Aspidosperma (Apocynaceae) plant cytotoxicity and activity towards malaria parasites. Part II: experimental studies withAspidosperma ramiflorum in vivo and in vitro

Several species of Aspidosperma plants are used to treat diseases in the tropics, including Aspidosperma ramiflorum, which acts against leishmaniasis, an activity that is experimentally confirmed. The species, known as guatambu-yellow, yellowperoba, coffee-peroba andmatiambu, grows in the Atlantic Forest of Brazil in the South to the Southeast regions. Through a guided biofractionation of A. ramiflorum extracts, the plant activity against Plasmodium falciparum was evaluated in vitro for toxicity towards human hepatoma G2 cells, normal monkey kidney cells and nonimmortalised human monocytes isolated from peripheral blood. Six of the seven extracts tested were active at low doses (half-maximal drug inhibitory concentration < 3.8 µg/mL); the aqueous extract was inactive. Overall, the plant extracts and the purified compounds displayed low toxicity in vitro. A nonsoluble extract fraction and one purified alkaloid isositsirikine (compound 5) displayed high selectivity indexes (SI) (= 56 and 113, respectively), whereas compounds 2 and 3 were toxic (SI < 10). The structure, activity and low toxicity of isositsirikine in vitro are described here for the first time in A. ramiflorum, but only the neutral and precipitate plant fractions were tested for activity, which caused up to 53% parasitaemia inhibition of Plasmodium bergheiin mice with blood-induced malaria. This plant species is likely to be useful in the further development of an antimalarial drug, but its pharmacological evaluation is still required.

Tolerância de estirpes e isolados de Bradyrhizobium e de Azorhizobium a zinco, cádmio e cobre "in vitro"

Com o objetivo de avaliar a tolerância a metais pesados "in vitro" de estirpes inoculantes (I), isolados de solos contaminados com metais (ISC) e de solos não contaminados (ISNC) de Bradyrhizobium, simbiontes de Enterolobium contortisiliquum (tamboril) e de Acacia mangium (acácia) e de Azorhizobium, simbiontes de Sesbania virgata (sesbânia), foram realizados dois experimentos. No primeiro, dez estirpes e, ou, isolados para cada espécie vegetal foram testados em meio YMA modificado por adição de tampões biológicos (HEPES e MES), suplementado com diferentes concentrações de Cu, Cd e Zn. Cobre e Cd foram testados em concentrações de 0 a 40 mg L-1, para ambos os gêneros, enquanto Zn variou de 0 a 1.000 mg L-1, para Bradyrhizobium, e de 0 a 500 mg L-1, para Azorhizobium. O crescimento de rizóbio nas diferentes concentrações de metais foi avaliado com atribuição de valores para os padrões observados (0 a 5). Os ISC de ambos os gêneros foram mais tolerantes, mas Bradyrhizobium tolerou Zn (800 mg L-1) até duas vezes e Cu (40 mg L-1) até oito vezes mais que Azorhizobium. No segundo experimento, estirpes e isolados tolerantes (T), sensíveis (S) e de tolerância média (TM) a metais selecionados em meio YMA modificado foram estudados em soluções aquosas com diferentes concentrações de Cu (0 a 0,01 mg L-1), Cd e Zn (0 a 1,0 mg L-1). A avaliação do número de células viáveis em soluções de metais foi feita por contagem das unidades formadoras de colônia em 0, 24, 48, 72 e 96 h de incubação, pelo método das diluições sucessivas e inoculação em YMA. Embora as soluções de metais tenham sido mais discriminatórias quanto a tolerância a metais que o meio YMA, estes dois métodos mostraram que: (a) Azorhizobium foi mais sensível que Bradyrhizobium, (b) os ISC de ambos os gêneros foram mais tolerantes do que os ISNC e (c) a ordem de toxidez dos metais foi Cu > Cd > Zn.

Manganês e germinação de esporos de fungos micorrízicos arbusculares in vitro

A alta disponibilidade de íons metálicos no solo, dentre eles o Mn2+, pode inibir os fungos micorrízicos arbusculares (FMA), retardando a germinação dos esporos e, conseqüentemente, a formação de micorriza, o que reduz a eficiência simbiótica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do íon Mn2+ sobre a germinação de esporos de seis espécies de FMA dos gêneros Glomus, Acaulospora, Gigaspora e Scutellospora em experimento in vitro Em substrato constituído por areia lavada, adicionaram-se 15; 30 e 75 mg kg-1 de Mn2+, na forma de MnCl2.4H2O, mantendo-se um controle sem adição de Mn. Acondicionaram-se os esporos em envelopes membranosos, introduzindo-os entre duas camadas de areia com diferentes níveis de Mn, em placas de Petri. Após 30 dias de incubação, avaliou-se a germinação dos esporos. Houve decréscimo médio de 32, 49 e 75 % na germinação dos esporos, à medida que se aumentaram as doses de Mn, em comparação ao controle. A germinação de esporos do gênero Glomus foi totalmente inibida na maior dose. O gênero Acaulospora sofreu decréscimos de até 50 % já na dose de 15 mg kg-1 de Mn2+, enquanto os gêneros Scutellospora e Gigaspora apresentaram os maiores índices de germinação de esporos, tendo havido tolerância no caso de Gigaspora, mesmo na maior dose de Mn2+, e estímulo à germinação no caso de Scutellospora até à dose 30 mg kg-1 de Mn2+.

Indução in vitro da germinação de sementes de Oncidium flexuosum (Orchidaceae) por fungos micorrízicos rizoctonióides

A germinação de sementes e o desenvolvimento de protocórmios de Oncidium flexuosum (Orchidaceae) induzidos simbioticamente são descritos pela primeira vez. As sementes de O. flexuosum foram inoculadas com dez fungos micorrízicos rizoctonióides, previamente isolados de micorrizas de dez espécies de orquídeas neotropicais do Brasil, incluindo O. flexuosum. Foram utilizados um isolado pertencente à espécie Epulorhiza repens, dois pertencentes à Epulorhiza epiphytica, seis de Ceratorhiza spp. e um de Rhizoctonia sp. Sementes inoculadas com o isolado M2 de Ceratorhiza sp., originalmente isolado do sistema radicular de O. flexuosum em habitat natural, promoveu a germinação das sementes em sete dias e em, aproximadamente, 30 % das plântulas, houve formação de folhas após 50 dias de incubação, apresentando pelotons em algumas células do protocórmio e das radicelas. Os demais isolados promoveram a germinação das sementes; entretanto, não promoveram um desenvolvimento ótimo dos protocórmios. Sementes incubadas na ausência de fungos micorrízicos não germinaram. A especificidade e a alta dependência de O. flexuosum pela associação micorrízica ficaram claras. Aspectos relativos à especificidade, anatomia da interação fungo-planta e a importância da seleção de estirpes fúngicas, previamente ao uso de fungos micorrízicos para o cultivo simbiótico a partir de sementes de O. flexuosum são discutidos.

Molecular Identification of Trichoderma spp. in Garlic and Onion Fields and In Vitro Antagonism Trials on Sclerotium cepivorum

ABSTRACT Trichoderma species are non-pathogenic microorganisms that protect against fungal diseases and contribute to increased crop yields. However, not all Trichoderma species have the same effects on crop or a pathogen, whereby the characterization and identification of strains at the species level is the first step in the use of a microorganism. The aim of this study was the identification – at species level – of five strains of Trichoderma isolated from soil samples obtained from garlic and onion fields located in Costa Rica, through the analysis of the ITS1, 5.8S, and ITS2 ribosomal RNA regions; as well as the determination of their individual antagonistic ability over S. cepivorum Berkeley. In order to distinguish the strains, the amplified products were analyzed using MEGA v6.0 software, calculating the genetic distances through the Tamura-Nei model and building the phylogenetic tree using the Maximum Likelihood method. We established that the evaluated strains belonged to the species T. harzianum and T. asperellum; however it was not possible to identify one of the analyzed strains based on the species criterion. To evaluate their antagonistic ability, the dual culture technique, Bell’s scale, and the percentage inhibition of radial growth (PIRG) were used, evidencing that one of the T. asperellum isolates presented the best yields under standard, solid fermentation conditions.

Efeito de auxinas sintéticas no enraizamento in vitro da macieira

Brotações de macieira (Malus domestica, Borkh), cv. Fred Hough, oriundas do processo de multiplicação in vitro, foram inoculadas em meio MS e MS/2, testando-se os reguladores de crescimento: ácido indol-3-acético (AIA); ácido indolbutírico (AIB) e ácido naftaleno acético (ANA), nas concentrações de 0, 1, 3 e 5 miM com o objetivo de observar o efeito dessas auxinas sobre o enraizamento da cultivar. Foram acrescentadas aos meios as vitaminas MS mio-inositol (100 mg/L) e sacarose (30 g/L) em meio de ágar (6 g/L). O pH do meio foi ajustado para 5,8 e a cultura foi incubada a 25 ± 2º C e 16 horas de fotoperíodo a 2.000 lux, permanecendo por 30 dias. Os tratamentos foram repetidos cinco vezes e cada repetição constou de cinco explantes inoculados em frasco de 250 mL contendo 40 mL do meio. O meio MS/2 em todas as concentrações testadas foi melhor que o MS. O ANA e o AIB, ambos na concentração de 3 miM, em meio MS/2, tiveram comportamento semelhante na porcentagem de enraizamento e no número de raízes produzidas; no entanto, o ANA provocou efeitos indesejáveis na qualidade destas, havendo formação de calo na base das brotações e raízes grossas. O AIA obteve melhor resposta nas altas concentrações, mas não foi melhor que o AIB e ANA.

Absorção de macronutrientes por explantes de bananeira in vitro

Com o objetivo de estudar a absorção de macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg e S) em explantes de bananeira cv. Prata Anã, foram utilizados explantes de plantas estabelecidas in vitro, inoculados em meio básico de Murashige & Skoog (1962) contendo sacarose (30 g/L), e BAP (3,5 mg/L) com sete tratamentos, representados pelos períodos de 0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 dias de cultivo e três repetições. As quantidades de macronutrientes totais absorvidas pelos explantes seguiram a ordem: K > N > Ca > ou = P > Mg @ S. O P foi o nutriente absorvido mais rapidamente pelos explantes, com 75% extraído do meio de cultivo nos primeiros 30 dias, cessando sua absorção aos 50 dias, restando ainda 9% no meio de cultivo. A absorção do S cessou também aos 50 dias, quando 66% deste nutriente ainda permanecia no meio de cultivo. Este resultado sugere haver uma relação, quanto à absorção, entre esses dois nutrientes. As maiores taxas de absorção de todos os nutrientes foram verificadas nos primeiros 20 dias. O rizoma, o pseudocaule e as folhas, se diferenciaram quanto à concentração e extração ou acúmulo de nutrientes.

Absorção de micronutrientes por explantes de bananeira in vitro

Foi estudada a absorção dos micronutrientes B, Cu, Fe, Mn e Zn em explantes de bananeira (Musa sp.), cultivar Prata Anã em meio básico de Murashige & Skoog suplementado com 30g/L de sacarose e 3,5mg/L de BAP. O experimento foi realizado em delineamento completamente casualizado, com três repetições. Na matéria seca dos propágulos inteiros, rizomas, pseudocaules e folhas foram avaliadas a concentração e extração de nutrientes, e, no meio de cultivo, a quantidade remanescente aos 0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 dias. A maior quantidade de micronutrientes extraída pelos propágulos foi observada nos primeiros 20 dias, exceto no tocante ao Mn, que foi aproximadamente constante durante todo o período. O Fe e o Cu foram os micronutrientes absorvidos em maior e menor quantidade, respectivamente. As concentrações de B, Zn, Mn, e Cu remanescentes no meio de cultivo aos 60 dias foram de 52, 61, 77 e 78%, respectivamente, o que sugere que podem ser reduzidas no meio básico MS para o cultivo de explantes de bananeira.

ANATOMICAL STUDIES OF IN VITRO ORGANOGENESIS INDUCED IN LEAF-DERIVED EXPLANTS OF PASSIONFRUIT

With the aim of studying the organogenesis in vitro in Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg., the passionfruit, leaf-derived explants were cultured on media containing NAA or BAP and incubated either in continuous darkness or in light. The histological events leading to de novo organ formation were evaluated. Darkness induces rhizogenesis in the presence of NAA, whereas direct shoot regeneration is stimulated by light and BAP. This latter condition is recommended for passionfruit micropropagation as several adventitious shoot buds were formed from meristemoids of parenchymal origin.

Efeito da sacarose e do benomyl na multiplicação in vitro da macieira

Objetivou-se estudar o efeito de diferentes concentrações de sacarose e benomyl na multiplicação in vitro de macieira (Malus prunifolia Willd, Borkh). O meio de cultura utilizado foi o MS, acrescido de 1 mg L-1 de BAP. O benomyl foi prejudicial à multiplicação da macieira em relação às variáveis estudadas. Concentrações de 30 a 45 g L-1 de sacarose propiciaram maior número de brotações e número de gemas. O comprimento dos brotos foi favorecido com 45 g L-1 de sacarose. As melhores respostas quanto à coloração das brotações foram obtidas com a adição de 15 a 30 g L-1 de sacarose.

Efeitos de ácido giberélico e carvão ativado no cultivo in vitro de Citrus limonia Osbeck chiPoncirus trifoliata (L.) Raf

Pesquisou-se o desenvolvimento in vitro de embriões de um híbrido do cruzamento Citrus limonia Osb. chi Poncirus trifoliata (L.) Raf. em meio MS, acrescido de GA3 (0,0, 0,01, 0,1 e 1,0 mg/L) e carvão ativado (0,0, 0,5, 1,0 e 2,0 g/L), em todas as combinações possíveis. Após a excisão das sementes os embriões obtidos, independentemente dos estádios, foram inoculados nos respectivos meios de cultura. Cada tratamento permaneceu por 48 horas no escuro e 40 dias em sala de crescimento à temperatura de 27 ± 1ºC, com 16 horas de luminosidade. Após esse período, as plântulas foram avaliadas, considerando-se o porcentual de sobrevivência e comprimento da haste caulinar e do sistema radicular. Verificou-se que a concentação de 0,1 mg/L de GA3 interagiu antagonicamente em meio de cultivo contendo até 2,0 g/L de carvão ativado. O GA3 a 0,01 mg/L associado a concentrações de carvão ativado a partir de 0,5 g/L até 2,0 g/L, maximizou o porcentual de sobrevivência dos em- briões. Os embriões apresentaram o maior comprimento de raiz (4,5 cm) e da haste caulinar (2,1 cm) com carvão ativado na concentração de 0,5 g/L e 2,0 g/L, respectivamente.

Embriogênese somática in vitro em couve-comum

O objetivo deste estudo foi obter calos e embriões somáticos de couve-comum (Brassica oleracea L., var. leucocephala) e caracterizá-los por meio de observações histológicas. Foram cultivadas, in vitro, explantes foliares, sob condições assépticas, em meio nutritivo MS, suplementado com várias combinações entre 2,4-D/BAP e 2,4-D/KIN. Na fase de indução de calos (fase I), houve o desenvolvimento de calos com características embriogênicas nos meios suplementados com 5,0 mg/L de 2,4-D; 1,0 mg/L de 2,4-D e 0,1 mg/L de BAP; 1,0 mg/L de 2,4-D e 1,0 mg/L de BAP e 2,0 mg/L de 2,4-D e 0,05 mg/L de BAP, que foram selecionados para o subcultivo em meio de regeneração (fase II). Nesta fase, foram utilizados meios de cultura suplementados com reduzidas concentrações de 2,4-D, BAP e AG3, ou totalmente desprovidos destes, em que os calos permaneceram por mais 30 dias em cultivo. Os calos subcultivados nos meios de regeneração com 0,1 mg/L de BAP (R3) e 0,01 e 0,001 mg/L de BAP e 2,4-D respectivamente (R8), provenientes dos meios para indução, acrescidos de 5,0 mg/L de 2,4-D (M16) e 1,0 e 1,0 mg/L de BAP e 2,4-D (M30), desenvolveram estruturas semelhantes a embriões. No entanto, a caracterização histológica revelou a superioridade da interação entre os meios M30 e R8, para a regeneração de calos e embriões somáticos.

Establishment of an in vitro system for studies on the induced resistance of cotton to Xanthomonas campestris pv. malvacearum

An in vitro system for studying the resistance response of cotton (Gossypium hirsutum L.) to Xanthomonas campestris pv. malvacearum was investigated. Cell suspension cultures, established from hypocotyl-derived callus of cotton cultivar 101-102B, were treated with bacterial extracellular polysaccharides (EPS) extracted from the incompatible race 18 of X. campestris pv. malvacearum. EPS at 600 mug/mL caused pronounced darkening of the suspension cultures, as indicative of cell death, 48 hours after incubation. Protein electrophoresis analysis of the time course of EPS-treated cells showed differential accumulation of several protein bands after 12-24 hours. The time course of protein accumulation and cell death was consistent with an elicitor-mediated hypersensitive response.

Resposta in vitro e suscetibilidade ao Agrobacterium de duas cultivares de Stylosanthes guianensis

As cultivares Bandeirantes e Mineirão de Stylosanthes guianensis (Leguminosae) foram avaliadas quanto à capacidade de formação de brotos adventícios in vitro e quanto à suscetibilidade ao Agrobacterium. Para obter regeneração, foram utilizados vários tipos de explantes, e o meio basal MS foi suplementado com diferentes concentrações de ácido naftalenoacético (NAA) e 6-benzilanimopurina (BAP). Observou-se regeneração de brotos a partir de explantes cotiledonares e hipocotiledonares, nas duas cultivares. O Stylosanthes mostrou-se suscetível ao Agrobacterium selvagem, pois a formação de tumores foi induzida. Expressão transiente do gene uidA foi observada em tecidos infectados de Stylosanthes. Experimentos sobre a ação dos antibióticos cefotaxima e tetraciclina, usados em ensaios de transformação para eliminação do Agrobacterium, mostraram que a cefotaxima (250 µg mL-1) tende a reduzir a regeneração de brotos em explantes da cv. Bandeirantes.

Avaliação da capacidade de regeneração in vitro em tomateiro industrial

Este trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade de regeneração das cultivares de tomateiro industrial (Lycopersicon esculentum Mill) IPA-5 e IPA-6, utilizando quatro composições de meio de cultura descritos na literatura e cinco variações de inoculação. Foi testada uma nova variação de inoculação, denominada cotilédone fendido. A maior freqüência de formação de gemas vegetativas foi 100% no caso de IPA-5, e 65% no caso de IPA-6. Para induzir o alongamento de brotos, foram necessários três subcultivos dos explantes apresentando gemas. No caso de IPA-5, o número de brotos obtidos foi maior quando a indução de gemas foi realizada em meio contendo BAP (2,5 mg L-1) e AIA (0,2 mg L-1) seguido de três subcultivos, em meio como zeatina (0,5 mg L-1). Usando esse protocolo, a cultivar IPA-5 produziu uma média de 5,45 brotos alongados a partir do cotilédone fendido. Essa capacidade excedeu significativamente o cotilédone aparado, que produziu 4,4 brotos alongados por explante. No caso de IPA-6, a melhor combinação de meios e método de inoculação produziu 0,87 broto alongado por explante. Os brotos alongados foram enraizados e transferidos para casa de vegetação.