Indução de resistência em tomateiro por extratos aquosos de Lentinula edodes e Agaricus blazei contra Ralstonia solanacearum

O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito dos extratos aquosos dos cogumelos Lentinula edodes e Agaricus blazei e do indutor de resistência acibenzolar-S-metil (ASM) no controle da murcha bacteriana em tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), bem como investigar o modo de ação destes produtos na atividade protetora, através de alterações na atividade de determinadas enzimas. Extratos aquosos dos cogumelos e o ASM foram testados na inibição do crescimento da bactéria in vitro. Em casa-de-vegetação, plantas foram tratadas com diferentes doses dos extratos e com ASM (0,05 g/L), dois dias antes da inoculação. As avaliações foram efetuadas com base na severidade da doença e determinação da atividade de algumas enzimas. Os isolados de A. blazei e L. edodes, bem como o ASM, não exerceram efeito inibitório direto no crescimento da bactéria. Quanto à indução de resistência, o isolado Le-96/17 de L. edodes na concentração de 10 % (v/v) e o ASM reduziram significativamente a ocorrência de murcha. As atividades de quitinase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase não foram alteradas para a maioria dos tratamentos, porém foi constatado um aumento na atividade de quitinase nas plantas tratadas com ASM. Para a peroxidase, os tratamentos ASM, Abl-26 e Le-96/17 ocasionaram aumentos na atividade da enzima e, com base nos resultados, o cogumelo L. edodes e o ASM apresentam potencial para reduzir a murcha bacteriana provavelmente através da indução de resistência.

Qualidade sanitária e fisiológica de sementes de milho submetidas a termoterapia e condicionamento fisiológico

A termoterapia é uma medida de controle tradicionalmente utilizada com sucesso para eliminação de patógenos em sementes de espécies hospedeiras. Trata-se, no entanto, de uma medida que provoca alterações fisiológicas e bioquímicas nas sementes em diferentes intensidades, podendo comprometer o desempenho das mesmas nas condições de cultivo. Objetivou-se com este trabalho avaliar a eficácia da termoterapia no controle de alguns fungos associados a sementes de milho e do condicionamento osmótico, após o tratamento térmico, no sentido de reparar danos nas sementes provocados nestas circunstâncias. Os fungos associados às sementes foram avaliados por meio do método de incubação em substrato de papel com congelamento, e a qualidade fisiológica das sementes pelos testes de germinação, primeira contagem, condutividade elétrica, e padrões eletroforéticos das enzimas esterase (EST), malato desidrogenase (MDH) e álcool desidrogenase (ADH). O tratamento térmico utilizado foi por imersão em água aquecida a 60°C por 5, 10 e 20 minutos. Após o tratamento, uma fração das sementes foi submetida ao condicionamento fisiológico em rolo de papel embebido em solução de PEG 6000 a -1,2 MPa. Todos os tratamentos térmicos reduziram ou eliminaram Acremonium strictum das sementes. A incidência de Fusarium verticillioides foi reduzida significativamente pelo tratamento térmico nos períodos de 10 e 20 minutos. À medida que se aumentou o tempo de exposição ao tratamento térmico, houve aumento dos valores de condutividade elétrica e redução significativa da primeira contagem e germinação das sementes. O tratamento térmico durante 20 minutos alterou os padrões eletroforéticos das enzimas esterase e malato desidrogenase. O condicionamento fisiológico das sementes não foi capaz de reverter os danos causados pela termoterapia.

Caracterização de isolados de Acidovorax avenae subsp. citrulli

Foram caracterizados 41 isolados de Acidovorax avenae subsp. citrulli com base em aspectos fisiológicos e bioquímicos. Todos os isolados induziram sintomas típicos da mancha-aquosa em plântulas, plantas e frutos de meloeiro (Cucumis melo) e melancieira (Citrullus lanatus). Pelo teste de agrupamento de Scott-Knott (P = 0,05) os isolados foram separados quanto ao índice de doença em 5 e 7 grupos, respectivamente para plântulas de meloeiro e melancieira, e em 2 grupos para plantas das duas hospedeiras. Em frutos, os isolados foram separados em 3 e 10 grupos para a variável diâmetro da lesão externa e 2 e 9 grupos para profundidade da lesão, respectivamente para melão e melancia. Todos os isolados induziram reação de hipersensibilidade em fumo (Nicotiana tabacum); utilizaram os compostos asparagina, L-leucina e DL-ácido lático; produziram enzimas lipolíticas e o fitohormônio ácido indol acético; foram sensíveis a oxicloreto de cobre (120 µg mL-1), óxido cuproso (120 µg mL-1), hidróxido de cobre (138,2 µg mL-1), sulfato de estreptomicina (25 µg mL-1) e Agrimaicin 500 (428 µg mL-1); e resistentes a kasugamicina (87 µg mL-1), agrimicina (200 µg mL-1), eritromicina (15 µg), gentamicina (10 µg), amoxicilina (10 µg), neomicina (30 µg), estreptomicina (10 µg), norfloxacina (10 µg) e rifampicina (5 µg). Nenhum isolado apresentou atividade pectinolítica, amilolítica, celulolítica e proteolítica ou produção do polissacarídeo levana e da toxina siringomicina. Foi constatada variabilidade entre os 41 isolados de A. avenae subsp. citrulli quanto à sensibilidade à tetraciclina (30 µg), sendo 41,5% resistentes, 46,3% moderadamente sensíveis e 12,2% altamente sensíveis.

Quimiometria como ferramenta analitica para definição das condiçoes de ensaio da enzima peroxidase de soja

Enzimas Peroxidases são heme-proteínas encontradas nos diferentes organismos vivos, especialmente vegetais, apresentam importante papel fisiológico/bioquímico como proteção contra microorganismos invasores. A soja, um dos mais importantes produtos para o agronegócio brasileiro apresenta na casca de suas sementes (subproduto) alta atividade de peroxidase, denominada soybean peroxidase,com potencial de utilização em métodos analíticos clínicos. A proposta do trabalho foi aplicar o planejamento fatorial para otimização das condições extração da enzima, definição das condições ótimas de atividade (pH e temperatura), utilizando metodologia de superfície de resposta. Os dados obtidos com clara definição foram: i) extração em pó cetonico, ii) meio reacional: pH 3,3, volume da amostra contendo a enzima 330 µL - 340 µL, peróxido de hidrogênio 4,2 mmol.L-1 150 µL, tempo de reação 20 segundos, temperatura 50º C, substrato guaiacol 30mmol.L-1 300 µL, e 0,1 mol.L-1 de NaCl. O uso da dessa metodologia para definição das condições de extração e estudos cinético-enzimáticos da peroxidase de soja foram eficientes e mais precisos, comparado a metodologia de variações/repetições (tentativa e erro).

Isolamento e regeneração de protoplastos de Magnaporthe grisea

Protoplastos são ferramentas biológicas importantes para pesquisas em fungos filamentosos, sendo empregados intensamente em transformação genética. O isolamento de protoplastos de Magnaporthe grisea foi facilitado com Novozym 234, contudo, este complexo enzimático encontra-se indisponível no mercado. Assim, objetivou-se comparar a eficiência de enzimas líticas disponíveis comercialmente na obtenção de protoplastos de M. grisea. Paralelamente, analisaram-se estabilizadores osmóticos, tempos de digestão e freqüência de regeneração. Maior produção de protoplastos foi obtida com o uso simultâneo de Lysing Enzymes e Cellulase Onozuka R-10. O uso de 10 ou 15 mg de cada complexo enzimático, em 3 mL de estabilizador osmótico, resultou em maior liberação de protoplastos. O melhor estabilizador osmótico foi MgSO4 1,2 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8, seguido por MgSO4 0,8 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8. O isolamento de protoplastos foi monitorado a cada 60 minutos, atingindo o máximo após incubação por 3 a 6 horas. No entanto, maior freqüência de regeneração (19,4%) foi registrada para protoplastos obtidos após 3 horas de hidrólise enzimática.

Atividades amilolítica e pectinolítica de Alternaria solani e a relação com a agressividade em tomateiro

As atividades amilolítica e pectinolítica de 45 isolados de Alternaria solani, provenientes de diferentes hospedeiros, foram estimadas por meio da difusão enzimática em meio sólido específico e mensuração do halo de degradação do substrato. Todos os isolados degradaram pectina. Apenas 17 isolados apresentaram atividade amilolítica, sendo nove isolados provenientes de batateira. Somente o isolado AS18 se destacou como bom produtor de ambas as enzimas. Uma vez que a atividade pectinolítica foi mais evidente, avaliou-se a influência de pectinases na agressividade de A. solani ao tomateiro. Para isso, cinco isolados (2 de berinjela, 2 de tomateiro e 1 de batateira) contrastantes quanto à produção de pectinases foram selecionados para testes em folíolos destacados e plantas inteiras. Quatro isolados foram utilizados no teste em folíolos destacados (AS6, AS7, AS12 e AS26), e constatou-se haver variabilidade patogênica. A correlação obtida entre o tamanho das lesões e a atividade pectinolítica foi de r = 0,963 (P = 0,087). Cinco isolados (AS6, AS7, AS12, AS25 e AS26) foram inoculados em plantas inteiras de tomate. Os isolados não diferiram quanto ao número de lesões/cm² de área foliar, porém variaram em agressividade. Houve correlação (r = 0,916; P = 0,042) entre a atividade de pectinases e o índice de doença, sugerindo possível papel para as enzimas pécticas durante a infecção de A. solani em tomateiro. É provável que as diferenças no perfil enzimático dos isolados estejam associadas ao hospedeiro original de onde os mesmos foram obtidos. Os resultados reforçaram evidências de especificidade por hospedeiro em populações de A. solani.

Identidade molecular dos fitoplasmas associados aos enfezamentos do tomateiro e da berinjela com base na análise do gene 16S rDNA

Doenças de hortaliças de ocorrência no território brasileiro e em outras áreas do mundo têm sido associadas a diversos fitoplasmas. Na região de Piracicaba-SP e Bragança Paulista-SP, em plantas de tomate e berinjela foram observados sintomas típicos de enfezamento caracterizados por porte reduzido, clorose foliar, superbrotamento de ramos, desenvolvimento anormal do cálice, encurtamento de entre-nós, redução no tamanho de folhas, flores e frutos. Através de duplo PCR, utilizando os iniciadores R16 mF1/mR2 e R16 F2n/R2, fragmentos de DNA de 1,2 kb foram amplificados de amostras sintomáticas, demonstrando a presença de fitoplasma nos tecidos das plantas. O uso de iniciadores específicos demonstrou que estes fitoplasmas eram afiliados ao grupo 16SrIII. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, HpaII, KpnI, MboI, MseI e RsaI confirmaram que os fitoplasmas detectados eram representantes do grupo 16SrIII. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados em Escherichia coli, sequenciados e comparados, por homologia de seqüência, entre si e com outros fitoplasmas do grupo 16SrIII. Um índice de similaridade de seqüência acima de 95% foi encontrado quando seqüências dos fitoplasmas detectados em tomate e berinjela foram comparadas com aquelas de outros representantes do grupo 16SrIII. Um índice de 98-99% foi obtido quando seqüências dos fitoplasmas encontrados em tomate e berinjela foram comparadas entre si. Estes resultados evidenciaram que o enfezamento do tomateiro e da berinjela podem estar associados a um mesmo fitoplasma, com base na análise de seqüências do gene do 16S rDNA.

Indução de resistência em plantas de berinjela por Lentinula edodes e Agaricus blazei contra Ralstonia solanacearum: aspectos bioquímicos e biomassa vegetal

A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, é considerada uma doença de importância para a cultura da berinjela, sendo de difícil controle. O controle de doenças através de indução de resistência é um método que vêm se revelando como promissor. Basidiomas de Agaricus blazei e Lentinula edodes possuem substâncias do tipo antibiótico e outras substâncias capazes de atuarem como elicitoras da resposta de resistência em plantas, mostrando-se assim promissores no controle alternativo de fitopatógenos. O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de estudar o efeito de extratos aquosos dos fungos e do indutor químico acibenzolar-S-metil (aSm) sobre o crescimento da bactéria in vitro e o controle da murcha bacteriana, bem como investigar seu efeito sobre a atividade de determinadas enzimas da planta. O efeito inibitório sobre o patógeno foi avaliado usando diferentes concentrações dos extratos aquosos. A indução de resistência foi estudada em plantas tratadas com o indutor biológico e químico, medindo-se a intensidade de murcha e determinando-se as alterações de algumas enzimas. Os resultados revelaram que os isolados de A. blazei e L. edodes, utilizados em diversas diluições, não exerceram efeito inibitório in vitro. Em relação à indução de resistência, extratos dos isolados Abl-11 e Abl-28 de A. blazei (15%, v/v) e o aSm (0,05 g/L) promoveram redução significativa na ocorrência de folhas murchas, quando aplicados dois dias antes da inoculação. O aumento na atividade de peroxidase foi verificado em plantas tratadas com extratos de Abl-11, Abl-28 e com suspensão de aSm. A atividade de quitinase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase não foi alterada nas plantas tratadas com extrato de Abl-28 e com o aSm. No entanto, plantas de berinjela tratadas com Abl-11 exibiram uma aumento na atividade de fenilalaniana amônia-liase e de polifenoloxidase, enquanto que a atividade de quitinase não foi alterada. Com base nos resultados, ficou evidenciado que o aSm e os isolados Abl-11 e Abl-28 de A. blazei apresentam potencial para induzir resistência em berinjela contra R. solanacearum.

Método rápido de extração de DNA de bactérias

Desenvolveu-se um método rápido para extração de DNA de bactérias, que ao contrário de outros métodos, não requer o uso de enzimas, como lisozima e proteinase K, previamente, utilizado-se o carbonato de silício (carborundum) como agente físico para efetuar a quebrar da parede celular da bactéria. Com este método conseguiu-se extrair DNA bacteriano num menor tempo, além de mais rápido, ele mostrou-se mais simples e econômico, quando comparado aos métodos convencionais. O DNA obtido pode ser utilizado para diversas finalidades relacionadas ao DNA de bactérias, obtendo-se uma quantidade razoável de DNA, que varia de 725 µg/mL a 1170 µg/mL por cada 0,1 g de célula bacteriana, com ótima qualidade.

Alterações metabólicas em plantas de feijão originadas de sementes microbiolizadas por Pseudomonas sp. e inoculadas com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

Muitas enzimas estão envolvidas em reações de defesa de plantas contra patógenos. O objetivo deste trabalho foi verificar alterações na atividade de algumas destas enzimas em plantas de feijão originadas de sementes microbiolizadas com um isolado de Pseudomonas do grupo das fluorescentes (isolado DFs842). Sementes de feijão cultivar BRS Valente foram imersas em suspensão salina preparada a partir de crescimento bacteriano com 24 h do isolado de Pseudomonas (OD540=0,5) sabidamente biocontroladora de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Como testemunhas, as sementes foram imersas em solução salina (NaCl 0,85%). Após a microbiolização por 5 h a 10ºC, as sementes foram plantadas em vasos contendo uma mistura de solo não esterilizado, areia e esterco bovino (proporção 3:1:1), mantidos em casa de vegetação. A inoculação do patógeno foi realizada na terceira folha verdadeira de todas as plantas, fazendo-se cortes com tesoura imersa em suspensão salina do patógeno (X. axonopodis pv. phaseoli) preparada a partir de crescimento de 24 h (OD540=0,4). Câmaras úmidas foram mantidas 24 h antes e após a inoculação. Para o preparo do extrato protéico, as três primeiras folhas verdadeiras foram coletadas individualmente em 5 épocas de coleta distintas: uma, momentos antes da inoculação e as demais nos tempos seis, 24, 72 h e 15 dias após a inoculação. Este extrato protéico serviu de fonte para as determinações do teor de proteínas solúveis totais (PST), atividade da polifenol oxidase (PPO) e da peroxidase (PO), as quais foram realizadas por leituras espectrofotométricas. Os resultados demonstraram aumento significativo no teor de PST e na atividade de PPO nas plantas submetidas ao tratamento com isolado DFs842, sendo que, o teor de PST foi o dobro, em relação às plantas não tratadas. Também foi observado que, mesmo antes da inoculação do patógeno o teor de PST e a atividade de PPO nas plantas tratadas estavam bem maiores. Em relação à atividade de PO houve redução da mesma nas plantas tratadas com o isolado de Pseudomonas (DFs842). Esses resultados evidenciaram que a microbiolização das sementes provocou alterações metabólicas nas plantas delas originadas, pelo aumento do teor de PST e atividade de PPO, indicando uma provável participação destas enzimas na indução de resistência ativada pela microbiolização com o isolado de Pseudomonas (DFs842).

Candidatus Phytoplasma brasiliense associado ao superbrotamento do hibisco (Hibiscus rosa-sinensis L.) no Estado de São Paulo

Plantas de hibisco com superbrotamento e definhamento seguido de morte têm sido observadas nos municípios de São Paulo, Campinas e Piracicaba. Como os sintomas são sugestivos daqueles induzidos por fitoplasmas, o presente trabalho buscou identificar o possível fitoplasma associado com a doença. Assim, 14 plantas sintomáticas de hibisco foram coletadas em Piracicaba (SP) e submetidas ao PCR duplo com os primers P1/Tint-R16F2n/R2 e ao exame em microscópio eletrônico de transmissão. A identificação foi realizada por análise de RFLP com as enzimas de restrição BfaI, DraI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MseI, RsaI e TaqI. Testes de transmissão foram conduzidos com enxertia de ramos e uso de Cuscuta subinclusa. Os resultados de nested-PCR revelaram a presença consistente de fitoplasmas em todas as plantas sintomáticas e foram confirmados pela observação de corpúsculos pleomórficos no floema, através da microscopia eletrônica. A análise de RFLP mostrou que o fitoplasma encontrado em hibisco pertence ao grupo 16SrXV, o mesmo grupo do Candidatus Phytoplasma brasiliense. O fitoplasma foi transmitido de planta doente para sadia, tanto pela enxertia como pela C. subinclusa, demonstrando ser o agente do superbrotamento do hibisco.

Variabilidade genética entre isolados de Colletotrichum gossypii do algodoeiro

O algodoeiro é atacado por Colletotrichum gossypii (CG) e C. gossypii var. cephalosporioides (CGC). Ambos os patógenos são transmitidos pela semente e sua distinção morfológica é extremamente difícil e inconsistente. Tentativas foram feitas no presente trabalho para verificar a variabilidade genética entre CG e CGC através de RAPD-PCR, ERIC- e REP-PCR e PCR-RFLP da região ITS rDNA. Foram utilizados 53 isolados coletados de sementes e folhas de plantas de diferentes cultivares nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais, e Paraiba, entre 1999 e 2003. Baseado em testes de patogenicidade, vinte e um isolados foram classificados como CG e 32 como CGC. Os resultados obtidos por RAPD-PCR, utilizando-se oito primers, revelaram dois grupos distintos sendo que o primeiro foi formado por 94% dos isolados de sementes e o segundo por 95% dos isolados de folhas. Na análise de ERIC- e REP-PCR, resultados semelhantes a RAPD foram obtidos, sendo que o primeiro grupo foi formado por 93% dos isolados provenientes das sementes e o segundo por 78% dos isolados provenientes das folhas. Quando o produto de amplificação da região ITS rDNA foi digerido com oito enzimas de restrição, um perfil de bandas semelhante para todos os isolados foi obtido. Resultados de RAPD, ERIC- e REP-PCR demonstraram que existem diferenças genéticas entre os isolados provenientes das sementes e aqueles provenientes de parte aérea, e esses dois grupos foram claramente distintos. Estudos futuros devem ser realizados utilizando outras técnicas moleculares para a obtenção de marcadores capazes de distinguir entre isolados de CG e CGC.

Indução de resistência em feijoeiro a mancha angular por extratos de micélio de Pycnoporus sanguineus

O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) está entre as principais culturas da agricultura nacional e pode ser afetada por várias doenças, como a mancha angular causada por Pseudocercospora griseola. Com o objetivo de desenvolver métodos alternativos ao químico para o controle desta doença, verificou-se o potencial de extratos de micélio de Pycnoporus sanguineus para atividade antimicrobiana in vitro contra P. griseola e para indução de resistência e ativação de enzimas de defesa em feijoeiro, como peroxidase, polifenoloxidase e β-1,3-glucanase, além de sua influência nos teores de proteínas e clorofilas. Os experimentos in vitro e em casa de vegetação foram constituídos pelos extratos de micélio de P. sanguineus e dos controles água, acibenzolar-S-metil (ASM: 75 mg i.a./L) e fungicida azoxystrobin (40 mg i.a./L). In vitro o extrato de micélio apresentou efeito sobre o crescimento micelial, a esporulação e a germinação de esporos de P. griseola. In vivo a severidade foi reduzida em 93% e 50% em casa de vegetação e a campo respectivamente, em relação ao controle água. A atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase e os teores de proteínas e clorofilas foram maiores nas plantas tratadas com o extrato. Estes resultados indicam a eficiência de P. sanguineus para o controle alternativo da mancha angular do feijoeiro.

Indução de resistência sistêmica por rizobactérias em cultivos hidropônicos

Rizobactérias do grupo fluorescente de Pseudomonas spp. foram selecionadas quanto a sua capacidade na promoção de crescimento em plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e atividade antagônica contra Pythium aphanidermatum a partir de teste in vitro. Em seguida, em sistema hidropônico, foi avaliada a aplicação prévia dos isolados visando reduzir os danos provocados por P. aphanidermatum em pepino (Cucumis sativus) por resistência sistêmica induzida (RSI), pela adoção da técnica "raízes subdivididas". As variáveis massa da matéria seca (parte aérea e raízes) e comprimento radicular foram utilizadas na avaliação. A produção de compostos antagônicos e/ou promotores de crescimento pelos isolados de Pseudomonas spp. fluorescente foi verificada de modo a associar sua atividade com os resultados obtidos nos testes in vitro e em hidroponia. No experimento in vitro os isolados Ps 140B e Ps 140C proporcionaram maior crescimento das plantas (raiz e hipocótilo) de alface nos tratamentos com e sem patógeno. Alguns dos isolados avaliados no experimento hidropônico demonstraram uma possível expressão da RSI. Não houve correspondência entre os compostos produzidos e a promoção de crescimento vegetal ou controle da doença.

Efeito de indutores bióticos e abióticos na atividade de quitinase e peroxidase e no controle da ferrugem causada por Puccinia psidii em eucalipto

Verificou-se o efeito de indutores de resistência bióticos e abióticos nas atividades de quitinase e peroxidase e na redução da severidade da ferrugem do eucalipto causada por Puccinia psidii. Para isso, mudas de dois clones de eucalipto (Eucalyptus grandis x E. urophylla) denominados VR e C0, com sessenta dias de idade, mantidas em casa de vegetação, receberam tratamentos com Bion® (Acibenzolar-S-metil-ASM), Agro-Mos®, Dipel®, Ecolife40®, Crop-set® e uma preparação obtida a partir de Saccharomyces cerevisiae, 5 dias antes da inoculação com o patógeno. Uma suspensão de uredósporos de P. psidii, coletados a partir de plantas naturalmente infectadas, foi calibrada para 5 x 10(4) uredósporos/ mL. A inoculação foi realizada na face abaxial das folhas e a avaliação se deu 15 dias após, estimando-se a severidade da doença por meio de escala de notas. Os tratamentos ASM, preparado de S. cerevisiae e Ecolife® apresentaram os melhores resultados de controle da doença e os demais tratamentos não se mostraram eficazes para o controle. O aumento de atividade das enzimas quitinase e peroxidase foi observado em ambos os clones, previamente tratados com os indutores(ASM e S. cerevisiae), 48 horas após a inoculação com o fungo.