Identifica����o por PCR dos alelos-S associados �� compatibilidade gametof��tica em ameixeira japonesa

O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar molecularmente os alelos-S de cultivares de ameixeira japonesa e verificar a compatibilidade gametof��tica entre estes. Foram utilizados dois pares de iniciadores espec��ficos na amplifica����o dos alelos via PCR, em 18 cultivares: Pluma 7, Gulf Rubi, Blood Plum, Wickson, Am��rica, Santa Rosa, Rosa Mineira, Estrela P��rpura, Amarelinha, The First, Harry Pieckstone, Santa Rita, Sele����o 16, Sele����o A26 (Burbank), Sele����o 21, Sele����o 19, Methley e Simka. As condi����es da PCR e as combina����es de oligonucleot��deos iniciadores utilizadas permitiram a identifica����o de alelos-S nas cultivares, bem como a indica����o dos polinizadores mais compat��veis. As cultivares Am��rica e Santa Rosa, bem como Blood Plum, Wickson, Rosa Mineira, Estrela P��rpura e Sele����o 21 apresentam incompatibilidade total entre si, por compartilharem os mesmos alelos.

EXTRA����O DE DNA GEN��MICO DE Passiflora spp. PARA AN��LISES PCR-RAPD

A identifica����o e caracteriza����o da diversidade gen��tica de plantas por meio de t��cnicas moleculares envolvem a avalia����o de v��rios indiv��duos, necessitando-se, portanto, de m��todos r��pidos e precisos de extra����o do DNA. O co-isolamento de polissacar��deos, fen��is e compostos secund��rios �� o principal problema encontrado no isolamento e purifica����o de DNA vegetal. Folhas das diversas esp��cies de Passiflora possuem n��veis variados desses compostos que podem comprometer este procedimento. O presente estudo foi realizado com o objetivo de avaliar a qualidade e quantidade de DNA de folhas de variedades de Passiflora spp., utilizando-se de tr��s m��todos de extra����o. Os tr��s m��todos forneceram DNA em qualidade e quantidade suficientes para a realiza����o da t��cnica PCR-RAPD.

RT-PCR and Dot Blot hybridization methods for a universal detection of tospoviruses

Transcriptase reverse - polymerase chain reaction (RT-PCR) and dot blot hybridization with digoxigenin-labeled probes were applied for the universal detection of Tospovirus species. The virus species tested were Tomato spotted wilt virus, Tomato chlorotic spot virus, Groundnut ringspot virus, Chrysanthemum stem necrosis virus, Impatiens necrotic spot virus, Zucchini lethal chlorosis virus, Iris yellow spot virus. Primers for PCR amplification were designed to match conserved regions of the tospovirus genome. RT-PCR using distinct primer combinations was unable to simultaneously amplify all tospovirus species and consistently failed to detect ZLCV and IYSV in total RNA extracts. However, all tospovirus species were detected by RT-PCR when viral RNA was used as template. RNA-specific PCR products were used as probes for dot hybridization. This assay with a M probe (directed to the G1/G2 gene) detected at low stringency conditions all Tospovirus species, except IYSV. At low stringency conditions, the L non-radioactive probe detected the seven Tospovirus species in a single assay. This method for broad spectrum detection can be potentially employed in quarantine services for indexing in vitro germplasm.

Identifica����o de xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e x. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans atrav��s da t��cnica de pcr

Este trabalho teve por objetivo verificar a viabilidade de utiliza����o da t��cnica de PCR, usando primers considerados espec��ficos, para identifica����o de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) e x. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf), visando criar bases para sua utiliza����o em diagnose rotineira e em programas de certifica����o de sementes. Foram inclu��dos no estudo 42 isolados da bact��ria provenientes de locais distintos, al��m de outros g��neros, esp��cies e patovares, para ser verificada a especificidade dos primers. Os resultados obtidos permitem concluir que os primers utilizados s��o adequados para identifica����o de Xap e Xapf, embora dois isolados patog��nicos n��o tenham sido amplificados. Foi observada tamb��m a amplifica����o de uma banda fraca para X. axonopodis pv. vitians, com o mesmo n��mero de pares de bases, o que sugere existir homologia entre estes patovares, na regi��o amplificada.

RT-PCR-ELISA for detection of Apple stem grooving virus in apple trees

A method to detect Apple stem grooving virus (ASGV) based on reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was developed using primers ASGV4F-ASGV4R targeting the viral replicase gene, followed by a sandwich hybridisation, in microtiter plates, for colorimetric detection of the PCR products. The RT-PCR was performed with the Titan™ RT-PCR system, using AMV and diluted crude extracts of apple (Malus domestica) leaf or bark for the first strand synthesis and a mixture of Taq and PWO DNA polymerase for the PCR step. The RT-PCR products is hybridised with both a biotin-labelled capture probe linked to a streptavidin-coated microtiter plate and a digoxigenin (DIG)-labelled detection probe. The complex was detected with an anti-DIG conjugate labelled with alkaline phosphatase. When purified ASGV was added to extracts of plant tissue, as little as 400 fg of the virus was detected with this method. The assay with ASGV4F-ASGV4R primers specifically detected the virus in ASGV-infected apple trees from different origins, whereas no signal was observed with amplification products obtained with primers targeting the coat protein region of the ASGV genome or with primers specific for Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) and Apple stem pitting virus (ASPV). The technique combines the power of PCR to increase the number of copies of the targeted gene, the specificity of DNA hybridization, and the ease of colorimetric detection and sample handling in microplates.

Print-capture PCR for detection of tomato begomoviruses from plants and whiteflies

Print-capture (PC) Polymerase chain reaction (PCR) was evaluated as a novel detection method of plant viruses. Tomato (Lycopersicon esculentum) plants infected with begomovirus (fam. Geminiviridae, gen. Begomovirus) and viruliferous whiteflies were used to study the efficiency of the method. Print-capturing steps were carried out using non-charged nylon membrane or filter paper as the solid support for DNA printings. Amplified DNA fragments of expected size were consistently obtained by PCR from infected plants grown in a greenhouse, after direct application of printed materials to the PCR mix. However, virus detection from a single whitefly and from field-grown tomato samples required a high temperature treatment of printed material prior to PCR amplification. Comparison of nylon membrane and filter paper as the solid support revealed the higher efficiency of the nylon membrane. The application of print-capture PCR reduces the chances of false-positive amplification by reducing manipulation steps during preparation of the target DNA. This method maintains all the advantages of PCR diagnosis, such as the high sensitivity and no requirement of radioactive reagents.

Molecular characterization of Brazilian strains of Xanthomonas campestris pv. viticola by rep-PCR fingerprinting

Bacterial canker of grapevine (Vitis vinifera), caused by Xanthomonas campestris pv. viticola was first detected in Brazil in 1998, affecting grapevines in the S��o Francisco river basin, state of Pernambuco. The disease was also reported in Juazeiro, Bahia and later in Piau�� and Cear��. Due to its limited geographical distribution and relatively recent detection in Brazil, very little is known about the pathogen's biology and diversity. Repetitive DNA based-PCR (rep-PCR) profiles were generated from purified bacterial DNA of 40 field strains of X. campestris pv. viticola, collected between 1998 and 2001 in the states of Pernambuco, Bahia and Piau��. Combined analysis of the PCR patterns obtained with primers REP, ERIC and BOX, showed a high degree of similarity among Brazilian strains and the Indian type strain NCPPB 2475. Similar genomic patterns with several diagnostic bands, present in all strains, could be detected. Fingerprints were distinct from those of strains representing other pathovars and from a yellow non-pathogenic isolate from grape leaves. The polymorphism observed among the Brazilian strains allowed their separation into five subgroups, although with no correlation with cultivar of origin, geographic location or year collected.

Caracteriza����o de estirpes de Ralstonia solanacearum isoladas de plantas de batata com murcha bacteriana, por PCR-Rep e RAPD

Considerado como um dos mais s��rios pat��genos da batata (Solanum tuberosum), em regi��es de clima tropical, subtropical, assim como em zonas mais quentes de clima temperado, Ralstonia solanacearum �� uma esp��cie com significativa diversidade gen��tica. Ela �� caracterizada em um sistema bin��rio de ra��as e biovares, com base nas esp��cies hospedeiras e na capacidade de utilizar diferentes fontes de carbono. A tentativa de utilizar a resist��ncia gen��tica como forma de controle de R. solanacearum n��o tem demonstrado estabilidade, devido a altera����es clim��ticas nas diferentes regi��es e a variabilidade das estirpes do pat��geno. Devido ��s caracter��sticas epidemiol��gicas diferentes para essas biovares, estirpes da biovar 2 s��o mais fact��veis de serem erradicadas em um sistema de controle integrado. Em um levantamento realizado em quatro regi��es produtoras de batata do Rio Grande do Sul, foram obtidos isolados de R. solanacearum de 25 lavouras de dez munic��pios. Ap��s a an��lise bioqu��mica dos isolados verificou-se a presen��a das biovares 1 e 2, com predomin��ncia da ��ltima. Os isolados obtidos foram submetidos �� avalia����o da variabilidade gen��tica por PCR, utilizando seq����ncias repetitivas ERIC e BOX e oligonucleot��deos aleat��rios (RAPD). A PCR-ERIC e BOX puderam diferenciar claramente as biovares 1 e 2. Por��m, ambas n��o detectaram variabilidade entre isolados da biovar 2 e apenas PCR-BOX detectou variabilidade entre isolados da biovar 1. J�� atrav��s de RAPD demonstrou-se claramente a separa����o das biovares verificando-se que os mesmos apresentam um perfil caracter��stico dependente da regi��o da qual os isolados foram obtidos.

Identifica����o de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis atrav��s de PCR-RFLP do gene recA

Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis foi proposta como o principal agente causal da canela preta da batata (Solanum tuberosum) no Brasil. Com o objetivo de identificar essa subesp��cie, oligonucleot��deos iniciadores foram selecionados a partir de regi��es heter��logas do gene recA existentes entre P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-41 e outras pectobact��rias dispon��veis no GenBank e P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1. No entanto, os oligonucleot��deos iniciadores apresentaram baixa especificidade. O produto da PCR do gene recA, um fragmento de �� 730 pb, de 38 estirpes de P. chrysanthemi e das diferentes subesp��cies de P. carotovorum, foi digerido com as endonucleases de restri����o TasI e HhaI. Estas enzimas foram selecionadas com base na seq����ncia do gene recA das estirpes P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416 (581 pb) e P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1 (626 pb). A an��lise do PCR-RFLP com as enzimas TasI e HhaI gerou sete e 12 padr��es, respectivamente. A combina����o dos resultados permitiu a separa����o em 13 grupos distintos e a discrimina����o de P. carotovorum subsp. brasiliensis.

Virulence and rep-PCR analysis of Pyricularia grisea isolates from two Brazilian upland rice cultivars

The phenotypic and genetic diversity of 77 isolates of Pyricularia grisea collected from two upland rice cultivars, Maravilha and Primavera, was studied. Isolates exhibiting compatible reaction to cv.Primavera were incompatible to cv.Maravilha and vice versa, with the exception of six isolates that were compatible to both cultivars. The virulence of isolates from cv. Maravilha on 32 test genotypes of rice was significantly higher (t = 9.09, p < 0.0001) than the isolates from cv.Primavera. A phenogram constructed from virulence data showed two main groups, one constituted mainly of isolates from cv.Primavera (97.6%) and the other of isolates from cv.Maravilha (91.17%). Rep-PCR analysis of isolates using two primers designed from sequences of Pot2 showed that isolates could be clustered broadly into two groups. The average similarity within a cluster of isolates from cv.Primavera was significantly greater than the average similarity among the isolates of cv.Maravilha (t = 5.37, p < 0.0001). There was close correspondence between clusters based on PCR and virulence data (r = 0.48, p < 0.011). The results showed that isolates of P. grisea were cultivar specific and had low phenotypic and genetic diversity.

PCR amplification and sequence analyses of reverse transcriptase-like genes in Crinipellis perniciosa isolates

Reverse transcriptase (RT) sequence analysis is an important technique used to detect the presence of transposable elements in a genome. Putative RT sequences were analyzed in the genome of the pathogenic fungus C. perniciosa, the causal agent of witches' broom disease of cocoa. A 394 bp fragment was amplified from genomic DNA of different isolates of C. perniciosa belonging to C-, L-, and S-biotypes and collected from various geographical areas. The cleavage of PCR products with restriction enzymes and the sequencing of various RT fragments indicated the presence of several sequences showing transition events (G:C to A:T). Southern blot analysis revealed high copy numbers of RT signals, forming different patterns among C-, S-, and L-biotype isolates. Sequence comparisons of the predicted RT peptide indicate a close relationship with the RT protein from thegypsy family of LTR-retrotransposons. The possible role of these retrotransposons in generating genetic variability in the homothallic C. perniciosa is discussed.

PCR multiplex para a detec����o de BSV e CMV em bananeiras micropropagadas

Um protocolo de PCR multiplex foi estabelecido para a detec����o do Banana streak virus (BSV) e do Cucumber mosaic virus (CMV) em bananeiras micropropagadas. Estes v��rus s��o respons��veis por perdas na produ����o de bananas em todo o mundo. Alguns trabalhos descrevem a integra����o do BSV no genoma B da bananeira. Contudo, a exist��ncia de bananeiras h��bridas livres do BSV tem sido demonstrada. Ademais, determinadas estirpes do CMV n��o s��o transmitidas mecanicamente sob condi����es de laborat��rio, nem tampouco detectadas por testes sorol��gicos. Como conseq����ncia, a indexa����o de matrizes para cultura de tecido algumas vezes se mostra ineficiente. A metodologia apresentada neste trabalho sobrep��e esta dificuldade, pois se baseia na detec����o do ��cido nucl��ico viral presente em amostras foliares de bananeira. Na rea����o, foram usados os oligonucleot��deos BADNA 1A e BADNA 4, para a detec����o do BSV, e "CMV senso" e "CMV antisenso" para a detec����o do CMV. Ap��s a eletroforese foi verificada a presen��a de dois fragmentos de DNA amplificados simultaneamente, um dos quais com 597 pb correspondente ao BSV e o outro, com 488 pb, correspondente ao CMV. Este resultado indica que o PCR multiplex pode ser utilizado como uma ferramenta adicional na indexa����o do BSV e do CMV em bananeiras propagadas por cultura de tecido.

Detec����o de allexiv��rus em prim��rdios foliares de alho via RT-PCR

Nos procedimentos de detec����o de allexivirus em bulbos de alho, tem-se como rotina o plantio de bulbilhos para obten����o de tecido foliar a ser analisado via testes sorol��gicos e/ou moleculares. A disponibiliza����o das plantas em casa de vegeta����o implica em gastos com a manuten����o e requer, em m��dia, 30 dias. Em ��reas isentas desses v��rus, corre-se, ainda, o risco de sua introdu����o e dissemina����o. No presente trabalho buscou-se ajustar um protocolo para detec����o r��pida de allexiv��rus em alho a partir de prim��rdios foliares. Bulbilhos de alho para consumo, oriundos do Rio Grande do Sul e importados da Argentina foram dissecados para obten����o de prim��rdios foliares e extra����o de RNA total a partir de 0,1 g de tecido. A seguir foram conduzidas rea����es de RT-PCR com um par de oligonucleot��deos, capaz de gerar um fragmento de aproximadamente 500 pb relativo �� por����o interna do gene da capa prot��ica de v��rias esp��cies do g��nero Allexivirus. Uma banda com tamanho aproximado de 500 pb foi visualizada, em gel de agarose e, posteriormente, confirmada por Southern Blot e por seq��enciamento como sendo Garlic v��rus C (GarV-C, AY170322.1). A obten����o de RNA total diretamente de prim��rdios foliares de bulbilhos e seu uso em an��lise de RT-PCR, constituem-se em uma metodologia econ��mica, r��pida e segura para a detec����o de allexiv��rus em bulbos de alho.