Caracterização do Tomato chlorotic spot virus isolado de jiló no Vale do Paraíba, Estado de São Paulo

Os tospovírus são responsáveis por perdas significativas em diversas culturas, principalmente solanáceas. No município de São José dos Campos (SP), plantas de jiló (Solanum gilo) apresentando sintomas de mosaico, bolhosidades, nanismo e queda acentuada da produção foram coletadas para análise. Visando a caracterização do agente causador dos sintomas, testes biológicos, elétrono microscópicos, sorológicos e moleculares foram realizados. Através de inoculação mecânica em plantas indicadoras das famílias Amaranthaceae, Chenopodiaceae e Solanaceae obtiveram-se resultados típicos aos esperados para tospovírus. Ao microscópio eletrônico de transmissão, observaram-se, em contrastação negativa, partículas pleomórficas com diâmetro entre 80 e 110 nm e em cortes ultra-finos partículas presentes em vesículas do retículo endoplasmático. Através de DAS-ELISA, identificou-se o Tomato chlorotic spot virus (TCSV). A partir de RNA total extraído de folhas infetadas, amplificaram-se, via RT-PCR, fragmentos correspondentes ao gene da proteína do capsídeo (cp) os quais foram seqüenciados e comparados com outros depositados no "GenBank". A homologia de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos foi respectivamente de 99 e 95% quando comparada com seqüências de isolados de TCSV. A comparação com as outras espécies do gênero Tospovirus apresentou valores de homologia entre 72 e 84%. Estes resultados confirmam a identidade deste vírus como pertencente à espécie TCSV, que é predominante no Estado de São Paulo e importante patógeno de outras plantas cultivadas. Além disso, variedades de jiló quando inoculadas foram susceptíveis tanto ao TCSV como às espécies Tomato spotted wilt virus (TSWV) e Groundnut ringspot virus (GRSV).

Identificação de marcadores RAPD ligados a um gene de resistência ao cancro da haste da soja

O cancro da haste da soja (Glycine max) é uma importante doença causada pelo fungo Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis/Phomopsis phaseoli f. sp. meridionalis. Visando identificar marcadores RAPD associados a genes de resistência ao cancro da haste, causado pelo isolado CH8, presentes na linhagem UFV 91-61, foi realizado, inicialmente, um estudo sobre a herança da resistência, por meio do cruzamento desta linhagem com a variedade suscetível Paranaíba. Os resultados indicaram que um gene dominante controla a resistência a este isolado. Através de análises com marcadores moleculares na população F2 foram identificados dois marcadores RAPD produzidos pela amplificação do primer OPAB19. Os dois fragmentos de DNA de aproximadamente 1.150 e 1.320 pb produzidos por este primer estão ligadas em fases de repulsão e acoplamento, respectivamente, a uma distância de 4,7 cM do gene de resistência da linhagem UFV 91-61. Estes marcadores poderão ser usados para monitorar a introgressão deste gene em cultivares de soja adaptados e abre a possibilidade de uma sistemática procura de marcadores ligados a outros genes de resistência para o cancro da haste da soja, os quais poderiam ser posteriormente piramidados num único background genético.

Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA) pode diferenciar Fusarium solani f. sp. phaseoli de F. solani f. sp. glycines

Métodos moleculares têm sido utilizados para caracterizar a diversidade entre isolados de Fusarium spp. patogênicos e não patogênicos a uma cultura e, para determinar relações genéticas entre formae speciales. Testes de patogenicidade realizados em soja (Glycine max) e feijoeiro (Phaseolus vulgaris) com 17 isolados de Fusarium solani não demonstraram especificidade de hospedeiros. Utilizou-se a técnica ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) para analisar a região ITS1 - 5,8S rDNA - ITS2, amplificada com os primers ITS5 e ITS4. Os produtos amplificados foram digeridos com as enzimas de restrição Hae III e Msp I. Os padrões de bandas gerados pela digestão com a enzima Hae III permitiram diferenciar três grupos entre os isolados de F. solani, sendo um grupo específico para isolados de F. solani f. sp. phaseoli com 100% de similaridade entre os 11 isolados. Entre os isolados de F. solani f. sp glycines foram observados dois padrões distintos de restrição. A técnica de ARDRA utilizando a enzima Hae III apresenta, portanto, potencial para utilização como um marcador para diferenciação entre as formae specialesphaseoli e glycines, dentro do complexo F. solani.

Mapeamento de genes de resistência do feijoeiro à ferrugem, antracnose e mancha-angular usando marcadores RAPD

A organização de diferentes genes de resistência da cultivar Ouro Negro de feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris) à ferrugem, antracnose e mancha-angular foi estudada com o auxílio de marcadores moleculares. Uma população de 154 linhas endogâmicas recombinantes (RIL's) obtidas do cruzamento entre as cultivares Ouro Negro e Rudá foram inoculadas com sete raças fisiológicas de Uromyces appendiculatus, três de Colletotrichum lindemuthianum, e quatro de Phaeoisariopsis griseola. Amostras de DNA de cada uma das RIL's foram amplificadas via PCR utilizando 70 diferentes primers. A análise da segregação da resistência à ferrugem, antracnose e mancha-angular na população de 154 RIL's revelou diferentes modos de herança para a resistência a cada uma das raças fisiológicas. A análise de ligação genética revelou que os diferentes genes de resistência à ferrugem e à antracnose estão no mesmo grupo de ligação. Os genes de resistência à mancha-angular também foram mapeados juntos, porém em outro grupo de ligação. Verificou-se neste trabalho que a utilidade dos marcadores RAPD, previamente identificados como ligados a genes de resistência do feijoeiro a doenças foi restrita. Apenas cinco dos 38 marcadores moleculares testados foram validados na população de RIL's como ligados aos genes de resistência à ferrugem e à antracnose. Três novos marcadores (OBA16(669) e OBA16(583) a 10,4 cM em acoplamento e OAD9(3210) a 13,9 cM em repulsão) ligados ao bloco gênico de resistência da cultivar Ouro Negro à mancha-angular foram identificados.

Resistência de genótipos de tomateiro a um isolado de geminivírus do cinturão verde de Campinas, São Paulo

Plantas de tomateiro (Lycopersicon esculentum) apresentando sintomas de amarelecimento do limbo foliar principalmente nas nervuras, redução de crescimento e distorções foliares foram coletadas em lavouras do cinturão verde de Campinas, São Paulo, e mantidas no Centro Experimental de Campinas (IAC), para utilização em experimentos de avaliação de resistência de genótipos à virose. A partir de análises moleculares, o vírus foi identificado como Tomato yellow vein streak virus (TYVSV). Foram feitas avaliações em campo (infecção natural) e em telado (infecção natural e controlada), usando-se diversos genótipos, abrangendo cultivares, híbridos, linhagens e populações, além de espécies selvagens de tomateiro. Alguns dos genótipos e híbridos contêm o gene de resistência Ty-1. Em campo, destacou-se o híbrido 'BX 1016158' com as menores incidências de doença. Em telado (infecção natural), híbridos interespecíficos de L. esculentum x L. peruvianum, e a linhagem PI 134417 (L. hirsutum) mostraram-se os mais resistentes ao isolado. O método de avaliação precoce em telado (infecção controlada) mostrou-se adequado para discriminar genótipos resistentes ao isolado. Por meio desse método, constatou-se a resistência das linhagens 'LA 444-1' (L. peruvianum), F4(TySw5) e a série IAC 14-2, e dos híbridos 'Franco' e BX1653088 ('Densus'), os quais receberam notas próximas de um ou não apresentaram sintomas.

Coevolución de interacciones hospedante - patógeno en frijol común

La coevolución en varios patosistemas del frijol ha sido demostrada en los últimos años. Con base en diferencias morfológicas (color y tamaño del grano, hábitos de crecimiento de la planta, forma de las hojas, y forma y tamaño de las vainas), tipo de proteína en las semillas, respuestas serológicas, análisis de isoenzimas, y patrones polimórficos de bandas utilizando técnicas moleculares (RFLP, RAPD y AFLP), se han sugerido dos centros de domesticación del frijol común: Mesoamérica (América Central, Antillas y México) y la Zona de los Andes. En estas regiones, las variedades cultivadas y silvestres presentan una gran variabilidad fenotípica y genética. La amplia variabilidad genética es también una característica de la mayoría de los patógenos de plantas. En frijol, tres patógenos han mostrado una íntima asociación con el acervo genético del hospedante, estos son: Colletotrichum lindemuthianum,Phaeoisariopsis griseola y Uromyces appendiculatus. Estos hongos presentan patogenicidad específica en los hospederos del correspondiente centro de origen. Poblaciones mesoamericanas de los tres organismos son más virulentas que las respectivas andinas, y genéticamente más variables. Este comportamiento ha sugerido un proceso de coevolución del patosistema. El conocimiento de la variabilidad genética y especificidad en las poblaciones nativas es preciso para el desarrollo de programas de mejoramiento y selección de fuentes de resistencia durables y efectivos para cada país de la región (gene deployment).

Herança da resistência à antracnose na cultivar de feijoeiro comum Cornell 49-242

A cultivar de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) Cornell 49-242, possuidora do gene de resistência Co-2 (Are), é uma das mais antigas fontes de resistência à antracnose, causada por Colletotrichum lindemuthianum. Visando a utilização desta fonte no programa de piramidação de genes em cultivares do tipo "carioca" do BIOAGRO/UFV, este trabalho teve como objetivos: (1) definir o padrão de herança da resistência da cultivar de feijoeiro Cornell 49-242 em cruzamentos com cultivares suscetíveis às raças 81 (Rudá) e 65 (Rudá e Ouro Negro) de C. lindemuthianum e (2) avaliar o marcador RAPD OPQ04(1440C) ligado ao gene Co-2 em populações F2 do cruzamento Rudá vs. Cornell 49-242. Os resultados indicaram que três genes dominantes, sendo dois de caráter complementar, controlam a resistência ao patótipo 81 de C. lindemuthianum, enquanto que um gene dominante e um recessivo controlam a resistência ao patótipo 65. O marcador OPQ04(1440C), previamente identificado como ligado ao gene Co-2 , pode ser usado, na prática, nesta população, para selecionar linhagens F2:3 contendo o gene Co-2.

Erigeron bonariensis: hospedeira alternativa do Lettuce mosaic virus no Brasil

O gênero Erigeron (Asteraceae), de plantas da vegetação espontânea, encontra-se amplamente disseminado nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, sendo freqüentemente encontrado em lavouras perenes e anuais. Plantas de E. bonariensis com sintoma de mosaico, típico do induzido por vírus, foram coletadas no município de São Paulo e submetidas a análises ao microscópio eletrônico de transmissão, testes biológicos, sorológicos e moleculares. Em cortes ultrafinos do tecido foliar original, observaram-se inclusões tubulares e cata-ventos dispersos no citoplasma. Através de inoculação mecânica, somente Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Nicotiana benthamiana e N. clevelandii foram infetadas. Os resultados obtidos em ELISA foram negativos quando se utilizaram antissoros contra o Turnip mosaic vírus (TuMV) e diferentes estirpes do Potato virus Y (PVY), constatando-se relacionamento sorológico com o Lettuce mosaic virus (LMV). Com a utilização de oligonucleotídeos específicos para LMV amplificaram-se fragmentos esperados de aproximadamente 280 pb, que seqüênciados confirmaram a identidade do vírus. A ocorrência do LMV em E. bonariensis, gênero da mesma família botânica da alface (Lactuca sativa), é de grande importância, pois talvez possa atuar como reservatório para infecção de campos de produção de alface. Este é o primeiro relato, no Brasil, de vírus infetando Erigeron sp., o qual só havia sido reportado como hospedeira natural do Bidens mottle virus (BiMoV) e do Tomato spotted wilt virus (TSWV) nos Estados Unidos.

A antracnose do sorgo

A antracnose, causada pelo fungo Colletotrichum graminicola, é a mais importante doença da cultura do sorgo (Sorghum bicolor) no Brasil. São reconhecidas três fases da doença: a antracnose foliar, a fase de podridão do colmo e a antracnose da panícula e dos grãos, sendo a fase foliar, a mais destrutiva, normalmente observada a partir de 30 a 40 dias após a emergência no estádio de desenvolvimento 4,0. O fungo Colletotrichum graminicola pode sobreviver por até 18 meses na ausência do hospedeiro, como micélio e conídios em restos culturais na superfície do solo, em hospedeiros alternativos e ainda como micélio, conídios e microesclerócios em sementes infetadas. Microesclerócios são produzidos em colmos secos de cultivares suscetíveis, sendo a sua sobrevivência maior em restos culturais mantidos na superfície do solo. O patógeno é altamente variável, conforme demonstrado através da virulência em plantas diferenciadoras e de marcadores moleculares. As implicações desta variabilidade no desenvolvimento de estratégias de manejo desta doença, através da resistência genética são aspectos discutidos neste trabalho.

Biologia molecular do processo de infecção por Agrobacterium spp.

Agrobacterium tumefaciens é o agente causal da galha-da-coroa, doença que afeta a maioria das plantas dicotiledôneas e caracteriza-se pelo crescimento de tumores na junção entre o caule e a raiz (coroa). A formação desses tumores é o resultado de um processo natural de transferência de genes de Agrobacterium spp. para o genoma da planta infetada. Esses genes estão contidos em um plasmídio de alto peso molecular (120 a 250 kb), denominado Ti ("tumor inducing"), presente em todas as linhagens patogênicas de Agrobacterium spp. Duas regiões do plasmídio Ti estão diretamente envolvidas na indução do tumor: a região-T, que corresponde ao segmento de DNA transferido para a célula vegetal, e a região de virulência (região vir), que contém genes envolvidos na síntese de proteínas responsáveis pelo processo de transferência da região-T. Esta região, uma vez transferida e integrada no genoma da célula vegetal, passa a ser denominada de T-DNA ("transferred DNA"). Os genes presentes no T-DNA codificam enzimas envolvidas na via de biossíntese de reguladores de crescimento, auxinas e citocininas. A síntese desses reguladores pelas células transformadas causa um desbalanço hormonal, levando à formação do tumor no local da infecção. Outro grupo de genes presentes no T-DNA codifica enzimas responsáveis pela síntese de opinas, que são catabolisadas especificamente pela bactéria colonizadora, como fonte de nutrientes. O conhecimento preliminar das bases moleculares envolvidas no processo de infecção de uma planta hospedeira por Agrobacterium spp., permitiu a utilização desta bactéria como vetor natural de transformação genética de plantas.

Caracterização e diversidade genética de isolados de Phytophthora spp. do cacaueiro com base em marcadores RAPD

Objetivou-se neste trabalho estudar a diversidade genética entre isolados das três principais espécies do gênero Phytophthora causadoras da podridão-parda do cacaueiro (Theobroma cacao) no Brasil, utilizando marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados 22 isolados de Phytophthora spp., sendo oito de P. capsici, cinco de P. palmivora e nove de P. citrophthora. DNA genômico de cada isolado foi extraído e amplificado utilizando-se sete "primers" decâmeros, os quais geraram 191 marcadores RAPD. Distâncias genéticas e análises de agrupamento realizadas com base nestes marcadores permitiram uma diferenciação clara dos isolados de cada espécie e mostraram diferentes níveis de diversidade intra-específica. Ficou evidente o potencial dos marcadores RAPD como uma ferramenta auxiliar na classificação dos isolados e, também, em estudos de diversidade genética intra-específica.

Produção de micélio de Crinipellis perniciosa em quatro meios de cultura, visando extração de DNA

A produção de massa micelial é o primeiro passo para obter amostras de DNA de qualidade e quantidade suficiente para análises moleculares. Neste trabalho, objetivou-se analisar a quantidade e a qualidade do DNA de Crinipellis perniciosa extraído a partir de massa micelial obtida em quatro meios de cultura. Foi avaliado o peso de micélio liofilizado produzido nos seguintes meios de cultura: 1. extrato de levedura (2,5%); 2. extrato de malte (2,5%); 3. BD (batata 20% e dextrose 2%) e 4. extrato de malte + BD (50% de cada meio). O crescimento micelial foi iniciado a partir de um disco de micélio colocado no centro de placas de Petri de 90 mm contendo o meio testado e mantidas a 25 ºC e fotoperíodo de 12 h, por dez dias. Foi utilizado o DIC com dez repetições. O micélio produzido foi liofilizado e o DNA extraído utilizando-se o método do SDS com a desproteinização feita com ou sem fenol. A pureza do DNA baseada na relação A260/A280 e a integridade em gel de agarose 0,8% foram analisadas. A quantidade de micélio produzida nos meios de cultura 1 e 4 foi maior do que nos meios 2 e 3. O DNA extraído a partir de micélio produzido nos meios 2 e 3 apresentou maior integridade, obtendo-se produtos de amplificação mais nítidos. A desproteinização com fenol possibilitou a extração de DNA mais puro. Porém, DNA de ótima qualidade e em quantidade suficiente pode ser extraído a partir de micélio produzido em meios baratos como o BD, sem a necessidade da desproteinização com fenol.

Espécies vegetais hospedeiras de begomovírus isolados de tomateiro em Goiás e no Distrito Federal

A determinação da gama de hospedeiros de begomovírus isolados de tomateiro (Lycopersicon esculentum) é de elevada importância nos estudos conduzidos com esses patógenos, uma vez que contribui para o entendimento da larga disseminação dos vírus em condições de campo e oferece subsídios para o estudo da variabilidade genética de espécies e estirpes identificadas em diversas regiões do país. Visando a determinação e a comparação da gama de hospedeiros de dois isolados de begomovírus de tomateiro obtidos de lavouras da região de Anápolis-GO (GO-ANPL) e do Distrito Federal (DF-BR2) inocularam-se 31 espécies vegetais pertencentes a oito famílias botânicas, sob duas modalidades de inoculação: mecânica e com a mosca branca, Bemisia tabaci biótipo B. Constatou-se que o GO-ANPL e o DF-BR2 infetaram exclusivamente plantas da família Solanaceae como Datura stramonium, Nicandra physalodes e Nicotiana benthamiana. Para o GO-ANPL, o número de espécies vegetais infetadas com o emprego do inseto vetor foi superior ao obtido pela inoculação mecânica, diferindo dos resultados obtidos para o DF-BR2 em que as plantas hospedeiras foram igualmente infetadas em ambos os métodos de inoculação. A comparação entre as hospedeiras dos dois isolados e destes com as de outros begomovírus de tomateiro da região Nordeste revelaram que há variação tanto nas espécies hospedeiras como na sintomatologia exibida pelas plantas infetadas. Os testes foram todos confirmados com hibridização com sondas moleculares, em "dot blot".

Padrão molecular e de virulência de isolados de Pyricularia grisea do Estado do Rio Grande do Sul

A obtenção de genótipos resistentes à brusone é uma das maiores dificuldades para os programas de melhoramento genético de arroz (Oryza sativa) devido à variabilidade do fungo Pyricularia grisea. Esta diversidade do fungo tem sido caracterizada por meio de marcadores moleculares de DNA e pela virulência de isolados do patógeno demonstrada em genótipos de arroz com diferentes genes de resistência à brusone. Os marcadores moleculares permitem identificar isolados de P. grisea em grupos geneticamente relacionados denominados de linhagens e as linhas isogênicas em grupos com padrões de virulência iguais ou muito similares. Assim, este trabalho foi realizado com os objetivos de verificar os padrões moleculares e de virulência de isolados de P. grisea do Rio Grande do Sul. O DNA de 51 isolados monospóricos de P. grisea obtidos do Rio Grande do Sul foi utilizado em reações de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores baseados na seqüência repetitiva Pot2. Os mesmos isolados também foram utilizados para inocular plantas de seis linhas isogênicas de arroz. A análise estatística indicou a ocorrência de seis linhagens e sete grupos de virulência. A ocorrência de isolados que causam reações de compatibilidade em linhas isogênicas que contêm o alelo Pi-1 foi maior do que aquelas que possuem o alelo Pi-2. As reações de compatibilidade na linha isogênica C 101 A51 caracterizaram-se pela baixa severidade, em geral, avaliadas como sendo de nota 4. Não foi verificada uma relação direta entre os padrões moleculares e de virulência dos isolados avaliados.

Marcadores RAPD na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum

Os fungos Acremonium strictum e Fusarium verticillioides normalmente apresentam algumas similaridades morfológicas, o que dificulta sua diferenciação em sementes de milho (Zea mays), particularmente quando ocorrem simultaneamente. Técnicas moleculares de análise do DNA têm possibilitado o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis eespecíficos no diagnóstico de fitopatógenos, em complemento à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de dez isolados de A. strictum obtidos de sementes de milho, provenientes de diferentes regiões produtoras brasileiras, por meio da análise do DNA genômico (RAPD). Objetivou-se ainda, diferenciar os isolados de A. strictum de F. verticillioides por meio da técnica citada. Pela análise do DNA, 25 primers Operon geraram polimorfismos, os quais tornaram possível e seguro o agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de F. verticillioides. Os isolados de A. strictum apresentaram variabilidade intraespecífica entre 3,4% e 44,4%. Para a maioria dos casos não foi possível correlacionar a similaridade genotípica e a origem geográfica dos isolados de A. strictum.