Hana Midori Sakata, Precoce Piracicaba de Verão, Ramoso Santana e Sabre") inoculadas com a bactéria, em condições de campo. Para a detecção do patógeno nas sementes foram utilizados os meios de cultura semi-seletivos: SX ágar, NSCAA e BSCAA; a taxa de transmissão da bactéria pelas sementes às plântulas foi avaliada usando semeadura em areia e meio de cultura contido em tubo de ensaio. Para a avaliação da qualidade fisiológica de sementes foram realizados o teste padrão de germinação e os testes de vigor: envelhecimento acelerado, índice de velocidade de emergência, crescimento de plântulas e massa seca. De acordo com os resultados, o meio de cultura semi-seletivo NSCAA foi mais eficaz para detectar Xcc em sementes de brócolis; não houve diferença significativa entre os genótipos na taxa de transmissão da bactéria pelas sementes e Xcc não afetou a germinação e o vigor das sementes.

Meio semi-seletivo para detectar Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijoeiro e sua erradicação através do tratamento de sementes com o fungicida tolylfluanid

Estudou-se a eficiência do meio semi-seletivo desenvolvido para Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam) do algodoeiro, com algumas modificações, na detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em sementes de feijoeiro, bem como a eficiência do fungicida tolylfluanid na erradicação de Xap através do tratamento de sementes. Foram utilizadas sementes naturalmente infectadas por Xap, procedentes de diferentes municípios do Estado do Paraná. Houve o desenvolvimento de colônias bacterianas ao redor das sementes infectadas sob meio semi-seletivo entre seis e 12 dias de incubação. A freqüência de recuperação de colônias da bactéria em relação ao meio Agar nutriente (AN) variou entre 30 a 112%. O crescimento de Xap foi inibido a concentrações entre 54 a 1500 ppm do fungicida tolylfluanid. A bactéria foi recuperada das sementes não tratadas em meio semi-seletivo, mas não das sementes tratadas em solução do fungicida tolylfluanid (1,20g/L água). Em casa de vegetação, das 400 sementes tratadas com tolylfluanid não foi produzida nenhuma planta com sintomas da doença até 30 dias após a semeadura, enquanto que 9,75% das sementes não tratadas apresentaram sintomas de Xap. Em um outro experimento, das 1200 sementes não tratadas um total de 7,08% e 11,67% das plantas mostraram-se com sintomas da doença, enquanto que das sementes tratadas 0,5% e 2,4% apresentaram sintomas, 26 e 46 dias após a semeadura, respectivamente.

Alterações metabólicas em plantas de feijão originadas de sementes microbiolizadas por Pseudomonas sp. e inoculadas com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

Muitas enzimas estão envolvidas em reações de defesa de plantas contra patógenos. O objetivo deste trabalho foi verificar alterações na atividade de algumas destas enzimas em plantas de feijão originadas de sementes microbiolizadas com um isolado de Pseudomonas do grupo das fluorescentes (isolado DFs842). Sementes de feijão cultivar BRS Valente foram imersas em suspensão salina preparada a partir de crescimento bacteriano com 24 h do isolado de Pseudomonas (OD540=0,5) sabidamente biocontroladora de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Como testemunhas, as sementes foram imersas em solução salina (NaCl 0,85%). Após a microbiolização por 5 h a 10ºC, as sementes foram plantadas em vasos contendo uma mistura de solo não esterilizado, areia e esterco bovino (proporção 3:1:1), mantidos em casa de vegetação. A inoculação do patógeno foi realizada na terceira folha verdadeira de todas as plantas, fazendo-se cortes com tesoura imersa em suspensão salina do patógeno (X. axonopodis pv. phaseoli) preparada a partir de crescimento de 24 h (OD540=0,4). Câmaras úmidas foram mantidas 24 h antes e após a inoculação. Para o preparo do extrato protéico, as três primeiras folhas verdadeiras foram coletadas individualmente em 5 épocas de coleta distintas: uma, momentos antes da inoculação e as demais nos tempos seis, 24, 72 h e 15 dias após a inoculação. Este extrato protéico serviu de fonte para as determinações do teor de proteínas solúveis totais (PST), atividade da polifenol oxidase (PPO) e da peroxidase (PO), as quais foram realizadas por leituras espectrofotométricas. Os resultados demonstraram aumento significativo no teor de PST e na atividade de PPO nas plantas submetidas ao tratamento com isolado DFs842, sendo que, o teor de PST foi o dobro, em relação às plantas não tratadas. Também foi observado que, mesmo antes da inoculação do patógeno o teor de PST e a atividade de PPO nas plantas tratadas estavam bem maiores. Em relação à atividade de PO houve redução da mesma nas plantas tratadas com o isolado de Pseudomonas (DFs842). Esses resultados evidenciaram que a microbiolização das sementes provocou alterações metabólicas nas plantas delas originadas, pelo aumento do teor de PST e atividade de PPO, indicando uma provável participação destas enzimas na indução de resistência ativada pela microbiolização com o isolado de Pseudomonas (DFs842).

Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijoeiro provenientes do estado do Paraná, Brasil

O crestamento bacteriano comum do feijoeiro causado por sobrevivência e disseminação da Xap, a semente representa o mais Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) é a principal doença eficiente. A qualidade sanitária de 34 amostras de sementes de feijoeiro do feijoeiro comum no Brasil. O patógeno encontra-se disseminado produzidas no estado do Paraná, nas safras 1998/99 e 1999, foram em todas as regiões produtoras do país, porém com maior importância avaliadas quanto à presença de Xap em macerados de sementes nos estados do Paraná, Rio de Janeiro, São Paulo e na região do Brasil plaqueados em meio semi-seletivo. Cinqüenta por cento dos lotes de Central, sobretudo na safra das águas. Dentre os vários meios de sementes foram portadores de Xap com incidência de 0,1% a 1,7%.

Especificidade de hospedeiro nas interações Xanthomonas campestris pv. campestris - brássicas

Face às escassas informações acerca da variabilidade patogênica de isolados brasileiros de Xanthomonas campestris pv. campestris, realizou-se um estudo para avaliar a especificidade patogênica de trinta e três isolados do patógeno, provenientes de várias regiões do Brasil e do exterior, a oito espécies de brássicas, através de inoculação por meio de injeção da suspensão bacteriana nas folhas. Desse total, 12 isolados foram obtidos de couve-comum (Brassica oleracea var. acephala), nove de repolho (B. oleracea var. capitata), cinco de couve-flor (B. oleracea var. botrytis), dois de canola (B. napus), um de brócolos (B. oleracea var. italica), um de couve-chinesa (B. chinensis), um de couve-rábano (B. oleracea var. gongylodes) e dois de rabanete (Raphanus sativus). A avaliação da patogenicidade dos isolados da bactéria, frente aos hospedeiros em estudo, demonstrou que 14 deles não apresentaram especificidade, originando sintomas em todas as diferentes plantas inoculadas. Os 19 isolados restantes, entretanto, apresentaram relativo grau de especificidade, não causando doença em uma ou mais das plantas inoculadas.

Otimização da técnica de PCR para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão

O crestamento bacteriano comum, causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap), é a principal bacteriose do feijoeiro no Brasil, sendo transmitida principalmente por sementes. O presente trabalho teve como objetivo aperfeiçoar uma técnica, por meio de diferentes métodos de preparação do extrato, para a detecção de Xap, bem como sua detecção simultânea com Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) nos extratos de sementes de feijão,via PCR. A partir de amostras de sementes de feijão inoculadas artificialmente com Xap e lotes comerciais, foram avaliados: extrato bruto obtido diretamente das sementes, extrato concentrado por filtração em membrana de 0,22µM de diâmetro, extrato concentrado por centrifugação e extrato plaqueado em meio semi-seletivo XCP1 com e sem antibióticos (BIO-PCR). Avaliou-se a presença simultânea de Xap e Cff em 10 lotes comerciais de sementes de feijão através da reação multiplex, utilizandos-se os primers X4c, X4e, CffFOR2 e CffREV4. A partir do extrato bruto, do extrato concentrado por centrifugação e por filtragem em membrana Millipore® não foi possível a detecção de Xap nas sementes de feijão artificialmente contaminadas nem nos 47 lotes comerciais de sementes/ grãos de feijão. A técnica de BIO-PCR permitiu a detecção de Xap a partir de extratos de sementes de feijão artificialmente contaminadas e em 18 dos 47 lotes comerciais. A técnica de detecção simultânea de Xap e Cff no mesmo gel é viável, por amplificar fragmentos de DNA típicos de cada fitobactéria. O uso do meio de cultura XCP1 sem adição de antibióticos permitiu detectar Xap com período de incubação menor em um dia em comparação à detecção utilizando-se o meio de cultura com antibióticos

Estudos dos constituintes químicos e atividade antibacteriana do óleo essencial de Lippia gracilis a Xanthomonas campestris pv. viticola "in vitro"

Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a eficácia de óleos essenciais de Lippia gracilis, no crescimento in vitro de Xcv. Foram utilizados oito óleos extraídos de L. gracilis, obtidos de diferentes manejos de cultivo, em três dosagens diferentes (200; 250 e 300 µL.L-1), testemunha com o oxicloreto de cobre (controle padrão) e a testemunha absoluta. A suscetibilidade do isolado Xcv3 aos óleos testados foi avaliada na primeira etapa pela presença e ausência do crescimento bacteriano e, na segunda etapa, pela porcentagem de inibição do crescimento bacteriano. A análise da composição química dos óleos essenciais extraídos de L. gracilis, mostrou, o carvacrol (73,9 a 77%) como composto majoritário e o timol (4,9 a 10,3%). Os óleos referentes aos tratamentos 01, 06 e 07 foram os que proporcionaram maiores porcentagens de inibição no crescimento bacteriano de Xcv: 94,75%, 96,50% e 94,02%, respectivamente, sendo superiores ao oxicloreto de cobre (49,6%).

Copper accumulation in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

A strain of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria showing resistance to 1.2 mM cupric sulfate was analyzed by atomic absorption spectroscopy and ESI (electron spectrophotometry imaging). Accumulation of copper was detected in the periphery of the cell membrane region, suggesting that the mechanism of copper resistance is similar to that previously described for Pseudomonas species. The ESI technique was used to detect copper in the membrane region. Copper-resistance in X. campestris pv. vesicatoria 484 is inducible and occurs by accumulation of the metal and not by efflux mechanism as has been suggested. The growth curve also showed that this system is inducible.

Método generalizado de análise de dialelos desbalanceados

Apresenta-se um procedimento generalizado de estimação das capacidades geral e específica de combinação em cruzamentos dialélicos, com número desigual de repetições para tratamentos (genitores e combinações híbridas F1), avaliados em um delineamento com restrições na casualização. Neste caso, as médias ajustadas estimadas são interdependentes e heterocedásticas, devendo-se, para estimar os parâmetros desejados, utilizar o modelo linear generalizado de GaussMarkov. O objetivo deste trabalho foi a dedução teórica do método e sua aplicação a um exemplo prático. Foram analisados os dados obtidos de um dialelo completo, sem os recíprocos, envolvendo cinco genitores: CB 511687-1, CB 733753, Diamante Negro, Rosinha G2 e Compuesto Chimaltenango 2. Os genitores CB 733753, CB 511687-1 e Diamante Negro contribuem geneticamente para a resistência, enquanto Rosinha G2 e Compuesto Chimaltenango 2 contribuem para a suscetibilidade do feijoeiro ao crestamento-bacteriano comum. Na maioria dos cruzamentos analisados constatou-se a dominância parcial da suscetibilidade do feijoeiro a Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli.