Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho

Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de alfa-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de "random primers". A amplificação por PCR de uma porção do gene da alfa-amilase foi realizada com os "primers": "sense" - CGACATCGACCACCTCAAC; "antisense" - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de alfa-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação.

Caracterização de alfa-galactosidase em embrião e cotilédones de sementes de Platymiscium pubescens Micheli, var. pubecens (tamboril-da-mata)

Sementes de Platymiscium pubescens foram colocadas para embeber em água, sendo retiradas amostras para as caracterizações bioquímica e cinética da enzima alfa-galactosidase do eixo embrionário e dos cotilédones. A atividade específica no eixo embrionário aumenta de zero até o tempo de 96 horas de embebição, estabilizando em seguida. A atividade da enzima dos cotilédones mostrou pequeno incremento durante esse mesmo tempo. A alfa-galactosidase do eixo embrionário apresentou atividade máxima no intervalo de pH de 4,5 a 6,0. Por outro lado, para a enzima proveniente dos cotilédones, a maior atividade foi detectada na faixa de 4,0 a 6,0. A temperatura de 55ºC foi a que mais estimulou as atividades da alfa-galactosidase do eixo embrionário e dos cotilédones. As enzimas do eixo embrionário e dos cotilédones mostraram-se termotolerantes, não se alcançando a meia vida na temperatura de 40ºC, no período de 1.500 minutos. A atividade da alfa-galactosidase do eixo embrionário foi inibida por melibiose, CuSO4 e SDS, enquanto a dos cotilédones foi por todos os efetores, exceto com SDS, CuSO4 e galactose que tiveram efeito neutro sobre a atividade da alfa-galactosidase dos cotilédones. Os valores de K M para as alfa-galactosidases do embrião e para o cotilédone foram 3,37 e 0,26 mM, respectivamente.