Estruturação de cristais de gelo em soluções aquosas contendo solutos diversos

Existe uma grande demanda de conhecimentos na área de criopreservação de frutos tropicais com vistas a reduzir os danos celulares provocados por cristais de gelo durante o congelamento. O objetivo deste trabalho foi estudar a capacidade de estruturação de cristais de gelo. Soluções aquosas contendo arabinose, glicose, piridoxina, creatina, metionina, lisina e arginina, foram submetidas a congelamento lento em ar estático e as amostras resultantes examinadas por microscopia ótica sob luz polarizada. Os açúcares arabinose e glicose provocaram nos cristais de gelo estruturações que variaram de uma configuração hexagonal a uma arbórea, dentre outras. Vitaminas hidrossolúveis e compostos hidrofílicos ou hidrofóbicos favoreceram a formação de arranjamentos circulares filamentosos.

Efeito de concentração espermática e período de incubação oócitoespermatozóides na fecundação in vitro em bovinos da raça Gir

Avaliou-se o efeito de concentrações espermáticas e períodos de incubação na fecundação in vitro com sêmen de touros Gir (Bos indicus). Oócitos maturados in vitro foram fecundados com sêmen de dois touros, nas concentrações de 1, 2 ou 4x10(6) espermatozóides/mL, por 12 ou 18 horas, e avaliada a taxa de fecundação e polispermia. Posteriormente, foi avaliada a taxa de clivagem com 72 horas e de blastocisto no oitavo dia pósfecundação. Um segundo experimento verificou o efeito de 1, 2 e 4x10(6) espermatozóides/mL por 18 horas, utilizando sêmen de três touros separadamente, bem como o efeito de 12 e 18 horas de incubação, na concentração de 1 a 2x10(6) espermatozóides/mL. Observou-se maior (P<0,05) polispermia na concentração de 4x10(6) espermatozóides/mL e que a associação dessa concentração com 18 horas aumentou a taxa de clivagem (P<0,05). No segundo experimento, o aumento do período de incubação melhorou (P<0,05) a taxa de clivagem para um dos touros e, quando comparados entre si, os animais produziram taxa de clivagem e de blastocistos diferentes (P<0,05) em uma mesma concentração ou período de incubação. Os resultados revelaram que a polispermia é o principal efeito do aumento da concentração espermática e que a eficiência entre touros na fecundação in vitro é dependente da concentração e período de incubação.

Isolados de Dicyma pulvinata em estromas de Microcyclus ulei em seringueira

Dicyma pulvinata é um eficiente agente de biocontrole de Microcyclus ulei, causador do mal-das-folhas da seringueira. O objetivo deste trabalho foi obter isolados com grande potencial antagônico. Em levantamentos realizados em 14 municípios produtores de borracha, localizados nos Estados do Acre, Amazonas, Bahia, Mato Grosso, Pará e Rondônia, obtiveram-se 52 isolados de D. pulvinata. O fungo antagônico, isolado diretamente em meio de cultura de batata-dextrose-ágar (BDA), foi identificado com base na morfologia dos conídios e conidióforos e preservado pelos métodos da liofilização, congelamento à temperatura de -80ºC e criopreservação em nitrogênio líquido, a fim de manter as características morfológicas e patogênicas dos isolados. O efeito antagônico foi testado por meio de inoculações de D. pulvinata em lesões de Fusicladium macrosporum induzidas em plantas de seringueira previamente infectadas. Todos os isolados foram incorporados à coleção de fungos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

Potencial germinativo e morfoanatomia foliar de plântulas de pinhão-manso originadas de germoplasma criopreservado

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial germinativo e caracterizar morfoanatomicamente a estrutura foliar de plântulas de pinhão-manso originadas de germoplasma criopreservado. Inicialmente, as sementes foram avaliadas quanto à dessecação, a cada 24 horas, por até 120 horas. Posteriormente, as sementes foram dessecadas por 0, 24 e 48 horas e avaliadas mensalmente quanto ao potencial germinativo, antes e após armazenamento em nitrogênio líquido por imersão direta e congelamento rápido. Para caracterizar a viabilidade das sementes que não germinaram após o período de avaliação, os embriões zigóticos foram imersos em solução de tetrazólio. A morfoanatomia foliar após criopreservação foi caracterizada por meio de estudos histológicos. As sementes de pinhão-manso toleraram a dessecação a níveis críticos e a criopreservação com umidade em torno de 8%. A dessecação das sementes até valores baixos, associada a períodos prolongados de exposição ao nitrogênio líquido, causa anormalidade de plântulas, danifica as células e os tecidos das folhas, e afeta negativamente a germinação.

Avaliação do Desenvolvimento de Embriões Bovinos Pós-Biópsia: um Modelo para Treinamento

Objetivo: montar um protocolo animal para estudo e treinamento em biópsia embrionária. Métodos: ovários de vaca obtidos em abatedouro eram transportados ao laboratório onde os oócitos aspirados eram maturados. Posteriormente eram submetidos à fertilização in vitro. No dia 5 pós-fertilização, os embriões eram biopsiados, com a abertura da zona pelúcida realizada mediante lâmina de corte ajustada ao microscópio óptico. Após abertura da zona pelúcida 1 ou 2 blastômeros eram removidos dos embriões. Após a biópsia, os embriões permaneciam em co-cultivo por mais três dias. Ao final deste tempo, o desenvolvimento dos embriões era avaliado e comparado ao do grupo controle por meio de estudo morfológico e contagem do número de células, usando coloração específica para núcleos. Resultados: dos 57 embriões biopsiados, 40 atingiram o estágio de blastocisto (70,2%) e em 11 foi observado o "hatching" (27,5%). No grupo controle obtiveram-se 42 blastocistos (73,7%) e, destes, 11 chegaram a "hatching" (26,2%). Após contagem do número de células, observou-se que não houve diferença estatisticamente significante entre os 2 grupos. Conclusão: podemos verificar por meio dos resultados que o protocolo proposto foi tecnicamente viável, além de fornecer bom número de embriões, pela facilidade de obtenção de oócitos bovinos, podendo ser adotado para treinamento.

Viabilidade e fertilização in vitro de oócitos bovinos após vitrificação

OBJETIVOS: avaliar a técnica de criopreservação por vitrificação em DMSO 6 M para oócitos bovinos maturados in vitro e os efeitos do tempo de exposição às soluções de vitrificação (SV). MÉTODOS: estudo experimental tipo coorte. Ovários de bovinos foram obtidos em frigorífico e transportados ao laboratório. Os oócitos foram aspirados. A partir da SV contendo DMSO 6 M (SV 100%), foram preparadas soluções a 25 e 65%. Oócitos foram maturados in vitro por 18-22 horas. Para vitrificação, os oócitos foram colocados em SV 25%, por 5 minutos, transferidos à SV 65%, pipetados em SV 100% para palhetas e estocados em nitrogênio líquido. No primeiro grupo experimental, a exposição à SV 65% tomou até 60 segundos e no segundo grupo não ultrapassou 30 segundos. Para descongelamento, as palhetas foram expostas ao ar por 10 segundos, colocadas em banho-maria por 10 segundos e seu conteúdo expelido e mantido em solução de sacarose por 5 minutos. No terceiro grupo, os oócitos passaram por todas SV menos pelo nitrogênio líquido. Os oócitos recuperados foram inseminados. Para controle, oócitos frescos, maturados in vitro, foram inseminados. RESULTADOS: após vitrificação, foram recuperados 69,1 e 59,8% dos oócitos nos grupos de 30 segundos e 60 segundos, respectivamente, e 24 horas após inseminação pareceram morfologicamente normais 93 e 89,1% deles, respectivamente. No grupo de oócitos expostos às SV sem vitrificação, foram recuperados 75,6%, sendo 84,6% destes viáveis 24 horas após inseminação. Não ocorreu fertilização nos grupos experimentais. Entre os controles frescos, foram fertilizados 65,4% dos oócitos. CONCLUSÕES: a técnica de vitrificação utilizando DMSO 6 M não é aplicável para criopreservação de oócitos bovinos maturados in vitro. A redução do tempo de exposição às SV não superou o efeito deletério sobre a capacidade fertilizadora dos oócitos. Aprimoramentos da técnica são necessários para proteção da zona pelúcida e do oolema.

Caracterização da inviabilidade evolutiva de embriões visando doações para pesquisas de células-tronco

OBJETIVO: estabelecer quais as características que definem um embrião como inviável, tornando-o passível de doação para pesquisa com células-tronco. MÉTODOS: avaliação retrospectiva de ciclos de fertilização in vitro realizados entre janeiro de 1995 a 2005. Foram selecionados ciclos nos quais se transferiram para a cavidade uterina embriões com classificações morfológicas iguais entre si. Desta forma, avaliaram-se as taxas de gravidez, implantação e involução de sacos gestacionais dos embriões frescos e criopreservados, distribuídos em grupos, de acordo com sua morfologia. Foram considerados embriões tipo A aqueles simétricos e sem fragmentação; tipo B, assimétricos ou com até 25% de fragmentação; tipo C, com 25 a 50% do seu volume ocupado por fragmentos, e tipo D, aqueles com 50% ou mais de fragmentação. Para as análises estatísticas utilizaram-se os testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. RESULTADOS: em 87 ciclos foram transferidos 172 embriões tipo D, obtendo-se 11% de gravidez, embora somente metade dos embriões inicialmente implantados manteve sua evolução. Já embriões de mesma morfologia quando criopreservados, após descongelamento, não mostraram capacidade evolutiva, apresentando, a partir da transferência de 113 embriões em 36 ciclos, somente uma implantação, perfazendo uma diminuta taxa de 3% de gravidez. A única gestação obtida involuiu antes da 12ª semana de gestação. CONCLUSÃO: embriões de baixos escores morfológicos não podem ser considerados inviáveis por serem capazes, embora com uma freqüência muito baixa, de promoverem gestação. Mas estes mesmos embriões, quando criopreservados e posteriormente transferidos após descongelamento, mostraram taxa de gravidez irrisória, além de não resultarem em gravidez viável. Logo, quando extranumerários, os embriões tipo D não deveriam ser criopreservados, podendo então, ao invés de serem descartados, ser doados para pesquisa de células-tronco embrionárias.

Preservação de fertilidade

Com a evolução dos recursos terapêuticos e o aumento das taxas de sobrevida dos pacientes oncológicos, as repercussões tardias destas terapias, que antes eram infreqüentes, hoje assumem um papel importante quando se fala em qualidade de vida. Dentre estas complicações tardias está a perda da função ovariana. Segundo as recomendações da Sociedade Americana de Oncologia Clínica (American Society of Clinical Oncology) recentemente publicadas, os métodos comprovadamente eficazes para preservação da fertilidade feminina disponíveis hoje são: o congelamento de embriões, a cirurgia ginecológica conservadora e a ooforopexia para os casos de radioterapia localizada. Todas as demais técnicas existentes, tais como a supressão ovariana medicamentosa e a criopreservação de tecido ovariano e de oócitos, embora apresentem resultados promissores, ainda são consideradas experimentais. A escolha da melhor técnica para preservação de fertilidade aplicável em cada caso vai depender da idade da paciente, do tipo de tratamento, da existência ou não de parceiro com quem deseje constituir prole, do tempo disponível até o início da quimioterapia e do potencial do câncer em produzir metástase ovariana. Neste artigo as técnicas disponíveis e experimentais para a preservação da fertilidade são revisadas e discutidas.

Obtenção de gametas seguros por meio de associação de técnicas de processamento seminal para casais sorodiscordantes para HIV

RESUMO OBJETIVO: o objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros laboratoriais e clínicos de pacientes submetidos à reprodução humana assistida, associando técnicas de processamento seminal para eliminação de partículas virais da amostra de sêmen em casais nos quais o homem é infectado pelo vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV). MÉTODOS: foram avaliados 11 ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) realizados em casais nos quais os homens eram infectados pelo HIV (Grupo HIV), e 35 ciclos de ICSI nos quais se utilizaram espermatozóides doados (Grupo Controle). As amostras de sêmen dos doadores foram submetidas à análise seminal completa, processamento seminal (lavagem) e criopreservação. Os homens do Grupo HIV receberam antibioticoterapia prévia e realizou-se análise seminal, lavagem e gradiente descontínuo de densidade antes da criopreservação. As amostras foram avaliadas para carga viral e a ICSI foi realizada quando não houve detecção do HIV. RESULTADOS: quanto aos resultados da análise seminal, os grupos se mostraram comparáveis em relação à concentração e motilidade progressiva dos espermatozóides. Entretanto, a porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais foi maior no Grupo Controle (14,3%) comparado ao HIV (5,8%; p=0,002). Na avaliação dos parâmetros embrionários, as taxas de fertilização normal (Controle: 74,7% e HIV: 71,7; p=0,838) e de bons embriões (Controle: 42,4% e HIV: 65,1%; p=0,312) foram semelhantes. Por outro lado, o Grupo Controle apresentou melhores resultados clínicos que o HIV (gestação continuada: 52,9 e 12,5%; p=0,054; implantação: 42,6 e 10,4%; p=0,059, respectivamente), apesar de as diferenças não serem estatisticamente significantes. Após o nascimento, não houve soroconversão das mães e das crianças nascidas. CONCLUSÕES: a associação de técnicas de processamento seminal para eliminação do HIV de amostras seminais não interferiu nos parâmetros laboratoriais de ciclos de reprodução humana assistida. Por outro lado, demonstrou excelentes resultados na obtenção de gametas seguros para casais sorodiscordantes.

Desenvolvimento embrionário em ratas tratadas com tacrolimus durante a fase de pré-implantação

OBJETIVO: avaliar a toxicidade do tacrolimus sobre o desenvolvimento embrionário em ratas tratadas durante o período de trânsito tubário. MÉTODOS: sessenta ratas Wistar foram distribuídas em quatro grupos (15 animais cada), que receberam diferentes doses de tacrolimus por via intragástrica: (T1) 1,0 mg/kg/dia, (T2) 2,0 mg/kg/dia e (T3) 4,0 mg/kg/dia. O grupo controle (C) recebeu água destilada. As ratas foram observadas diariamente para detectar sinais clínicos de toxicidade. O tratamento foi realizado do primeiro ao quinto dia de gestação. As seguintes variáveis maternas foram analisadas: peso corporal, de ovários, fígados e rins, consumo de alimento, número de corpos lúteos, implantes, fetos vivos e mortos e índice de implantação. Os fetos e placentas foram pesados e os primeiros foram observados para detectar malformações externas. Estatística: análise de variância (ANOVA), uma via, seguida de teste de Dunnett (alfa=0,05). RESULTADOS: não ocorreram indícios clínicos de toxicidade materna, tais como perda de peso, redução do consumo de alimento ou do peso de órgãos (p>0,05). Também não houve diferença significativa no peso corporal dos fetos (C: 1,8±0,6; T1: 2,2±0,5; T2: 1,9±0,5 e T3: 2,0±0,5 g) e de placentas (C: 1,6±0,4; T1: 1,5±0,4; T2: 1,8±0,4 e T3: 1,6±0,4 g), com p>0,05. Nenhuma malformação externa foi detectada. CONCLUSÕES: a administração de tacrolimus a ratas prenhes durante o período de trânsito tubário não parece ter qualquer efeito tóxico e materno ou embrionário.

Efeito do ultra-som terapêutico em ratas prenhes

OBJETIVO: avaliar o efeito da exposição de ratas ao ultra-som terapêutico na fase de pré-implantação. MÉTODOS: ratas Wistar prenhes foram expostas, na fase de pré-implantação, ao ultra-som de 3 MHz, 0,6 W/cm², com ondas pulsadas (USP) ou ondas contínuas (USC), e os controles (USS) ao ultra-som desligado, por cinco minutos. As ratas foram sacrificadas no 20º dia pós-inseminação. Foram feitas análises bioquímicas e hematológicas. Os animais foram submetidos à necrópsia para identificação de lesões de órgãos internos, remoção e pesagem de fígado, rins e ovários. Foram contados os fetos vivos, malformados, mortos e reabsorvidos. Os fetos, seus cérebros, pulmões, fígados, rins e placentas foram pesados. Os dados obtidos foram analisados por ANOVA - uma via - seguida de teste de Dunnett, qui quadrado ou Kruskal-Wallis (α = 0,05). RESULTADOS: as ratas não apresentaram alteração de peso corporal, de órgãos e nem na capacidade reprodutiva, mas houve o aumento dos triglicérides em ambos os grupos, quando comparados ao USS. Os pesos relativos do coração (0,7 ± 0,9), fígado (9,8 ± 0,8), rins (6,2 ± 0,8) e pulmão (3,8 ± 0,4) dos fetos aumentaram no USC, quando comparados ao coração (0,6 ± 0,1), fígado (8,8 ± 0,5), rins (5,52 ± 0,5) e pulmão (3,4 ± 0,4) do USS. CONCLUSÕES: no modelo experimental usado, o ultra-som terapêutico não causou toxicidade materna significativa. Ondas pulsadas não alteraram a morfologia fetal, mas as ondas contínuas acarretaram aumento nos pesos relativos do coração, fígado, pulmão e rins dos fetos.

Limitações e controvérsias na determinação do valor preditivo de critérios de morfologia oocitária e embrionária

Com o objetivo de aumentar as taxas de sucesso das pacientes que são submetidas a técnicas de reprodução humana assistida (RHA), numerosos estudos apresentam como foco a identificação do embrião com maior potencial de implantação. Apesar dos avanços tecnológicos significativos da Medicina Reprodutiva baseados no advento da era da genômica, proteômica e metabolômica (OMICS), técnicas rotineiramente aplicáveis ainda não estão disponíveis. Dessa forma, laboratórios de fertilização in vitro(FIV) de todo o mundo selecionam para transferência embriões humanos cultivados in vitrobaseados em parâmetros morfológicos avaliados em microscopia de luz. Diversos parâmetros morfológicos podem ser avaliados desde o estágio pronuclear até o estágio de blastocisto para embriões humanos cultivados in vitro. De modo geral, independentemente do dia da transferência, tais critérios parecem apresentar valor preditivo de viabilidade embrionária quando avaliados individualmente ou coletivamente. No entanto, a subjetividade da avaliação morfológica, bem como a ampla diversidade de sistemas de classificação embrionária aplicados por diferentes clínicas, implica em resultados contraditórios, tornando extremamente difícil a implementação de um consenso do valor preditivo dos diferentes parâmetros morfológicos avaliados. A otimização da seleção embrionária representa um grande potencial de aumento das taxas de sucesso do tratamento, além de possibilitar a realização da transferência de um número reduzido de embriões, minimizando os riscos derivados de estações múltiplas.

Viabilidade celular da fração mononuclear da medula óssea e fração vascular estromal do tecido adiposo de equinos após o processo de congelamento e descongelamento

Cinco cavalos adultos foram submetidos à coleta de medula óssea do esterno e de tecido adiposo da região glútea. As amostras foram processadas para obtenção da fração mononuclear da medula óssea e fração vascular estromal do tecido adiposo, o número de células obtidas e a viabilidade celular foram determinados. Em seguida, realizou-se o congelamento das amostras em solução contendo 20% de soro fetal bovino e 10% de dimetilsulfóxido. Depois de um mês, realizou-se o descongelamento das amostras e a viabilidade celular foi novamente mensurada. Os resultados revelaram que as técnicas utilizadas tanto para coleta de medula óssea quanto de tecido adiposo em equinos são simples, rápidas e seguras. As metodologias adotadas para o processamento das amostras foram eficientes, obtendo-se aproximadamente 95% de viabilidade celular. Após o descongelamento, a viabilidade média das amostras de células mononucleares da medula óssea foi de 86% e da fração vascular estromal do tecido adiposo de 64%. Frente à importância da terapia celular na clínica médica de equinos, concluiu-se que é necessária a realização de mais estudos, visando padronizar uma técnica de criopreservação que mantenha a integridade das células da fração mononuclear da medula óssea e da fração vascular estromal do tecido adiposo de equinos.

Características do sêmen a fresco e descongelado de garanhões da raça Nordestina

RESUMO: Este estudo descreveu as características seminais, da membrana plasmática e do acrossoma de espermatozoide congelado/descongelado de 19 ejaculados de garanhões da raça Nordestina. Os aspectos analisados incluíram os parâmetros físicos do sêmen fresco; a motilidade e a longevidade do sêmen diluído e descongelado; a morfologia espermática, integridade funcional e estrutural da membrana plasmática do espermatozoide e a habilidade de ligação do espermatozoide à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha do sêmen descongelado. As variáveis foram avaliadas pela ANOVA com post hoc teste de Student Newman-Keuls (P<0,05). A MT e a MP foram maiores (P<0,05) no sêmen diluído do que no descongelado. A percentagem média de defeitos maiores, menores e totais foi muito inferior ao limite recomendado pelo CBRA. A porcentagem de reativos ao HOST foi de 14,21±1,12% e a porcentagem média de membranas íntegras detectadas pelo teste supravital de 62,22±9,06% e pela sonda SYBR-14 de 81,47±26,90. O número médio de espermatozoides ligados à MPV após a descongelação do sêmen foi de 230,39±57,09. A MT e MP no tempo 0 min do TTR foi superior (P<0,05) em relação a 150 min, não diferindo nos tempos 10 min e 30 min. Os resultados demonstram que a utilização dos testes laboratoriais adicionais ajudam no processo de avaliação das amostras, possibilitando a obtenção de informações mais confiáveis e precisas. Embora a criopreservação tenha provocado queda na motilidade seminal, o uso de diluidor contendo amidas minimizou os danos osmóticos nas células espermáticas e manteve a integridade morfológica, funcional e estrutural da membrana plasmática do espermatozoide. Estes resultados são um referencial em estudos futuros uma vez que, inexistem dados comparativos nesta raça.

Abordagem da oclusão trombótica dos cateteres de longa permanência dos pacientes em hemodiálise: uma revisão narrativa

ResumoAtualmente, cateteres venosos permanentes (CVCp) estão se tornando cada vez mais uma alternativa de acesso vascular de longa permanência para pacientes nos quais o acesso arteriovenoso não pode ser confeccionado, sendo a oclusão trombótica complicação mecânica comum. Essa complicação pode ocasionar mudanças frequentes dos locais de cateter, eliminando os sítios vasculares. Este estudo teve como objetivo realizar uma revisão narrativa do manejo da oclusão trombótica de CVCp na população em HD. O tratamento da trombose de CVC consiste em infusão de solução salina ou na administração de trombolíticos como plasminogênio tecidual ativado, reteplase ou uroquinase. Há poucos estudos sobre o uso de alteplase em CVCp obstruídos na população em diálise, e todos eles relatam sucesso entre 80 a 95% dos casos com uso de trombolítico na dose de 1 mg/ml. Por tratar-se de medicamento de custo elevado, estudos sugerem que a criopreservação e o fracionamento da alteplase tornam o uso financeiramente viável.