Cellular immune response of Curraleiro Pé-duro and Nellore calves following Mycobacterium bovis-BCG vaccination

The present study aimed to assess the CD4, CD8 and γδ blood levels for Curraleiro Pé-duro, as well as the specific IFN-γ response after BCG vaccination using flow cytometry. The specific immune response against BCG was also evaluated by tuberculin skin test, performed before and 45 days after the vaccination. For comparison purposes, the same parameters were investigated on Nellore calves, an exotic bovine with resistance previously demonstrated. Naturally, Curraleiro Pé-duro animals had greater levels of CD4, CD8 and γδ lymphocytes (p<0.05). In response to vaccine, Curraleiro Pé-duro showed greater ability to respond specifically to BCG, generating resistance profile (Th1), evidenced by greater number of antigen specific CD4+ cells producing IFN-γ (p<0.05) and also higher tuberculin skin test reaction (p<0.05). Additionally, vaccinated Curraleiro Pé-duro calves had higher CD4 cells numbers than both Nellore control (p<0.05) and vaccinated groups (p<0.05). Curraleiro Pé-duro calves' higher basal lymphocytes blood level and stronger response in both IFN-γ and tuberculin skin test parameters probably play a positive role on protection/resistance to Mycobacterium bovis.

Teste intradérmico com proteínas recombinantes de Mycobacterium bovis como antígenos em Cavia porcellus

O teste intradérmico para o diagnóstico da tuberculose bovina utiliza derivados proteicos purificados (PPD) de Mycobacterium bovis que são capazes de induzir reações de hipersensibilidade em animais infectados. No entanto, apresenta baixa especificidade devido à ocorrência de reações cruzadas com outras micobactérias. Neste sentido, o objetivo desse trabalho foi produzir proteínas recombinantes (ESAT-6, PE13, PE5 e ESX-1) de Mycobacterium bovis e avaliá-las como antígenos em teste intradérmico utilizando Cavia porcellus como modelo, e verificar se as condições empregadas na purificação (nativa ou desnaturante) interferem no desempenho antigênico dessas proteínas. As proteínas foram testadas em Cavia porcellus previamente sensibilizados com cepa M. bovis AN5 inativada, individualmente (160 µg) ou combinadas na forma de um coquetel (40 µg cada). O coquetel de proteínas induziu reações de hipersensibilidade nos animais sensibilizados significativamente superiores (p=0,002) as observadas nos animais não sensibilizados, possibilitando diferenciação. No entanto, as proteínas isoladamente não foram capazes de promover essa diferenciação. As condições de solubilização e purificação influenciaram o desempenho antigênico da proteína ESAT-6, pois, quando produzida em condição desnaturante desencadeou reações inespecíficas nos animais não sensibilizados, enquanto que aquela produzida em condições nativas e aplicada em concentrações de 6, 12, 24 e 48µg induziu reações significativas apenas nos animais sensibilizados, confirmando o seu potencial como antígeno.

Identificação e genotipagem de Mycobacterium bovis em bovinos positivos no teste intradérmico para tuberculose em Mato Grosso do Sul

Neste estudo, realizou-se genotipagem de isolados de Mycobacterium bovis, provenientes de amostras de tecidos de bovinos positivos no teste cervical comparativo (TCC) para tuberculose em Mato Grosso do Sul, por meio da técnica de spoligotyping. Tecidos de 13 bovinos positivos, oriundos de diferentes municípios do estado, foram cultivados em meio de Stonebrink. As colônias resultantes foram submetidas à coloração de Ziehl-Neelsen e todos os isolados apresentaram características tintoriais de BAAR. Os 13 isolados de BAAR foram identificados por PCR multiplex (mPCR). O gene hsp65 foi alvo para identificação de Mycobacterium spp, a sequência de inserção IS6110 foi alvo para identificação de complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT) e a região rvd1rv2031c foi explorada para detecção de M. bovis. Os isolados micobacterianos foram genotipados pela técnica de spoligotyping. Dos 13 bovinos, sete tinham pelo menos uma lesão sugestiva de tuberculose em linfonodos retrofaríngeos, parotídeos e pulmonares ou no pulmão, e em seis não foram encontradas lesões visíveis sugestivas da doença. Na mPCR, 11/13 (84,6%) isolados foram positivos para Mycobacterium spp; 8/13 (61,5%) positivos para CMT e 7/13 (53,8%) positivos para M. bovis. Com base no spoligotyping, oito isolados de BAAR foram agrupados dentro de três diferentes agrupamentos de genótipos e uma amostra remanescente apresentou perfil único, sendo quatro isolados com padrão de espoligotipo SB0121, dois SB1145, dois SB0881 e um SB0140. A técnica de spoligotyping demonstrou que há diversidade genética entre os espoligotipos presentes no estado de Mato Grosso do Sul, embora predomine o perfil SB0121

Potencial plástico de Cabralea canjerana subsp. polytricha (Adr. Juss.) Penn. (Meliaceae) e seu papel na formação de ecótipos em áreas de cerrado e vereda, Uberlândia, MG

A formação de ecótipos em Cabralea canjerana subsp. polytricha foi estudada em áreas de cerrado e vereda de uma reserva ecológica no município de Uberlândia, MG, utilizando modelos de genética quantitativa para medida de plasticidade fenotípica. Os ecótipos foram caracterizados quanto à altura dos indivíduos, peso de frutos e sementes, número de sementes viáveis por fruto e sincronização no período de floração. Existe grande variabilidade genética para caracteres importantes na determinação do valor adaptativo da subspécie. Os genótipos respondem fenotipicamente à heterogeneidade ambiental, provocada pelo gradiente cerrado/vereda, em dois dos três caracteres observados. As respostas plásticas foram distintas entre os genótipos, quanto à direção e intensidade. Assincronia temporal de floração e o modo de ação de dispersores de sementes podem contribuir para a evolução da divergência entre ecótipos na área estudada.

Mobilização de água e conservação da viabilidade de embriões de sementes recalcitrantes de ingá (Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T. D. Pennington)

Sementes anidrobióticas (ortodoxas) podem ter seu teor de água reduzido a valores suficientemente baixos para minimizar o metabolismo e, dessa forma, manter a viabilidade por períodos prolongados. Sementes não-anidrobióticas (recalcitrantes) não perdem sua viabilidade desde que o teor de água seja mantido acima de determinados valores em que a quantidade da água ainda é elevada para manter o metabolismo ativo; no entanto, a longevidade dessas sementes é relativamente baixa. No presente trabalho procurou-se manter o teor de água dos embriões de ingá por meio do armazenamento em soluções de polietileno glicol 6000 (PEG), com potencial hídrico conhecido e pré-estabelecido, visando a prolongar a longevidade. Os resultados indicaram que embriões mantidos em substrato com solução de PEG a -2,4 MPa apresentaram germinação superior a 80% aos 90 dias de armazenamento a 10 ºC, enquanto os armazenados em substrato umedecido com água pura (0 MPa), na mesma temperatura, apresentaram germinação inferior a 60%.

Sementes recalcitrantes: intolerantes a baixas temperaturas? Embriões recalcitrantes de Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T. D. Penn. toleram temperatura sub-zero

Sementes recalcitrantes são intolerantes à dessecação e a baixas temperaturas, que são as principais formas de conservação de sementes e, portanto, são de difícil armazenamento. Inga vera subsp. affinis produz sementes denominadas recalcitrantes, uma vez que não toleram redução do teor de água para valores inferiores a 35%. Neste trabalho é demonstrada a tolerância desses embriões a temperatura de -2 ºC. Embriões de I. vera de diferentes estádios de maturação foram armazenados por até 45 dias nas temperaturas de 8 ºC a -18 ºC, com ou sem secagens prévias até -4,0 e -6,0 MPa. Os resultados permitiram observar que, embora nenhum tratamento tenha proporcionado resistância à temperatura de -18 ºC, a secagem dos embriões maduros a -4 MPa proporcionou maior tolerância à redução de temperatura até níveis de congelamento da água (-2 ºC).

Biomass and chemical composition of Nitella furcata subsp. mucronata var. mucronata f. oligospira (A. Braun) R. D. Wood (Chlorophyta, Characeae) in the littoral region of Ninféias Pond, São Paulo, Southeast Brazil

Temporal variation of Nitella furcata (Roxburgh ex Bruzelius) C. Agardh emend. R. D. Wood subsp. mucronata (A. Braun) R. D. Wood var. mucronata f. oligospira (A. Braun) R. D. Wood biomass and chemical composition were studied at the Ninféias Pond (23°38'18.9" S, 46°37'16.3" W), a mesotrophic reservoir located in the Parque Estadual das Fontes do Ipiranga Biological Reserve, Municipality of São Paulo, Southeast Brazil. Plants were collected monthly from October 1996 to October 1997 at three fixed stations of reservoir's littoral region. Charophyte biomass spatial distribution pattern did not vary significantly throughout the study period at all sampling stations. As to seasonal variation, the highest average values of the total alga biomass (98.35-266.06 g m-2 DW) were registered during the rainy season, whereas lowest values (48.86-170.56 g m-2 DW) were in the dry season. P values varied from 23.8 to 225.2 mg m-2 and C from 139 to 353 mg m-2. During the rainy season, greatest air and water temperature, rain precipitation, turbidity and dissolved inorganic nitrogen values were measured, constituting the best conditions for charophyte growth. Water temperature and nutrient availability in the reservoir played a decisive role towards growth and accumulation of algal biomass.

Microsatellite-dense genetic map: towards genome coverage in a tropical maize (Zea mays L.) population

Dense molecular genetic maps are used for an efficient quantitative trait loci (QTL) mapping and in the marker-assisted selection programs. A dense genetic map was generated with 139 microsatellite markers using 256 F2 plants generated by the crossing of two tropical maize inbred lines (L-02-03D and L-20-01F). This map presented 1,858.61 cM in length, where 10 linkage groups were found spanned, with an average interval of 13.47 cM between adjacent markers. Seventy seven percent of the maize genetic mapping bins were covered, which means an increase of 14% coverage in relation to the previous tropical maize maps. The results provide a more detailed and informative genetic map in a tropical maize population representing the first step to make possible the studies of genetic architecture to identify and map QTL and estimate their effects on the variation of quantitative traits, thus allowing the manipulation and use in tropical maize breeding programs.

Dinâmica espaço-temporal de Melocactus ernestii subsp. ernestii (Cactaceae) no Nordeste do Brasil

Melocactus ernestii Vaupel subsp. ernestii ocorre em afloramentos rochosos descontínuos no leste do Brasil. O presente estudo investigou o padrão espaço-temporal dos eventos de mortalidade e sobrevivência de plântulas da M. ernestii e a relação com as plantas perenes, a partir da utilização de parcelas, alocadas com auxílio de trenas, onde foram tomadas as coordenadas cartesianas do centróide dos estádios de desenvolvimento, com posterior análises de padrões de ponto baseado na função K de Ripley. Foram mapeados nas parcelas 686 indivíduos da M. ernestii. O padrão espacial variou em função da escala, do estádio de desenvolvimento e do grau de intemperização dos afloramentos. Os eventos de recrutamento e mortalidade foram espacialmente estruturados e influenciados por pulsos de precipitação sazonais. As plântulas emergiram a ca. 50 cm do centróide dos adultos. Das 136 plântulas monitoradas em 18 meses, 84% morreram. Os resultados mostraram que microsítios inicialmente eficazes na manutenção de sementes e promotores da germinação não necessariamente podem ser eficazes para o estabelecimento das plântulas. A magnitude das interações bióticas em ambientes estressantes é espécie-específica e indica que associação positiva entre plantas adultas e sobrevivência de plântulas não é consistente com o tempo. Este tipo de modelagem populacional permite melhor compreensão sobre o papel das interações positivas e negativas como forças estruturadoras de comunidades e pode ajudar a entender a complexidade das interações bióticas em gradientes ambientais severos.

Conservação e germinação in vitro de pólen de milho (Zea mays subsp. mays)

O armazenamento de pólen é uma importante ferramenta para programas de melhoramento de milho, permitindo preservar, sob condições artificiais, a viabilidade de gametas masculinos e ampliar as possibilidades de cruzamentos, independente da época do florescimento das variedades genitoras. O presente trabalho teve como objetivo avaliar meios de cultivo para a germinação in vitro de pólen de milho e analisar condições de conservação. Para avaliar viabilidade, foram testados seis meios de cultivo, contendo sacarose, ácido bórico, cloreto de cálcio hidratado e ágar. Para a conservação de pólen foram analisadas duas temperaturas (4 ºC e -20 ºC) e dois agentes desidratantes de pólen (sílica gel e cloreto de cálcio hidratado). Os altos valores de viabilidade do pólen no período de até 30 dias de armazenamento indicam que a desidratação em sílica gel e armazenamento a 4 ºC conservam a viabilidade de pólen de milho. O meio de cultivo que proporcionou a maior taxa de germinação in vitro foi com a composição de 0,7% de ágar, 17% de sacarose, 0,01% de ácido bórico e 0,03% de cloreto de cálcio hidratado.

A 37-kb restriction map of the human immunoglobulin lambda variable locus, VB cluster, harboring four functional genes and two non-coding Vl sequences

The human immunoglobulin lambda variable locus (IGLV) is mapped at chromosome 22 band q11.1-q11.2. The 30 functional germline v-lambda genes sequenced untill now have been subgrouped into 10 families (Vl1 to Vl10). The number of Vl genes has been estimated at approximately 70. This locus is formed by three gene clusters (VA, VB and VC) that encompass the variable coding genes (V) responsible for the synthesis of lambda-type Ig light chains, and the Jl-Cl cluster with the joining segments and the constant genes. Recently the entire variable lambda gene locus was mapped by contig methodology and its one- megabase DNA totally sequenced. All the known functional V-lambda genes and pseudogenes were located. We screened a human genomic DNA cosmid library and isolated a clone with an insert of 37 kb (cosmid 8.3) encompassing four functional genes (IGLV7S1, IGLV1S1, IGLV1S2 and IGLV5a), a pseudogene (VlA) and a vestigial sequence (vg1) to study in detail the positions of the restriction sites surrounding the Vl genes. We generated a high resolution restriction map, locating 31 restriction sites in 37 kb of the VB cluster, a region rich in functional Vl genes. This mapping information opens the perspective for further RFLP studies and sequencing

DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis from patients with and without AIDS in Rio de Janeiro

Isolates of Mycobacterium tuberculosis derived from patients with AIDS from a single hospital in Rio de Janeiro were typed using a standardized RFLP technique detecting IS6110 polymorphism. Nineteen isolates were obtained from 15 different patients. Eleven distinct IS6110 patterns were found, with 4 banding patterns shared by 2 patients. The clustering value of 53% was much higher in comparison with clustering of M. tuberculosis strains from TB patients without clinical signs for HIV infection from randomly selected health centers. We present these results as preliminary data on M. tuberculosis strain polymorphism in Brazil and on the higher risk for recent transmission amongst patients with AIDS

Expression of the Mycobacterium bovis P36 gene in Mycobacterium smegmatis and the baculovirus/insect cell system

In the present study we evaluated different systems for the expression of mycobacterial antigen P36 secreted by Mycobacterium bovis. P36 was detected by Western blot using a specific antiserum. The P36 gene was initially expressed in E. coli, under the control of the T7 promoter, but severe proteolysis prevented its purification. We then tried to express P36 in M. smegmatis and insect cells. For M. smegmatis, we used three different plasmid vectors differing in copy number and in the presence of a promoter for expression of heterologous proteins. P36 was detected in the cell extract and culture supernatant in both expression systems and was recognized by sera from M. bovis-infected cattle. To compare the expression level and compartmentalization, the MPB70 antigen was also expressed. The highest production was reached in insect cell supernatants. In conclusion, M. smegmatis and especially the baculovirus expression system are good choices for the production of proteins from pathogenic mycobacteria for the development of mycobacterial vaccines and diagnostic reagents.

Perturbation of EGF-induced MAP kinase activation by TGF-ß1

TGF-ß1 regulates both cellular growth and phenotypic plasticity important for maintaining a growth advantage and increased invasiveness in progressively malignant cells. Recent studies indicate that TGF-ß-1 stimulates the conversion of epitheliod to fibroblastoid phenotype which presumably leads to the inactivation of growth-inhibitory effects by TGF-ß1 (Portella et al. (1998) Cell Growth and Differentiation, 9: 393-404). Therefore, the investigation of TGF-ß1 signaling that leads to altered growth and migration may provide novel targets for the prevention of increased cell growth and invasion. Although much attention has been paid to TGF-ß1 responses in epithelial cells, the above studies suggest that examination of signal transduction pathways in fibroblasts are important as well. Data from our laboratory are consistent with the concept that TGF-ß1 can act as a regulatory switch in density-dependent C3H 10T1/2 fibroblasts capable of either promoting or delaying G1 traverse. The regulation of this switch is proposed to occur prior to pRb phosphorylation, namely prior to activation of cyclin-dependent kinases. The current study is concerned with the evaluation of a key cyclin (cyclin D1) which activates cdk4 and p27KIP1 which in turn inhibit cdk2 in the proliferative responses of epidermal growth factor (EGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) and their modulation by TGF-ß1. Although the molecular events that lead to elevation of cyclin D1 are not completely understood, it appears likely that activation of p42/p44MAPK kinases is involved in its transcriptional regulation. TGF-ß1 delayed EGF- or PDGF-induced cyclin D1 expression and blocked the induction of active p42/p44MAPK. The mechanism by which TGF-ß1 induces a block in p42/p44MAPK activation is being examined and the possibility that TGF-ß1 regulates phosphatase activity is being tested.

McFarland nephelometer as a simple method to estimate the sensitivity of the polymerase chain reaction using Mycobacterium tuberculosis as a research tool

Polymerase chain reaction (PCR) has been widely investigated for the diagnosis of tuberculosis. However, before this technique is applied on clinical samples, it needs to be well standardized. We describe the use of McFarland nephelometer, a very simple approach to determine microorganism concentration in solution, for PCR standardization and DNA quantitation, using Mycobacterium tuberculosis as a model. Tuberculosis is an extremely important disease for the public health system in developing countries and, with the advent of AIDS, it has also become an important public health problem in developed countries. Using Mycobacterium tuberculosis as a research model, we were able to detect 3 M. tuberculosis genomes using the McFarland nephelometer to assess micobacterial concentration. We have shown here that McFarland nephelometer is an easy and reliable procedure to determine PCR sensitivity at lower costs.