Detecção molecular e análise filogenética do gene H de amostras do vírus da cinomose canina em circulação no município de Campinas, São Paulo

O vírus da cinomose canina (CDV), um Morbillivirus da família Paramyxoviridae, é o agente etiológico de doença neurológica e sistêmica em cães. O diagnóstico laboratorial da infecção requer o isolamento viral ou detecção do material genético do vírus em secreções ou tecidos de cães com suspeita clínica da doença. A diversidade genética entre os isolados de CDV pode ser aferida pelo sequenciamento efilogenia molecular do gene que codifica a hemaglutinina viral (gene H), havendo atualmente um especial interesse em comparar as amostras circulantes a campo com o genogrupo América-1, que abrange as cepas presentes nas vacinas disponíveis no mercado. No presente estudo, foi realizada a detecção molecular do gene H de CDV a partir de amostras biológicas colhidas ante- e post- -mortem de 15 cães com sinais clínicos sugestivos de cinomose na região metropolitana de Campinas, São Paulo. Dez dos 15 cães analisados tiveram ao menos um órgão positivo na detecção molecular e os amplicons obtidos foram submetidos ao sequenciamento nucleotídico seguido de análise filogenética molecular. De forma semelhante ao que já foi reportado para estudo analisando a diversidade do gene H em outros países, a reconstrução filogenética obtida para as amostras de casos de cinomose da região de Campinas demonstrou as mesmas foram agrupadas junto a amostras norte-americanas, europeias e japonesas recentes, em um grupo genético distinto do grupo de amostras clássicas de CDV, nomeado America-1, o qual engloba as estirpes vacinais Snyder Hill, Onderstepoort e Lederle.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais do líquido amniótico equino obtido em diferentes idades gestacionais

O interesse nas pesquisas com células-tronco derivadas de anexos fetais de diversas espécies cresceu exponencialmente nas últimas décadas em virtude de serem fontes de células-tronco adultas com potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares que apresentam pouca ou nenhuma imunogenicidade, apresentando-se assim como alternativa de grande importância para a formação de bancos celulares. Apesar do crescente interesse, os estudos para espécie equina ainda são escassos. O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico equino obtidas do terço inicial, médio e final da gestação (LA-CTMs), comparando suas características. Foram colhidas 23 amostras de líquido amniótico as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e às diferenciações osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro. Todas as amostras demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico as células de todos os grupos foram imunomarcadas para CD44, PCNA e vimentina com ausência de marcação para citoqueratina e Oct-4. Na citometria de fluxo observou-se a expressão de CD44 e CD90 e ausência de expressão de CD34, sendo que os marcadores CD44 e CD90 mostraram padrão de expressão decrescente em relação ao desenvolvimento gestacional. As amostras obtidas de todas as fases da gestação foram capazes de diferenciação nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. Portanto, as células obtidas do líquido amniótico apresentaram características morfológicas, imunofenotípicas e potencial de diferenciação típicos das CTMs, demonstrando que a colheita pode ser realizada em qualquer fase gestacional. No entanto, mais pesquisas devem ser realizadas principalmente quanto à expressão de marcadores de pluripotencialidade (como o Oct-4) e ao seu potencial de diferenciação em linhagens extra mesodermais já relatados na literatura.

Isolamento e cultivo de neurônios e neuroesferas de córtex cerebral aviar

Métodos de cultivo celular são convenientes na realização de análises funcionais de alterações/interações protéicas das células neuronais, auxiliando a decifrar o interactoma de proteínas chaves na neurogênese de doenças do Sistema Nervoso Central. Por esse motivo, culturas de neurônios e neuroesferas isolados do córtex cerebral aviar representam um modelo acessível para o estudo de diversas doenças neurológicas, tal como a epilepsia. A espécie aviar apresenta peculiaridades em seu proteoma neuronal, visto a presença de uma expressão diferenciada de proteínas chaves no metabolismo energético cerebral, algumas destas (VDAC1 e VDAC2) desempenham papel importante na compreensão do mecanismo da epilepsia refratária. A metodologia estabelecida no presente estudo obteve cultivo de neuroeferas, onde as células cresceram tipicamente em aglomerados atingindo, dentro de 7 dias, o diâmetro ideal de 100-200 µm. A diferenciação celular das neuroesferas foi obtida após a aderência destas às placas tratadas com poli-D-lisina, evidenciada pela migração de fibras do interior da neuroesfera. Ao contrário das neuroesferas, os neurônios em cultivo extenderam seus neuritos após 11 dias de isolamento. Tal modelo in vitro pode ser utilizado com sucesso na identificação das variáveis neuroproteômicas, propiciando uma avaliação global das alterações dinâmicas e suas interações protéicas. Tal modelo pode ter aplicações em estudos dos efeitos de indutores da morte celular e bloqueadores de canais de membrana mitocondriais em proteínas chaves do metabolismo energético cerebral.

Número mais provável miniaturizado e microbiologia convencional para isolamento de Salmonella spp. em abatedouros de frangos de corte

Os produtos de origem avícola podem ser importantes veículos de transmissão de Salmonella spp. para humanos e, dentre os vários parâmetros que determinam a qualidade de um alimento, destacam-se os que definem suas características microbiológicas. Objetivou-se detectar e quantificar Salmonella spp. na tecnologia de abate de frangos de corte por microbiologia convencional (MC) e número mais provável miniaturizado (mNMP). As coletas foram realizadas em duas visitas a três abatedouros sob Inspeção Federal e em seis pontos de coleta em triplicata, definidos como: recepção das aves (swabs de cloaca e esponjas de gaiolas de transporte antes e após a higienização) e carcaças (após pré resfriamento em chiller, após o gotejamento e antes da embalagem primária e congeladas a -12oC por 24 horas), totalizando 108 amostras. Identificou-se Salmonella spp. em três dos seis pontos do fluxograma de abate e em dois dos três estabelecimentos amostrados, independentemente do método utilizado, perfazendo 5,5% de positividade, onde destaca-se a contaminação nas gaiolas de transporte das aves após a higienização. Não foi possível correlacionar os resultados da microbiologia convencional e do mNMP ou mesmo quantificar a contaminação ao longo da tecnologia de abate, o que indica a necessidade de se utilizar um método qualitativo aliado ao método de quantificação quando Salmonella estiver presente em quantidades inferiores ao limite de detecção do mNMP proposto (0,13 NMP/mL). Os sorovares identificados foram Typhimurium, Panama, Lexington e Rissen, consideradas paratíficos e, portanto, potencialmente capazes de causar infecções em humanos, embora estes sorovares não tenham sido isolados em produtos finais e sim na chegada dos frangos aos abatedouros (swabs de cloaca e gaiolas de transporte). A identificação de Salmonella spp. nas gaiolas de transporte após a higienização é um indicativo da necessidade de revisão e adequação dos métodos automatizados de lavagem atualmente utilizados nos abatedouros.

Isolamento microbiológico do canal auditivo de cães saudáveis e com otite externa na região metropolitana de Recife, Pernambuco

Resumo: Otite externa (OE) é o termo utilizado para definir a inflamação do conduto auditivo externo; esta doença possui diversas etiologias, ocorre em várias espécies e é particularmente frequente em cães. Os microrganismos da microbiota residente comumente estão envolvidos na etiopatogenia da OE, sendo apontados como agentes perpetuadores da doença. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil microbiológico de cães com conduto auditivo saudável e com otite na região metropolitana do Recife. Com o auxílio de suabes estéreis foram coletadas amostras das orelhas direita e esquerda de 41 cães, sendo 11 com OE e 30 sem OE. Foi realizado o isolamento bacteriano e fúngico das amostras cultivadas; observou-se positividade em 80% dos cães com orelhas saudáveis e presença de mais de um microrganismo em 38 amostras (63,3%); já nos cães com OE, a positividade foi 95,3%, com infecção polimicrobiana em 77,3% das amostras. No que se refere aos gêneros bacterianos, o perfil de isolamento microbiológico foi idêntico entre os cães otopatas e sadios. Os microrganismos isolados foram Staphylococcus sp., Micrococcus, Bacillus sp., Streptococcus sp. e Malassezia sp.

Comparação de dois métodos de colheita de medula óssea de equinos e de dois meios de diluição para o isolamento de células mononucleares

Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar a concentração e viabilidade da fração de células mononucleares (FCM) a partir de diferentes técnicas de colheita e processamento de medula óssea (MO) em equinos. Foram avaliados cinco equinos adultos, hígidos e sem raça definida. Obtiveram-se frações de medula óssea (MO) do osso esterno, de acordo com dois protocolos: na colheita A, utilizou-se 10mL de solução de heparina dentro da seringa e em seguida, aspirou-se a MO; na colheita B, 10mL de solução de heparina foi injetada na MO e a aspiração foi realizada após 20 segundos. Todos os animais foram submetidos aos dois protocolos de colheitas, realizadas em sequência, sem intervalo entre os dois procedimentos. Após isolamento da fração de células mononucleares (FCM), das amostras de MO obtidas nas colheitas A e B, cada amostra foi dividida em dois tubos, um contendo solução de DMEM e outro contendo PBS. Assim, alternando-se o tipo de colheita e a solução diluidora, obteve-se quatro tubos de amostras por animal. Os tubos foram centrifugados e os sedimentos foram homogeneizados nos respectivos meios obtendo-se o volume final de 100μL. Realizou-se determinação da concentração e viabilidade celular, obtendo-se as concentrações médias de FCM. Para ambos os meios de diluição, a colheita B apresentou valor numérico maior em comparação à colheita A, porém não foi significativo (p>0,05). Atribui-se tal tendência à menor ocorrência de coagulação da MO no momento da colheita B, sugerindo-se melhor aproveitamento da FCM. Não houve diferença (p>0,05) entre os meios DMEM ou PBS, indicando que os mesmos não alteraram a viabilidade celular. Os protocolos utilizados para colheita de MO e separação da FCM se mostraram eficientes, para o uso em terapia celular em equinos.

Isolamento de oligossacarídeos de xiloglucano de dicotiledôneas através de hidrólise enzimática e cromatografia de exclusão molecular

Oligossacarídeos derivados do xiloglucano, um polissacarídeo constituinte da parede celular vegetal, vêm sendo considerados como moléculas capazes de sinalizar e/ou regular eventos relacionados ao crescimento e à expansão celular. A purificação desses oligossacarídeos é imprescindível para a realização de ensaios relativos à sua atividade biológica. Neste trabalho, xiloglucanos foram extraídos a partir de sementes de copaíba (Copaifera langsdorffii Desf.) e suspensões celulares de feijão (Phaseolus vulgaris L.) e hidrolisados com celulase (endo-glucanase) para obtenção dos oligossacarídeos de xiloglucano, os OXGs. Os resultados obtidos mostram que a técnica de cromatografia dupla em gel de exclusão molecular foi eficiente para purificação dos oligossacarídeos, apresentando OXGs dos tipos XLLG e XXXG com grau de pureza próximo a 90%, e do tipo XXFG próximo de 80%.

Isolamento e seleção de fungos filamentosos do solo de sistemas agroflorestais do Município de Bom Jardim (PE) com base na capacidade de produção de enzimas hidrolíticas

O presente trabalho teve por objetivo isolar e identificar fungos de solo de sistemas agroflorestais e avaliar a atividade enzimática destes fungos. Estes foram isolados pela técnica de diluição sucessiva e avaliados quanto à capacidade de degradar amido, celulose e caseína. Foram identificadas 11 espécies de fungos anamorfos (Hyphomycetes) distribuídos em cinco gêneros: Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Fusarium e Penicillium. As espécies estudadas não apresentaram atividade amilolítica satisfatória. Cladosporium cladosporioides (Fres.) De Vries e Penicillium chrysogenum Thom apresentaram maior índice de relação enzimática (IRE) para protease e celulase. Entre as espécies estudadas seis apresentaram maior Índice de Relação Enzimática (IRE) para celulase em comparação as demais enzimas.

Isolamento de esporos de equipamentos de abatedouros avícolas e avaliação de sua resistência a sanificantes químicos

Com o objetivo de fornecer subsídios para o controle de microrganismos em abatedouro de aves, avaliou-se a ação dos agentes químicos sanificantes comprovadamente mais eficientes (hipoclorito de sódio, ácido peracético, e dicloroisocianurato de sódio) em suspensões de esporos de bactérias aeróbias mesófilas e termófilas, isoladas de equipamentos de abatedouro de aves. Pelo teste de Duncan, constatou-se que dentre os esporos isolados o mais resistente obteve 1,5 e 1,2 RD quando em contato com o hipoclorito de sódio e ao ácido peracético com 30 minutos de tempo de contato, que foram os sanificantes mais eficientes (P > 0,05). O dicloroisocianurato de sódio proporcionou 0,1 RD em 30 minutos de tempo de contato com a mesma suspensão de esporos. Os esporos isolados apresentaram diferentes resistências aos sanificantes avaliados, indicando a necessidade de uma seleção criteriosa de agentes químicos para o procedimento de sanificação, sendo importante um rodízio entre os sanificantes mais eficientes testados, que foram o hipoclorito de sódio e o ácido peracético.

Avaliação da eficiência de três ágares seletivos no isolamento de Listeria monocytogenes

A variedade de protocolos existentes para a pesquisa de Listeria sp em alimentos e outras amostras é muito grande, o que dificulta a escolha daquele que possa apresentar melhores resultados. Os protocolos recomendados nas metodologias tradicionais indicam vários caldos de pré-enriquecimento e enriquecimento seletivo, assim como meios de isolamento seletivo. O presente estudo teve por finalidade comparar a eficiência dos ágares cloreto de lítio-feniletanol-moxalactam (LPM), PALCAM (PAL) e do ágar hemolítico ceftazidima-cloreto de lítio (HCLA) no isolamento de L. monocytogenes a partir de diferentes tipos de amostras colhidas em uma linha de processamento de "nuggets" congelados de frango. Um total de 413 amostras foi examinado. As amostras foram primeiramente enriquecidas em caldo Half Fraser, seguido do enriquecimento em caldo BLEB. Alíquotas deste enriquecimento foram semeadas por esgotamento em placas contendo os meios LPM, PAL e HCLA. Colônias típicas foram selecionadas e submetidas à identificação bioquímica. O meio HCLA permitiu o isolamento de L. monocytogenes em 60,1% do total de amostras examinadas, enquanto PAL e LPM permitiram o isolamento em aproximadamente 47,9% das amostras. O desempenho do HCLA foi estatisticamente diferente dos demais meios (p< 0,05%) para todos os tipos de amostras, exceto para as de manipuladores onde os 3 meios apresentaram desempenho semelhante. Os resultados obtidos com o HCLA foram superiores aos dos demais meios e seu uso, simultaneamente com o PAL, mostrou-se de grande utilidade.

Isolamento, fracionamento e caracterização de paredes celulares de raízes de mandioca (Manihot esculenta, Crantz)

Durante a cocção de mandiocas o amido é gelatinizado e as paredes celulares sofrem alterações físicas e químicas que modificam a coesão das células e causam o amaciamento dos tecidos. Isolar, fracionar e caracterizar paredes celulares durante o envelhecimento de raízes, de duas cultivares, foram os objetivos deste trabalho. O amido foi eliminado por tamização e hidrólise enzimática e o material de paredes celulares foi fracionado em celulose, hemicelulose e pectina. Quantitativamente celulose foi a maior fração constituindo entre 57,2 e 70% do material inicial de paredes celulares isoladas, seguido por pectina e hemicelulose. O material isolado como paredes celulares diminuiu com o tempo de plantio das raízes e a concentração de celulose foi menor no material isolado de raízes mais velhas. A fração pectina diferiu em concentração de açúcares entre raízes de idades diferentes, sendo mais alta em raízes mais velhas enquanto a concentração de ácidos urônicos diferiu entre idades e cultivares.

Efeitos do grupo genético, sexo e peso ao abate sobre as propriedades físico-químicas da carne de cordeiros em crescimento

O objetivo desse trabalho foi avaliar a evolução do pH post mortem, cor, perda de peso por cozimento e força de cisalhamento dos músculos Longissimus dorsi (LD) e Semimembranosus (SM) de 49 cordeiros provenientes de cruzamentos entre as raças Bergamácia com Santa Inês (BgxSI) e Ile de France com Santa Inês (IFxSI), machos inteiros e fêmeas, distribuídos nos grupos pesos ao abate de 15, 25, 35 e 45kg. Os grupos genéticos apresentaram diferenças (P<0,05) sobre o pH dos músculos LD e SM, sendo que BgxSI apresentou média de pH mais elevada, do que IFxSI. O fator sexo não afetou a cor, entretanto o grupo genético influenciou (P<0,001) o valor L* e o valor a*; o valor L* de 35,25 e 32,89, para IFxSI e BgxSI, respectivamente; e o valor a* de 16,09 e 14,64, para BgxSI e IFxSI, respectivamente. A perda de peso por cozimento não foi influenciada pelos fatores grupos genéticos, sexos e grupos de peso. A maciez no músculo SM não foi afetada pelos fatores estudados. Entretanto no LD, os grupos de peso afetaram a maciez (P<0,05). Os grupos de 15 e 25kg apresentaram força de cisalhamento mais elevada (13,57 e 10,98kgf, respectivamente), do que os cordeiros de 35 e 45kg (8,56 e 7,97kgf, respectivamente).

Isolamento e seleção de microrganismos pectinolíticos a partir de resíduos provenientes de agroindústrias para produção de aromas frutais

As pectinases são enzimas produzidas naturalmente por plantas, fungos, leveduras e bactérias. Estes microrganismos podem ser inoculados em meios contendo resíduos agroindustriais utilizados como fonte de carbono para a produção de compostos de maior valor agregado, como enzimas, etanol, proteínas, aminoácidos e compostos de aroma. Vários microrganismos foram isolados e selecionados quanto à produção de enzimas pectinolíticas pelo método da placa, através de zonas claras de degradação de pectina ao redor da colônia. De 104 linhagens testadas, 18 foram selecionadas para fermentarem em meio líquido, contendo pectina para a determinação de atividade de poligalacturonase (PG) e de pectina liase (PMGL), e em meio frutose/extrato de levedura para produção de aromas. As linhagens 2, 9, 20, 39, 70, 74 e 99 apresentaram unidades de atividade de PG superiores a 80 µmol de ácido galacturônico/mL/min, as linhagens 17, 18, 31, 37, 73, 74 e 125 apresentaram unidades de atividade de PMGL superiores a 1000 etamol de produtos insaturados/mL/min e as linhagens 13, 70, 73, 74, 125 e 144 apresentaram os melhores descritores e as maiores intensidades de aromas percebidos por um painel não treinado de provadores.

Qualidade microbiológica de leite cru refrigerado e isolamento de bactérias psicrotróficas proteolíticas

A estocagem do leite cru refrigerado na fonte de produção reduz perdas econômicas por atividade acidificante de bactérias mesofílicas, mas permite a seleção de bactérias psicrotróficas relacionadas a problemas tecnológicos e econômicos na indústria de laticínios. Com o objetivo de avaliar a qualidade microbiológica de leite cru, foram analisadas amostras provenientes de tanques de refrigeração individual, coletivos e do silo de uma indústria processadora de leite. Além disso, bactérias psicrotróficas proteolíticas foram isoladas do leite cru refrigerado e caracterizadas quanto à reação ao Gram e fermentação de glicose. O leite cru refrigerado mantido no silo industrial não atendeu ao padrão microbiológico legal e apresentou contagens microbianas significativamente superiores às do leite mantido em tanques individuais ou coletivos. Diferença significativa na contaminação por mesófilos e psicrotrófilos proteolíticos e não proteolíticos e por Pseudomonas foi observada entre as amostras coletadas nos tanques de refrigeração e no silo industrial. A microbiota Gram-negativa foi isolada com maior freqüência, especialmente bactérias Gram-negativas não fermentadoras de glicose.

Isolamento da globulina majoritária, digestibilidade in vivo e in vitro das proteínas do tremoço-doce (Lupinus albus L.), var. Multolupa

Os objetivos do trabalho foram isolar, purificar e estudar algumas propriedades da fração globulina majoritária de tremoço-doce, var. Multolupa; assim como avaliar as características de digestibilidade da farinha e frações isoladas. As frações protéicas foram separadas por fracionamento diferencial com uso de diferentes solventes. A globulina majoritária de tremoço-doce foi isolada, purificada por cromatografia em Q-Sepharose, revelando um único pico de proteína. Apresentou um peso molecular de 162,5 ± 10,0 kDa, determinado por cromatografia em Sephacryl S-300, e subunidades entre 20-70 kDa em PAGE-SDS. A solubilidade em função do pH e concentrações de NaCl revelaram curva típica dessa fração. A digestibilidade da proteína da farinha e das frações albumina, globulina e glutelina foi avaliada por experimentos in vitro e in vivo e se revelou alta para a fração globulina, seguida pela glutelina, albumina e farinha. A digestibilidade in vivo da fração globulina, tanto aparente quanto verdadeira, não diferiu significativamente daquela determinada para a caseína. Apesar da alta digestibilidade da fração majoritária e frações protéicas, a utilização como única fonte de proteína nas dietas revelou valores baixos de RPLR (razão protéica líquida relativa), indicando ser insuficiente para sustentar o crescimento dos animais, comparativamente à caseína.