Patogenicidade de Corynespora cassiicola a diferentes espécies de plantas

Avaliou-se, em condições de casa de vegetação, a patogenicidade de dois isolados de Corynespora cassiicola, obtidos de tomateiro (Lycopersicon esculentum), a abóbora (Cucurbita pepo), aceroleira (Malpighia glabra), caupi (Vigna unguiculata), mamoeiro (Carica papaya), maxixe (Cucumis anguria), pimentão (Capsicum annum), quiabeiro (Abelmoschus esculentus), soja (Glycines max), tomateiro e vinagreira (Hibiscus sabdariffa) com o objetivo de selecionar plantas que possam ser utilizadas em sistemas de rotação de culturas, nas áreas produtoras de tomate. Duas plantas daninhas, trapoeraba (Commelina benghalensis) e assa peixe (Vernonia cinerea), comuns em tomatais, foram incluídas nos testes para se avaliar sua importância como fontes de inóculo. As plantas reagiram diferentemente ao patógeno, sendo a maioria suscetível aos dois isolados do fungo. Sugere-se que o tomateiro não deva ser cultivado consorciado ou muito próximo a plantios de abóbora, maxixe, pimentão, quiabeiro e vinagreira. O controle das invasoras como C.benghalensis e V. cinerea é de fundamental importância para a redução do inóculo no campo.

Efeitos da interação de potyvirus em híbridos de meloeiro, variedades de melancia e abobrinha

Em razão da freqüente ocorrência de infecção mista, na natureza, o presente trabalho objetivou estudar o efeito da interação de diferentes espécies de potyvírus em meloeiro (Cucumis melo), melancia (Citrullus lanatus) e abobrinha (Cucurbita pepo). Foram usados os seguintes vírus da família Potyviridae, gênero Potyvirus: Papaya ringspot virus (PRSV); Watermelon mosaic virus, (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus, (ZYMV). Os efeitos na sintomatologia das infecções duplas e simples de PRSV, WMV e ZYMV foram avaliados em três híbridos de meloeiro, duas variedades de melancia e abobrinha 'Caserta', em experimentos de casa de vegetação. Os três vírus, isoladamente ou em todas as duplas combinações possíveis, foram inoculados, em plantas dos híbridos de meloeiro Hy Mark, Gold Mine e Orange Flesh, variedades de melancia Crimson Sweet e Charleston Gray e abobrinha 'Caserta', usando-se dez plantas de cada híbrido ou variedade, por combinação de vírus. As inoculações foram efetuadas por meio de extratos de folhas com infecção simples dos respectivos vírus. As plantas inoculadas com cada vírus isoladamente e suas respectivas combinações foram observadas quanto ao aparecimento de sintomas durante 30 dias após as inoculações. Amostras foliares das plantas inoculadas foram, também, testadas por ELISA indireto contra os anti-soros correspondentes para cada vírus. As infecções duplas em meloeiro, melancia e abobrinha revelaram, através da avaliação sintomatológica, que existem interações sinérgicas entre PRSV, WMV e ZYMV. As infecções duplas envolvendo o ZYMV apresentaram alta severidade, exibindo sintomas não encontrados em infecções simples, apesar da severidade nas infecções isoladas do ZYMV.

Estudo morfométrico comparativo de populações de Rotylenchulus reniformis (Nemata: Rotylenchulinae) do Brasil

Quarenta e oito populações de Rotylenchulus reniformis foram recuperadas de amostras de solo e raízes de diferentes culturas e inoculadas em diferentes plantas hospedeiras, mantidas em microparcelas no Departamento de Fitossanidade da UNESP/FCAV, Campus de Jaboticabal, São Paulo. Os sintomas da doença causada pelo nematóide em algodoeiro (Gossypium hirsutum), no campo, foram documentados, bem como o hábito de parasitismo do nematóide em raízes de algodão e de mamoeiro (Carica papaya), utilizando-se de coloração in situ do nematóide com fuccina ácida. Efetuou-se a comparação morfológica de todas as populações, ao microscópio óptico composto, em montagens temporárias e, de algumas, ao microscópio eletrônico de varredura. Para as observações ao microscópio eletrônico de varredura, fêmeas adultas presas às raízes foram fixadas em glutaraldeído e pós-fixadas em tetróxido de ósmio, desidratadas em álcool etílico, secas em secador de ponto crítico, montadas, recobertas com 35 nm de ouro, observadas e elétromicrografadas em 15 kV. Os dados obtidos confirmam que R. reniformis é a única espécie do gênero distribuída nos agroecossistemas brasileiros e que a amplitude de variação de caracteres morfométricos em populações brasileiras desse nematóide, tais como comprimento do estilete, V % e forma da cauda, é maior que em populações da mesma espécie de outras regiões do mundo. Foram ilustradas fêmeas jovens de R. reniformis com a cauda bifurcada, e esse detalhe da morfologia do nematóide ainda não havia sido relatado.

Doenças fúngicas pós-colheita em mamões e laranjas comercializados na Central de Abastecimento do Recife

Doenças fúngicas pós-colheita constituem uma das principais causas de perdas durante a fase de comercialização de frutos tropicais. Frutos de mamão (Carica papaya) e laranja (Citrus spp.) foram analisados em relação à incidência de doenças fúngicas e freqüência das espécies patogênicas durante seis meses, na Central de Abastecimento de Recife, Estado de Pernambuco. As amostragens foram realizadas mensalmente, sendo avaliados 40 frutos de cada espécie, em cinco pontos de comercialização, totalizando 200 frutos/amostragem/espécie. Ocorreu uma grande diversidade de doenças em frutos de mamão, onde as incidências variaram entre 39,71% e 0,07%, com maior nível para a podridão peduncular. Em frutos de laranja a incidência de doenças variou entre 11,85% e 0,62%, para podridão peduncular por Lasiodiplodia spp. e antracnose, respectivamente. Os patógenos que apresentaram maiores freqüências foram Colletotrichum gloeosporioides (44,95%) em mamão e Lasiodiplodia theobromae (11,85%) em laranja. A diversidade de doenças constatada neste estudo sugere a necessidade do emprego de medidas de controle mais efetivas durante as fases de produção e pós-colheita de frutos de mamão e laranja, visando propiciar redução das perdas.

Caracterização enzimática e patogenicidade cruzada de Colletotrichum spp. associados a doenças de pós-colheita

A antracnose, causada por Colletotrichum spp., pode ocasionar grandes perdas a nível de campo e em pós-colheita sobre diversas culturas e seus produtos. O presente trabalho teve por objetivos testar a patogenicidade cruzada de isolados de C. gloeosporioides do caju (Anacardium occidentale) (CAJ), manga (Mangifera indica) (MG), mamão (Carica papaya) (MM), maracujá (Passiflora edulis) (MR) e C. musae da banana (Musa spp.) (BAJ); avaliar a produção de enzimas extracelulares (amilolítica, celulolítica, lipolítica e proteolítica) produzidas pelos isolados em substratos sólidos específicos; e detectar padrões eletroforéticos de proteínas totais e isoenzimas (alfa-esterase, beta-esterase, fosfatase ácida e leucina aminopeptidase). Na análise da patogenicidade cruzada, todos os isolados de Colletotrichum spp. induziram lesões necróticas, deprimidas sobre os frutos, exceto em maracujá que foi suscetível tão somente ao isolado MR. Quanto à produção de enzimas extracelulares hidrolíticas, os isolados de C. gloeosporioides produziram amilase, lipase, protease e celulase, sendo que esta última enzima não foi detectada em C. musae. Com relação à análise eletroforética de proteínas totais e isoenzimas, os isolados apresentaram variações no número e posição das bandas no gel de poliacrilamida em todos os sistemas, com exceção de leucina aminopeptidase, onde bandas monomórficas foram formadas, sem variação na intensidade e pouca variação na mobilidade relativa.

Distribuição espacial da meleira do mamoeiro em zonas de trópico úmido e trópico semi-árido

O vírus da meleira, transmitido por Bemisia tabaci, é um dos maiores problemas da cultura do mamoeiro (Carica papaya), sendo responsável por perdas de até 100% na produção. Com o objetivo de compreender melhor sua epidemiologia e gerar subsídios para estudos da influência de fatores culturais e bioecológicos na dinâmica da doença, avaliou-se a distribuição espacial de plantas afetadas pela meleira em zonas de Trópico Úmido e Trópico Semi-árido, em 15 plantios comerciais em Eunápolis-BA e Petrolina-PE, entre jan. 2000 e mar. 2001. As áreas foram mapeadas anotando-se a posição de cada planta e a presença ou ausência de sintomas. Foram consideradas doentes aquelas que apresentavam frutos com exsudação espontânea do látex, látex muito fluido, frutos borrados e/ou folhas do ápice com o bordo necrosado. Pelas análises de seqüências ordinárias, índice de dispersão, áreas isópatas e ajuste dos logaritmos das variâncias binomial e de acordo com a lei de Taylor, observaram-se maior agregação nas linhas de plantio que entre linhas e uma agregação de mediana a forte em sub-áreas (1,4 < ID < 3,1). Na maioria dos lotes, as áreas de maior incidência concentraram-se nas bordas dos talhões, o que indica que a migração de vetores assume um papel importante na disseminação da doença. Em alguns casos foi possível detectar a presença de focos isolados no interior dos lotes, o que sugere a formação de colônias dos vetores e transmissão planta a planta a partir de inóculo secundário. Não foram observadas diferenças significativas na distribuição espacial de plantas doentes entre as áreas das duas regiões.

Dois novos sistemas de diagnose precoce da meleira do mamoeiro

A diagnose da meleira do mamoeiro (Carica papaya)tem sido feita mediante observação de sintomas que aparecem principalmente nos frutos ou pela detecção de dsRNA de cerca de 12 kb, purificado a partir do látex em coluna de CF11, em gel de agarose ou poliacrilamida. Os sintomas nos frutos são tardios e permitem longa permanência de plantas infectadas no campo e o processo usado para detectar dsRNA é laborioso, não se prestando a detecção em larga escala. Visando disponibilizar protocolos de diagnose precoce da meleira que possam ser usados em larga escala, o presente trabalho apresenta dois métodos de detecção relativamente baratos, rápidos e que permitem o manuseio de dezenas de amostras por dia. Os dois métodos utilizam o látex extraído dos frutos, folhas ou caule de plantas, e se baseiam na extração e visualização de ácidos nucléicos. A presença do vírus é confirmada pela visualização do seu dsRNA em gel de agarose (1%) em 1X TBE. Com esta técnica temos conseguido resultados confiáveis a ponto de diagnosticar precocemente a meleira em plantas ainda jovens e em plantas assintomáticas.

Identificação sorológica de espécies de potyvirus em melancia, no estado de Roraima

No período de maio de 2003 a março de 2004, foram coletadas amostras foliares de plantas de melancia (Citrullus lanatus) de 21 campos de cultivo de cucurbitáceas, no Estado de Roraima. As amostras exibiam diferentes sintomas de vírus e foram levadas para o Laboratório de Virologia Vegetal da Universidade Federal do Ceará para serem testadas por "enzyme linked immunosorbent assay" (Elisa)-indireto, contra anti-soros específicos para Cucumber mosaic virus (CMV), Papaya ringspot virus estirpe melancia (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). Nos testes de Elisa, utilizou-se o conjugado universal, anti-imunoglobulina (IgG) de coelho produzida em cabra conjugada à enzima fosfatase alcalina. Todas as amostras foram testadas, também, por dupla difusão contra o anti-soro para Squash mosaic virus (SqMV). Os resultados indicaram a presença do PRSV-W em 84,2% das amostras coletadas em maio de 2003, em 7,1% das amostras coletadas em dezembro de 2003 e em 55,6% das amostras coletadas em março de 2004. A presença do ZYMV foi observada em 10,5% das amostras coletadas em maio de 2003, 21,4% das amostras coletadas em dezembro de 2003 e em 25,9% das amostras de março de 2004. O WMV foi detectado somente em oito das amostras coletadas em março de 2004 (29,6%). Os resultados desta pesquisa confirmam a ampla dispersão do PRSV-W em cultivos de cucurbitáceas no território brasileiro e a preocupante expansão do ZYMV em razão dos elevados prejuízos que o mesmo tem causado em outras partes do mundo.

Seleção de acessos e progênies de Citrullus spp. para resistência a três potyvirus

Visando selecionar acessos e progênies de melancia (Citrullus spp.) como fontes de resistência aos potyvirus: Papaya ringspot virus tipo watermelon (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), oito genótipos foram avaliados, sendo seis dos acessos (87-019, 87-029, 91-080, PI-244018, 91-043 e PI-195927) e dois do acesso PI-244019 (PI-244019A e PI-244019B) do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de cucurbitáceas do Nordeste brasileiro, da Embrapa Semi-Árido em Petrolina-PE. Também foram avaliadas progênies endogâmicas e de polinização livre derivadas desses acessos. As avaliações foram realizadas em de casa de vegetação, mediante inoculações mecânicas, e avaliação por Elisa, no Laboratório de Virologia Vegetal da UFC. As plantas não infetadas foram selecionadas e cultivadas na Estação Experimental de Bebedouro na Embrapa Semi-Árido em Petrolina-PE, onde ocorreram inoculações naturais de vírus por vetores. Foram constatadas plantas não infetadas com o PRSV-W nos acessos 87-019, PI-244019A, 91-080, PI-244018, PI-244019B e PI-195927; plantas não infetadas com o WMV nos acessos 87-019 e 87-029 e plantas não infetadas com o ZYMV nos acessos PI-244019A, 87-029, 91-080, 91-043, PI-244019B e PI-195927. As progênies apresentaram comportamento diferenciado, com percentagem de plantas selecionadas variando de 20 a 100% nas progênies avaliadas para resistência a PRSV-W e 60 a 100% nas progênies avaliadas para resistência a WMV. Nenhuma das progênies testadas apresentou resistência ao ZYMV, evidenciando possível diferença entre a resistência ao PRSV-W e ao WMV apresentada nas progênies e a resistência apresentada ao ZYMV, visto que as progênies foram submetidas ao mesmo número de autofecundações.

Transmissão por mãos contaminadas e ausência de transmissão embrionária do vírus do amarelo letal do mamoeiro

O vírus do amarelo letal do mamoeiro ("Papaya lethal yellowing virus", PLYV) é responsável por uma das principais doenças do mamoeiro (Carica papaya) no Nordeste brasileiro. O PLYV pode ser transmitido por solo, água, instrumentos de corte contaminados e por inoculação mecânica em condições experimentais. Na presente pesquisa, avaliou-se a transmissão do PLYV por mãos contaminadas e sua presença em embriões de sementes de frutos infetados. O PLYV foi transmitido por mãos contaminadas, e mãos contaminadas e lavadas em água corrente revelando elevada estabilidade. Experimentos com 1.128 embriões de sementes obtidas de frutos infetados com o vírus revelaram a ausência do PLYV, cuja presença foi constatada em 112 tegumentos das 670 sementes analisadas. O PLYV não foi perpetuado por plantio direto de sementes, envolvendo 310 plântulas e 362 mudas, comprovando não ser o mesmo transmitido por semente de forma embrionária. De outra parte, a presença do PLYV foi comprovada por Elisa indireto em 49 de 456 sementes per si testadas.

Caracterização morfocultural e molecular de isolados de Colletotrichum gloeosporioides patogênicos ao mamoeiro

Vinte e nove culturas monospóricas de Colletotrichum, isoladas de frutos e pecíolos de mamoeiro (Carica papaya), foram caracterizadas quanto à morfologia dos conídios e apressórios, coloração e crescimento das colônias, sensibilidade ao benomyl, presença de setas e do teleomorfo, PCR com primers taxon-específicos e análise de PCR-RFLP da região ITS. Os 29 isolados foram identificados como C. gloeosporioides com base na morfologia dos conídios e apressórios, tendo a maioria dos isolados conídios cilíndricos e/ou obclavados e apressórios lobados ou fracamente lobados, em contraste com C. acutatum, isolado de morango (Fragaria x ananassa), que apresentou conídios fusiformes e apressórios circulares e lisos. Presença de setas e do teleomorfo, cor de colônia, sensibilidade ao benomyl e velocidade de crescimento variaram conforme o isolado e sofreram influência do meio de cultura usado. Todos os isolados de mamão e quatro de outras hospedeiras, manga (Mangifera indica), morango e maçã (Malus domestica), foram patogênicos a frutos de mamão cv. Sunrise Solo, mas com variabilidade em agressividade. PCR com o primer específico para C. gloeosporioides, CgInt, confirmou a identidade de apenas quatro isolados de mamão e dois isolados apresentaram reação positiva com o primer CaInt2, específico para C. acutatum. A maioria dos isolados de mamão (23) não reagiu com nenhum dos primers. Por outro lado, a análise de restrição da região ITS do rDNA, com RsaI, gerou perfis distintos entre C. gloeosporioides e C. acutatum e mostrou uniformidade entre os isolados de mamão.

Critical-point yield model to estimate yield damage caused by Cercospora zea-maydis in corn

A model to estimate damage caused by gray leaf spot of corn (Cercospora zea-maydis) was developed from experimental field data gathered during the summer seasons of 2000/01 and during the second crop season [January-seedtime] of 2001, in the southwest of Goiás state. Three corn hybrids were grown over two seasons and on two sites, resulting in 12 experimental plots. A disease intensity gradient (lesions per leaf) was generated through application, three times over the season, of five different doses of the fungicide propiconazol. From tasseling onward, disease intensity on the ear leaf (El), and El - 1, El - 2, El + 1, and El + 2, was evaluated weekly. A manual harvest at the physiological ripening stage was followed by grain drying and cleaning. Finally, grain yield in kg.ha-1 was estimated. Regression analysis, performed between grain yield and all combinations of the number of lesions on each leaf type, generated thirty linear equations representing the damage function. To estimate losses caused by different disease intensities at different corn growth stages, these models should first be validated. Damage coefficients may be used in determining the economic damage threshold.

Reação de genótipos de mamoeiro à varíola e à podridão-do-pé

Genótipos de mamoeiro (Carica papaya) ('NT Red', 'Golden', 'Baixinho de St. Amália', 'Sunrise Solo', 'Cross Paris', 'Tailândia Verde', 'Tailândia Roxo', 'Tailândia Roxão', 'Sekati' e 'Tainung-1') foram avaliados quanto à reação à varíola (Asperisporium caricae) e à podridão-do-pé (Phytophthora palmivora). O estudo foi conduzido em uma área com plantas naturalmente infectadas com ambos os patógenos e sob telado utilizando solo naturalmente infestado com P. palmivora. A severidade de varíola foi avaliada usando-se uma escala, de 1 (0-3% da superfície coberta por lesões) a 6 (>de 50% da superfície coberta por lesões). As avaliações foram feitas entre março e abril / 2003 e entre outubro 2003 e fevereiro 2004. A podridão-do-pé foi avaliada, no campo, por incidência em cada cultivar nos mesmos períodos. Nos experimentos sob telado a severidade da doença por P. palmivora foi avaliada em cada planta utilizando-se a seguinte escala: 0- sem sintomas; 1- até 50% de murcha; 2- de 51 a 100% de murcha; 3- morta. Quanto à varíola, verificou-se que plantas de 'Sekati' (grupo Formosa) apresentaram os menores valores médios finais de severidade da doença na folhagem (2,0) enquanto que, 'Golden' (3,1) e'NT Red' (3,7) apresentaram os maiores. Nos frutos, 'Tailândia Roxão' (1,6), 'Tailândia Verde' (1,7) e 'Sekati' (1,7) apresentaram os menores valores de varíola, enquanto que, 'Tailândia Roxo' (2,3), 'Cross Paris' (2,5), e 'Sunrise Solo' (3,1) apresentaram os maiores. Quanto à podridão do pé, 'Tailândia Roxão' (grupo Formosa) apresentou a menor quantidade de doença, enquanto que, 'Golden', 'Sunrise Solo e 'NT Red' apresentaram os maiores valores.

Progresso de doenças fúngicas e correlação com variáveis climáticas em mamoeiro

Avaliou-se o progresso de doenças fúngicas do mamoeiro e os efeitos dos fatores climáticos em três áreas experimentais: 1- área de produção de mamão conduzida no sistema convencional, que recebeu irrigação por gotejamento; 2- área de produção de mamão conduzida no sistema convencional, que recebeu irrigação por aspersão; 3- área de produção de mamão cultivada no sistema orgânico, com irrigação por microaspersão. Na área 1 foram avaliados três sistemas diferentes de condução: 1) sem a aplicação de fungicidas e sem sanitização das plantas (testemunha sem sanitização); 2) sem a aplicação de fungicidas e com sanitização das plantas (testemunha com sanitização); e 3) com a aplicação de fungicidas para o controle de doenças foliares e sem sanitização (padrão do produtor). Em cada sistema de condução foram demarcadas quatro parcelas (repetições) com 20 plantas, sendo 10 plantas consideradas úteis. Foram avaliadas a incidência e a severidade da mancha-de-ascoquita, pinta-preta e do oídio como doenças foliares. Nos frutos, após a colheita foram avaliadas as incidências da antracnose, mancha-chocolate e podridão-peduncular. As epidemias da mancha-de-ascoquita ocorrem em temperaturas variando de 15 ºC a 20 ºC; para a pinta-preta as condições favoráveis ao desenvolvimento de epidemias foi temperatura variando de 25 ºC a 30 ºC e umidade relativa variando de 80 % a 100 %, sendo o pico da intensidade da doença ocorre entre os meses de novembro a março. Para o oídio, a faixa de temperatura que favoreceu a doença foi 15 ºC a 20 ºC e umidade relativa de 60 a 70 %. Em relação às podridões que incidiram nos frutos, observou-se que não houve relação entre a incidência da podridão-peduncular e a precipitação pluvial acumulada, 15 dias antes da avaliação ou no período de desenvolvimento do fruto (r <0,21). A incidência da antracnose e da mancha-chocolate não se correlacionaram com as condições climáticas. Na área Santa Terezinha 10, a mancha-de-ascochyta foi constatada em todas as épocas de avaliação, tendo severidade máxima na data juliana 155 aos 250 dias e mínima dos 20 aos 80 dias; a pinta-preta progrediu na data 326 aos 70 dias com severidade máxima na data 336 dias, e o oidio progrediu em duas épocas distintas sendo uma na data 330 aos 80 dias e a outra na data 240 aos 320 dias com o máximo na data 240 a 250 dias. A incidência da podridão dos frutos em pós-colheita foi detectada no armazenamento, quando os frutos foram colhidos nas datas de 140 aos 320 dias, sendo alta até a data 220; a partir daí decresceu até a data 320. O tratamento padrão praticado pelo produtor diferiu significativamente dos tratamentos envolvendo práticas culturais com e sem sanitização, excetuando a podridão peduncular onde o tratamento padrão igualou-se ao tratamento com sanitização. Os tratamentos culturais com e sem sanitização não diferiram entre si. Comparando-se os tratamentos com sanitização e sem sanitização para podridão peduncular houve ganhos de 24 % e 9 %, para as datas julianas 170 e 210, respectivamente; para a antracnose houve ganhos de 13 % e 55 %, para as datas julianas 160 e 230, respectivamente e para a mancha-chocolate 30 % e 9 %, para as datas julianas 170 e 210, respectivamente. O progresso das doenças nas áreas de plantio do curral e Bitchisner foram quase idênticos com relação à incidência de folhas doentes total; a severidade máxima da mancha-de-ascoquita atingiu 20 % na área do curral e 10 % na área Bitchisner, entre as datas 110 e 320. A pinta-preta foi muito severa na lavoura do curral e de baixa severidade na lavoura Bitchisner. O oidio foi detectado nas duas lavouras nas datas 230 aos 320, com maior severidade na lavoura do curral onde predomina a irrigação por aspersão. Obtêve-se severidade do Oidio máxima de 45 e 65 % nas lavouras do curral e Bitchisner, respectivamente. Em se tratando da podridão dos frutos do mamoeiro, a incidência foi maior nas plantas da localidade do curral do que Bitchisner devido ao método de irrigação por aspersão.

Ability of Aphis gossypii and Myzus persicae to Transmit Cucumber mosaic virus in Single and Mixed Infection with Two Potyviruses to Zucchini Squash

The main objective of this work was to investigate the ability of Aphis gossypii and Myzus persicae to transmit Cucumber mosaic virus (CMV) singly and mixed with two potyviruses (Papaya ringspot virus - type W, PRSV-W and Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV), to zucchini squash plants (Cucurbita pepo). The results showed that the potyviruses in general were more efficiently transmitted by both species of aphids as compared to CMV. The transmission of PRSV-W, ZYMV and CMV separately was more efficient than in mixture.