Variabilidade genética de isolados do complexo Colletotrichum associados a sementes de algodoeiro, por meio de técnicas moleculares e inoculação em plantas

A antracnose e a ramulose são doenças do algodoeiro (Gossypium hirsutum) causadas, respectivamente, por Colletotrichum gossypii e C. gossypii var. cephalosporioides, sendo a ramulose a mais importante sob o ponto de vista de prejuízos causados. Por se tratarem de fungos transmitidos por sementes, de difícil diferenciação por métodos convencionais, o desenvolvimento de metodologia usando técnicas moleculares é uma opção que se dispõe na busca de maior precisão e rapidez. O presente trabalho objetivou associar informações do teste de patogenicidade com marcadores bioquímicos e moleculares de DNA/RAPD, visando a identificação e diferenciação do complexo Colletotrichum. Foram usados dez isolados, sendo três classificados como causadores de antracnose e sete de ramulose, pelo teste de patogenicidade. Os marcadores bioquímicos não se mostraram eficientes para a distinção dos isolados causadores da ramulose e da antracnose. Na análise de RAPD, o valor de similaridade encontrado para os dois grupos foi de 51,7%, confirmando a potencialidade da técnica para diferenciar tais fungos.

Seqüenciamento e variabilidade do fragmento genômico de Xylella fastidiosa amplificado pelos iniciadores RST31/33

Xylella fastidiosa é agente causal de diversas doenças de importância econômica como a clorose variegada dos citros (Citrus spp.) (CVC), mal de Pierce da videira (Vitis vinifera), escaldadura da ameixeira (Prunus salicina) e requeima do cafeeiro (Coffea arabica). A seqüência nucleotídica do fragmento genômico, específico de X. fastidiosa, amplificado pelo par de iniciadores RST31/33 foi determinada para 38 isolados de citros e para isolados de videira, cafeeiro e ameixeira objetivando avaliar o nível de polimorfismo entre isolados e a identidade genômica do fragmento. Não foi observado polimorfismo de seqüência nucleotídica entre isolados de citros, mas foi detectado polimorfismo entre isolados de citros e de videira, cafeeiro e ameixeira. A presença do sítio de clivagem RsaI, que distingue isolados de citros e videira de isolados de ameixeira e outras espécies arbóreas, foi identificada em um isolado de ameixeira proveniente dos EUA mas não em outro proveniente do Brasil.

Variabilidade de isolados de Microcyclus ulei no Sudeste da Bahia

O fungo Microcyclus ulei, causador do mal-das-folhas da seringueira (Hevea brasiliensis), é o maior responsável pelo insucesso da heveicultura nas áreas tradicionais de cultivo no Brasil. Com o objetivo de conhecer melhor a diversidade desse patógeno foram estudados 50 isolados, obtidos nos anos 1997 e 1998, de uma área de 5.000 ha de seringueira da "Plantações Michelin da Bahia", no Sudeste da Bahia, através do tipo de reação de 12 clones de seringueira. As inoculações foram realizadas na face inferior dos folíolos jovens, repetidas três ou mais vezes em plantas diferentes, em câmara úmida com umidade superior a 95% e temperatura variando de 23 a 26 ºC. Após 12 dias efetuaram-se as avaliações, utilizando-se uma escala de notas de 1 a 6, que mede a virulência e a intensidade de esporulação. Foram identificados 36 padrões de virulência entre os 50 isolados testados, sendo que 21 apresentaram virulência a mais de nove clones e nenhum foi virulento a todos os 12 clones diferenciadores. A agressividade dos isolados, avaliada através da intensidade de esporulação, variou bastante com o clone. A exceção dos isolados FTP 11 e FTP 44, que de modo geral apresentaram uma agressividade fraca, um mesmo isolado apresentou-se altamente agressivo a um determinado clone e fracamente agressivo a outro. Alguns isolados, entretanto, mostraram uma alta agressividade aos clones de Hevea benthamiana, e outros aos clones de H. brasiliensis. Quatro isolados pareceram especializados sobre o clone FX 2784.

Variabilidade de isolados de Alternaria brassicicola no Estado de Pernambuco

A variabilidade de 38 isolados de Alternaria brassicicola foi estimada com base em variáveis relacionadas ao desenvolvimento da alternariose e à fisiologia do patógeno. Os isolados foram coletados de cultivos comerciais de crucíferas do Estado de Pernambuco. Cada isolado foi inoculado em plantas de repolho (Brassica oleracea var. capitata), cv. Midori, com 40 dias, em casa de vegetação e os seguintes componentes epidemiológicos foram medidos: período de incubação (PI), severidade da doença (SEV) aos dez dias após a inoculação, taxa de progresso da doença (TPD) e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD). Cada isolado foi também avaliado quanto à taxa de crescimento micelial (TCM), esporulação (ESP), germinação de conídios (GER) e sensibilidade ao fungicida iprodione (ICM). Constatou-se grande variabilidade quanto às variáveis medidas. Não houve efeito significativo de hospedeiro do qual os isolados foram obtidos e a variabilidade entre isolados de uma hospedeira foi, em geral, maior que a variância residual; à exceção para as variáveis PI e GER. Não foram verificadas correlações significativas (P=0,05) das variáveis associadas à doença (PI, SEV, TPD e AACPD) com as demais variáveis. A análise da distancia Euclidiana por UPGMA não permitiu a separação dos 38 isolados do patógeno em grupos de similaridade, o que sugere variabilidade nas populações de A. brassicicola.

Análise da variabilidade genética de duas cultivares Raminad Str. 3 utilizadas como diferenciadoras de raças de Pyricularia grisea

O conhecimento sobre a ocorrência e distribuição de raças do fungo Pyricularia grisea é um importante aspecto a ser considerado em programas de melhoramento genético de arroz (Oryza sativa). No entanto, para que a identificação das raças seja correta e passível de comparações com outros levantamentos é necessário que os genótipos utilizados apresentem as mesmas características genéticas. O presente trabalho foi realizado com os objetivos de comparar a variação genética entre dois genótipos identificados como pertencentes à cultivar Raminad Str. 3, que é uma das oito cultivares utilizadas como direnciadoras de raças de P. grisea, e examinar a composição de raças deste fungo no estado do Rio Grande do Sul. Constatou-se a amplificação de fragmentos polimórficos em 20 dos 39 marcadores microssatélites utilizados para verificar a pureza genética de dois genótipos de arroz identificados como sendo a cultivar Raminad Str. 3. A identificação das raças baseou-se na reação das oito cultivares diferenciadoras de raças submetidas à inoculação com 85 isolados monospóricos de P. grisea, provenientes de 14 municípios produtores de arroz no Rio Grande do Sul. A avaliação do grau de infecção foi realizada de acordo com a escala preconizada pelo sistema internacional de avaliação de doenças do arroz, 14 dias após a inoculação.

Análise comparativa da variabilidade patogênica de Uromyces appendiculatus em algumas regiões brasileiras

A ferrugem do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris), incitada pelo fungo Uromyces appendiculatus, é uma das mais importantes doenças que afetam essa cultura. Trabalhos anteriores demonstraram a ampla variabilidade patogênica de U. appendiculatus no Brasil. No entanto, o uso de distintos grupos de cultivares diferenciadoras em tais trabalhos dificulta a análise comparativa e a identificação de fontes de resistência de amplo espectro. Assim, os objetivos deste trabalho foram: 1) caracterizar sete isolados de U. appendiculatus, coletados em diferentes regiões do estado de Minas Gerais, frente às 19 cultivares diferenciadoras para ferrugem, adotadas no "The Bean Rust Workshop", realizado em 1983, em Porto Rico, e 2) comparar os padrões de resistência/suscetibilidade obtidos, com aqueles apresentados frente a patótipos isolados nos estados de Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Goiás, visando identificar fontes de resistência de amplo espectro. Os sete isolados coletados em Minas Gerais foram classificados com sete patótipos distintos. As cultivares diferenciadoras com os maiores espectros de resistência foram 'Redlands Pioneer', 'California Small White 643', 'Brown Beauty', 'AxS 37' e 'Compuesto Negro Chimaltenango'. Portanto, apesar da exclusão das cultivares California Small White 643, AxS 37 e Brown Beauty da nova série diferenciadora internacional proposta em 2002, na África do Sul, recomenda-se adicionar estas cultivares nas futuras caracterizações de patótipos a serem realizadas no Brasil, como um modo de monitorar a variabilidade patogênica de populações de U. appendiculatus nas regiões produtoras.

Avaliação da variabilidade do Grapevine leafroll-associated virus 1 e 3 por análise de seqüências de nucleotídeos e polimorfismo conformacional de fita simples

As principais espécies de vírus envolvidas na etiologia do enrolamento da folha da videira (Vitis spp.) são Grapevine leafroll-associated virus 1 e 3 (GLRaV-1 e -3). Neste estudo da variabilidade desses vírus, foram amplificados dois fragmentos de DNA (396 bp do GLRaV-1 e 602 bp do GLRaV-3) por RT-PCR, a partir de RNA total extraído de nervuras e pecíolos de videiras infetadas, utilizando-se dois pares de oligonucleotídeos. Os DNAs amplificados foram clonados e reamplificados, a partir dos clones recombinantes, e comparados quanto às diferenças conformacionais das fitas simples desnaturadas (SSCP). Foram observados dois padrões distintos de perfis eletroforéticos para cada vírus, tendo sido seqüenciado pelo menos um clone viral correspondente a cada padrão. As duas seqüências de nucleotídeos obtidas para o GLRaV-1 apresentaram maior homologia (79,8% e 87,4%) com um isolado australiano e as duas seqüências relativas ao GLRaV-3 exibiram maior homologia (75,1% e 81,8%) com um isolado norte-americano. Os resultados demonstraram a ocorrência de seqüências variantes destes vírus nas videiras analisadas.

Variabilidade isoesterásica associada a genes de resistência à ferrugem da folha do trigo

A triticultura brasileira apresenta constantes perdas no rendimento, associadas à ocorrência da ferrugem da folha, causada pelo fungo Puccinia triticina. A incorporação da resistência genética e o conhecimento do número de genes envolvidos são importantes para os programas de melhoramento genético vegetal, que a cada ano têm introduzido resistência qualitativa nas cultivares, visando superar o aparecimento de novas raças do patógeno. As técnicas bioquímicas, baseadas na análise de polimorfismo de enzimas, possibilitam a rápida e precisa detecção de marcadores moleculares, para o estudo de aspectos básicos de genética vegetal, bem como representam valiosa ferramenta de apoio aos programas de melhoramento, pois permitem a identificação antecipada de genótipos resistentes e suscetíveis. Este trabalho visa avaliar, fitopatológica e molecularmente, a população haplodiplóide Trigo BR 35 (resistente)/IAC 13-Lorena (suscetível) de trigo (Triticum aestivum), quanto à resistência de planta adulta à ferrugem da folha, bem como à similaridade genética presente na progênie haplodiploidizada na geração F1. Nas avaliações fitopatológicas em planta adulta, das 96 linhas duplo-haplóide, 29 foram resistentes, 15 suscetíveis e 52 intermediárias apresentaram reação que variou entre nível de resistência inferior ao determinado para Trigo BR 35 a menos suscetível do que IAC 13-Lorena. A análise genética revelou dois genes parcialmente dominantes. Na análise bioquímica, através do sistema isoenzimático das esterases, foram detectadas, seis bandas, todas anódicas e com especificidade alfa-esterásica, cujas MRs (migração relativa) variaram de 0,09 a 0,69. Quanto à variabilidade genética, foi detectada, para as 96 linhas, elevada similaridade genética, a qual confirmou as análises isoesterásicas.

Variabilidade patogênica de Phaeoisariopsis griseola na Costa Rica

Devido ao consistente aumento na incidência e severidade da mancha angular do feijoeiro (Phaseolus vulgaris), causada por Phaeoisariopsis griseola, na América Latina nos últimos anos, esta doença vem sendo considerada como uma das que provocam maiores perdas na cultura do feijoeiro comum. Normalmente, a infecção ocorre depois da quarta semana de cultivo, causando lesões necróticas nas folhas, cloroses e desfolhação precoce, pelo qual o rendimento é diminuido significativamente. As populações deste fungo mostram grande variabilidade patogênica, a qual apresenta patótipos com alto grau de adaptação ao acervo genético do hospedeiro, como resultado de um processo de co-evolução. O presente trabalho teve como objetivo estudar a variabilidade patogênica do fungo P. griseola a partir de isolamentos monospóricos provenientes das zonas produtoras de feijão na Costa Rica. Uma população de 61 isolamentos foi inoculada no grupo de diferenciadoras de P. griseola, o qual é composto de genótipos andinos e mesoamericanos. Com base na reação das diferenciadoras aos isolados inoculados, confirmou-se a variabilidade do fungo na Costa Rica; foram identificados 21 patótipos, dos quais o 0-0 e o 0-53 foram os mais freqüentes e de ampla distribuição geográfica. Os patótipos 20-21, 8-0, 42-57 e 52-57 foram os menos frequentes. As diferenciadoras mesoamericanas foram mais suscetíveis ao patógeno; no entanto, não foi detectada especificidade dos isolamentos, já que várias das diferenciadoras andinas também foram suscetíveis à doença. Os resultados sugerem a importância de se conhecer a variabilidade do fungo P. griseola, e de se incorporar genes de resistência em novos genotipos desenvolvidos através de programas de melhoramento.

Variabilidade fisiológica em populações de Meloidogyne paranaensis

Comparou-se a capacidade reprodutiva de duas populações de Meloidogyne paranaensis, originárias de plantas de soja (Mp-s) e de cafeeiro (Mp-c), em diferentes hospedeiros. A população Mp-s apresentou maior capacidade reprodutiva que a Mp-c, apresentando fator de reprodução superior em tomateiro e em duas cultivares de soja, porém em cafeeiro a Mp-c reproduziu melhor. Em tomateiro 'Santa Clara', ambas reproduziram significativamente mais que nos outros hospedeiros e não houve diferença entre as cultivares de soja 'MS/BR 34' e 'Fepagro RS 10'. Contudo, maior número de populações deverá ser estudado.

Detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) em bananeiras no Brasil

A técnica de PCR utilizando-se "primers" degenerados para o gênero Badnavirus foi utilizada para a detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) provenientes de bananeiras. A partir desta metodologia seqüências do vírus puderam ser detectadas em cultivares diplóides (AA), triplóides (AAA; AAB) e tetraplóides (AAAB). Foram encontrados quatro padrões de seqüência do BSV (estirpes BSVBR-1, BSVBR-2, BSVBR-3 e BSVBR-4), diferenciadas através da análise do perfil eletroforético das amostras amplificadas. A estirpe BSVBR-1 prevalece nos estados do Acre, Amazonas, Bahia, Ceará, Goiás, Minas Gerais, Piauí, Rio de Janeiro, Rondônia, Santa Catarina, e São Paulo, enquanto que, a estirpe BSVBR-2 foi encontrada em amostras oriundas do Amazonas e do Ceará. As estirpes BSVBR-3 e BSVBR-4 foram encontradas apenas no Ceará. Este trabalho revela a presença de diferentes estirpes do BSV no Brasil, bem como a existência de cultivares de bananeiras sadias e livres de seqüências virais do BSV integradas ao seu genoma.

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Variabilidade biológica de isolados do Citrus leprosis virus (CiLV) oriundos de cultivares de laranjeira

A leprose, causada pelo Citrus leprosis virus (CiLV), é uma das principais doenças presentes em pomares cítricos fluminenses. O objetivo deste trabalho foi comparar o quadro sintomatológico desenvolvido por isolados de CiLV obtidos de cultivares comerciais de laranjeira (Lima, Pêra e Seleta), inoculados mecanicamente em Chenopodium amaranticolor, em três diluições. Após cinco a sete dias da inoculação foram observadas lesões necróticas, com pequeno halo clorótico quando observadas contra a luz. O maior número de lesões, nas três diluições, foi obtido do isolado de 'Seleta', seguido por 'Pêra' e 'Lima'. A melhor diluição utilizada para a observação das lesões foi de 1:10. Os resultados demonstram uma possível variabilidade biológica entre os isolados virais e/ou uma menor ou maior replicação viral, dependendo da cultivar, indicando um possível mecanismo de resistência da planta ao vírus.

Detecção e variabilidade de Plasmopara halstedii no Brasil e avaliação da resistência de genótipos de girassol ao míldio

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de identificar a raça fisiológica de Plasmopara halstedii que ocorreu em plantas de girassol coletadas no campo experimental da Embrapa Soja, Londrina, PR, em 1998, 2001 e 2002 e avaliar a reação de genótipos de girassol ao míldio. Plântulas de girassol das diferenciadoras de raças e das cultivares foram inoculadas com suspensão de zoosporângios do patógeno e foram plantadas em caixas contendo areia autoclavada. As plântulas foram mantidas em câmara climatizada, com temperatura controlada em 21ºC, por 11 dias. Em seguida, as plantas foram aspergidas intensamente com água destilada, cobertas com saco plástico e mantidas no escuro, a 18ºC. No dia seguinte, foi observada a presença de esporulação nos cotilédones. As plantas que apresentaram esporulação foram consideradas suscetíveis e as sem esporulação foram resistentes. O resultado indicou tratar-se da raça 330 (antiga raça 7 americana), nas três ocasiões. Os genótipos de girassol Embrapa 122, BRS 191 e as cultivares de girassol ornamental BRS Capri M, BRS Encanto M, BRS Oásis, BRS Paixão M, BRS Pesqueiro M, BRS Refúgio M, BRS Saudade M e BRS Saudade U e seus respectivos parentais foram suscetíveis a P. halstedii raça 330. Os genótipos AGROBEL 910, AGROBEL 920, AGROBEL 960, AGROBEL 965, C11, EXP38, M734, M742 e RUMBOSOL 91 foram resistentes à raça 330 do patógeno e podem ser indicados aos agricultores para uso em regiões de risco de ocorrência da doença.

Variabilidade patogênica e efeito de carboidratos no crescimento micelial, esporulação e agressividade de Colletotrichum gloeosporioides da pupunheira

A agressividade de 17 isolados de Colletotrichum gloeosporioides associados à antracnose em folhas da pupunheira (Bactris gasipaes), oriundos de estados no Norte, Sudeste e Sul do Brasil, foi avaliada através de bioensaio com folhas de pupunheira destacadas, em três estágios de desenvolvimento: jovem, intermediária e completamente expandida. Diferenças significativas na agressividade dos isolados foram verificadas apenas em folhas completamente expandidas e intermediárias. O emprego de diferentes carboidratos, tais como glicose, maltose ou amido, em suplemento ao meio batata-ágar, influenciou o crescimento micelial e a esporulação de alguns isolados. A agressividade de dois isolados, dentre cinco isolados testados, foi significativamente maior quando os conídios foram produzidos no meio de cultura com amido, em relação aos meios com glicose e maltose.