Marcadores RAPD na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum

Os fungos Acremonium strictum e Fusarium verticillioides normalmente apresentam algumas similaridades morfológicas, o que dificulta sua diferenciação em sementes de milho (Zea mays), particularmente quando ocorrem simultaneamente. Técnicas moleculares de análise do DNA têm possibilitado o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis eespecíficos no diagnóstico de fitopatógenos, em complemento à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de dez isolados de A. strictum obtidos de sementes de milho, provenientes de diferentes regiões produtoras brasileiras, por meio da análise do DNA genômico (RAPD). Objetivou-se ainda, diferenciar os isolados de A. strictum de F. verticillioides por meio da técnica citada. Pela análise do DNA, 25 primers Operon geraram polimorfismos, os quais tornaram possível e seguro o agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de F. verticillioides. Os isolados de A. strictum apresentaram variabilidade intraespecífica entre 3,4% e 44,4%. Para a maioria dos casos não foi possível correlacionar a similaridade genotípica e a origem geográfica dos isolados de A. strictum.

Desenvolvimento de marcadores moleculares para análogos a genes de resistência em Arachis spp. silvestres

O maior grupo de genes de resistência de plantas já clonados codifica para proteínas com um sítio de ligação a nucleotídios (NBS) na região N-terminal, e um domínio rico em repetições de leucina (LRR) na região C-terminal. Genes desta classe conferem resistência a diversos patógenos incluindo vírus, bactérias, fungos e nematóides. Para diferentes espécies do gênero Arachis, primers de "polymerase chain reaction" (PCR) degenerados foram construídos para a região NBS, e o produto de tradução putativo indicou similaridade com proteínas de resistência conhecidas sendo denominados análogos a genes de resistência (RGAs). Doze destes RGAs foram utilizados para o desenvolvimento de marcadores moleculares baseados em seus padrões de hibridização com DNA de Arachis spp. digerido com enzimas de restrição. Inicialmente, avaliou-se o polimorfismo de cada RGA como sonda nos parentais de uma população de mapeamento, contrastantes quanto à resistência as manchas foliares e nematóides das galhas, e no híbrido F1. Os RGAs, mesmo isolados de espécies diferentes do gênero Arachis apresentaram homologia com o DNA das espécies testadas, além de apresentarem múltiplas cópias e alto polimorfismo na progênie F2. Todas estas características tornam estes RGAs marcadores moleculares altamente informativos, sendo que alguns apresentaram segregação em "clusters" na F2, indicando que seus locos estão ligados. Estes marcadores serão incluídos em um mapa genético de Arachis spp., o que será de grande utilidade para os programas de melhoramento do amendoim (Arachis hypogaea) cultivado.

Caracterização da agressividade de isolados de Colletotrichum de maracujá amarelo com marcadores bioquímico, fisiológico e molecular

A antracnose é a doença pós-colheita mais importante do maracujá amarelo, cujo agente etiológico, no Brasil, foi identificado como Colletotrichum gloeosporioides. Visando caracterizar o patógeno, foram obtidos 33 isolados de três regiões produtoras do estado de Pernambuco. Critérios morfológicos como cor de colônia, forma e dimensão de conídios, a produção de peritécio e o uso de primers específicos para C. acutatum, C. gloeosporioides e "Colletotrichum de Passiflora" permitiram identificar Glomerella cingulata patótipo 1, G. cingulata patótipo 2, Colletotrichum sp. de Passiflora e Colletotrichum sp. de maracujá amarelo. Inoculações em maracujá amarelo possibilitaram separar os isolados em dois grupos, um de agressividade alta (GA-1) e outro de agressividade baixa (GA-2). Os marcadores bioquímicos como atividade enzimática amilolítica, celulolítica, lipolítica e proteolítica assim como o marcador fisiológico crescimento micelial não separaram os isolados pela agressividade. O padrão de marcas geradas pela amplificação dos DNAs dos isolados usando primers RAPD evidenciou que os isolados do GA-1 variaram menos geneticamente entre si do que os isolados do GA-2, demonstrando que os do GA-1 evoluíram mais recentemente. A amplificação do DNA dos isolados com o primer OPA-9 gerou um marcador que possibilitou caracterizar 85,7% dos isolados do GA-1 e também alguns isolados do GA-2 com agressividade próxima às dos isolados do GA-1, e por isto o primer OPA-9 pode ser usado para caracterizar isolados de Colletotrichum spp. de alta agressividade em programa de resistência genética.

Utilização de análise de segregantes agrupados na identificação de marcadores ligados a genes que controlam a resistência à ferrugem (Puccinia psidii Winter) em Eucalyptus sp.

Devido a grande importância da cultura de Eucalyptus no Brasil, empresas do setor florestal têm buscado através de programas de melhoramento genético, reduzir as perdas de produção e atender a demanda do mercado de papel e celulose. Um exemplo, é a busca por genes de resistência a doenças, principalmente a ferrugem causada por Puccinia psidii Winter, que resulta em redução da produtividade em plantas altamente suscetíveis. No presente trabalho, mudas de Eucalyptus pertencentes a uma geração F1, provenientes do cruzamento controlado entre parentais híbridos E. grandis X E. urophylla, sendo eles resistente e suscetível, foram inoculadas com Puccinia psidii em casa de vegetação e acompanhadas até o aparecimento dos sintomas da ferrugem. Foram classificadas, em dois grupos: resistentes (ausência de sintomas) e suscetíveis (presença de sintomas e esporulação). As amostras de DNA foram comparadas com o uso de marcadores moleculares associado ao método de BSA (Bulked Segregant Analysis). O polimorfismo entre os grupos foi geneticamente relacionado ao loco que determina a característica de resistência ou sucetibilidade. Dentre os 720 "primers" testados, 19 foram polimórficos, porém, apenas o marcador AK 01 manteve-se presente, quando testado em todos os indivíduos da população, mostrando-se a uma distância genética estimada de 20 cM em repulsão ao gene de resistência.

Estudo da diversidade genética de Podosphaera xanthii através de marcadores AFLP e seqüências ITS

O meloeiro (Cucumis melo L.) é uma frutífera largamente cultivada no Brasil, principalmente no nordeste brasileiro, onde é produzida principalmente para a exportação. Plantas da família do meloeiro, como pepino e abóbora, podem ser severamente afetadas pelo oídio, causado por Podosphaera xanthii.. Este fungo apresenta diversas raças fisiológicas cuja correta identificação é importante para o manejo da doença, já que o uso de variedades resistentes é o método mais eficaz de seu controle. No entanto, a identificação destas raças por meio da prática tradicional de inoculações em uma série diferenciadora de variedades de meloeiro é laboriosa e passível de erros. Devido a isso, um método alternativo seria o uso de marcadores moleculares para determinar de forma rápida a identidade das raças. O objetivo deste estudo foi o de analisar a variabilidade entre isolados de P. xanthii previamente classificados em raças através da técnica de AFLP e do seqüenciamento da região ITS 5.8S do rDNA. A partir dos marcadores AFLP obteve-se um dendrograma no qual não houve separação dos isolados quanto às suas raças, origem geográfica ou hospedeiro de origem. Com esta técnica verificou-se alta variabilidade entre isolados, com similaridade genética máxima de 69% e similaridade mínima de 23%. Ao contrário da informação gerada por AFLP, não foi observada variação na sequência da região ITS 5.8S entre isolados. Desta forma, a análise por AFLP indicou que os isolados tem composição genética heterogênea muito embora este fato não tenha sido evidenciado pelo sequenciamento da região ITS.

Caracterização de isolados de Diplodia pinea da região Sul do Brasil por meio da compatibilidade micelial e de marcadores RAPD

RESUMO O objetivo do trabalho foi caracterizar quatro isolados de Diplodiapinea da região Sul do Brasil e estimar sua variabilidade genética, baseados na compatibilidade vegetativa e marcadores RAPD. Na compatibilidade vegetativa, os isolados foram pareados em placas de Petri com meio BDA e formaram linhas escuras quando incompatíveis e linhas claras cotonosas quando incompatíveis. Para a caracterização molecular dos isolados, a extração de DNA foi realizada em amostras obtidas de micélio cultivado em meio BDA dos isolados originais e os monospóricos derivados. O DNA das amostras foi avaliado em reação de polimerase em cadeia (PCR), utilizando onze sequências diferentes de primers RAPD inespecíficos. O agrupamento dos morfotipos foi realizado pelo método UPGMA e coeficiente de similaridade de Jaccard. Somente um marcador RAPD mostrou polimorfismo, indicando que os isolados apresentam pequena divergência genética, porém suficiente para indicar mais de morfotipo presente.

Variações genéticas em populações de Eucalyptus spp. detectadas por meio de marcadores moleculares

A tecnologia de marcadores moleculares, aliada às técnicas clássicas do melhoramento, pode contribuir significativamente para o conhecimento básico da cultura e do caráter estudado e para a geração e o desenvolvimento de produtos melhorados. O objetivo deste trabalho foi utilizar marcadores RAPD para detectar e maximizar a variabilidade genética em genótipos Eucalyptus, identificando cruzamentos favoráveis para um programa de melhoramento florestal, visando o uso múltiplo. Foram analisados 44 genótipos de híbridos naturais do gênero Eucalyptus, plantados na região noroeste de Minas Gerais. Os marcadores moleculares RAPD apresentaram poder de discriminação eficiente entre os 44 genótipos avaliados, constatando-se uma distância genética média entre os genótipos de Eucalyptus de 54% e divergência genética variando de 24 a 73%. Este fato indica que entre os indivíduos analisados existe uma ampla base genética, o que possibilita a manipulação desse material em programas de melhoramento. A distância genética entre os genótipos 5 e 9; 9 e 10; 9 e 19; 9 e 25; 9 e 33; 9 e 35; 9 e 36; 9 e 44; 10 e 33; 12 e 19; 12 e 33; e 12 e 39 apresentou-se maior ou igual a 70%. A análise de agrupamento estabelecida, utilizando UPGMA e o critério de corte de 80% da distância genética total, permitiu a formação de nove grupos distintos. Esses grupos apresentaram divergência genética média superior a 60%. A maior média de distância ocorreu entre o grupo I e os demais, com 67%. A avaliação por marcadores moleculares RAPD forneceu uma identificação direta da variação genética dos genótipos e, neste sentido, novos cruzamentos para produção de híbridos específicos poderão ser gerados, aumentando, assim, a divergência genética e a produtividade de derivados de madeira de qualidade superior para usos múltiplos em programas de melhoramento florestal.

Estimativa de tamanho efetivo de endogamia por marcadores genéticos

Atividades de conservação e melhoramento genético requerem medidas de tamanho efetivo para manutenção e controle do potencial evolutivo das populações sob manipulação. Populações naturais são, muitas vezes, estruturadas e, conseqüentemente, podem apresentar algum grau de endogamia e parentesco. O objetivo deste trabalho foi descrever um simples estimador de tamanho efetivo de endogamia para populações de espécies monóicas com qualquer nível de endogamia e parentesco. O estimador foi derivado, assumindo-se que a endogamia é a mesma em todos os indivíduos da população. Ele pode ser utilizado em populações com pedigree conhecido ou o parentesco médio entre pares de indivíduos da população-alvo pode ser estimado a partir de dados de marcadores genéticos co-dominantes. Um exemplo é dado onde o estimador é aplicado em uma população de uma espécie arbórea monóica, Euterpe edulis.

Diversidade genética de Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong. no Baixo Rio São Francisco, por meio de marcadores RAPD

Enterolobium contortisiliquum Vell. Morong (Leguminosae-Mimosoideae) é uma espécie muito utilizada em programas de recuperação de matas ciliares no Baixo Rio São Francisco, devido ao seu rápido crescimento inicial. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de marcadores moleculares RAPD, a diversidade genética de oito indivíduos de uma população remanescente dessa espécie, visando contribuir para a definição de estratégias de coleta de sementes. Os indivíduos estão situados em uma área de 100 ha de mata ciliar do Baixo Rio São Francisco. Para a extração do DNA, pelo método CTAB 2%, foram utilizadas folhas tenras dos indivíduos. Testaram-se 20 oligonucleotídios de 10 bases de seqüência arbitrária, cujos produtos foram separados em gel de agarose 0,8%, submetidos à eletroforese horizontal, corados com brometo-de-etídio e visualizados em luz ultravioleta. A similaridade genética entre os indivíduos foi calculada pelo Coeficiente de Similaridade de Jaccard e a construção do dendrograma, realizada utilizando-se o método UPGMA. O valor médio de diversidade genética entre as matrizes foi de 49%, variando de 33 a 85%. Os indivíduos 6 e 7 apresentaram relativa proximidade genética (67%), não sendo indicado o plantio de suas mudas ou semeadura direta para recuperação de área ciliar em locais muito próximos. A partir dos resultados observados, podem-se desenvolver estratégias para a coleta de sementes e produção de mudas, auxiliando, assim, programas de restauração ambiental.

Diversidade genética entre indivíduos de Spondias lutea L. procedentes do baixo são francisco sergipano, por meio de marcadores rapd

A recuperação de matas ciliares com mudas que apresentam o máximo de diversidade genética possível é de suma importância para a conservação das espécies. Assim, este estudo foi realizado com o objetivo de caracterizar geneticamente, por meio de marcadores RAPD, indivíduos de Spondias lutea L. (cajá), com a finalidade de elaborar estratégias de produção de sementes para a recuperação de mata ciliar. O estudo foi realizado em uma área de mata ciliar no Baixo São Francisco sergipano, onde foi coletado material foliar de 17 indivíduos para a análise de RAPD. A extração de DNA foi realizada por meio de tampão CTAB 2%, e para a geração de polimorfismo foram empregados 17 oligonucleotídios. A matriz binária construída com presença (1) e ausência de bandas (0) foi usada para o cálculo da estimativa de similaridade genética e, a partir desta, foi feita a representação simplificada das similaridades, pelo método de agrupamento UPGMA, e a estabilidade dos agrupamentos foi testada pela análise "bootstrap". Para visualização da divergência entre os indivíduos, realizou-se o agrupamento dos indivíduos pelo método de Tocher. A matriz de distância genética foi comparada com a matriz de distância geográfica pelo teste de Mantel, com a finalidade de verificar se há correlação entre as mesmas. A similaridade genética média entre os indivíduos foi de 46,8%, e a amplitude das similaridades variou de 21 a 78%. Não houve associação entre as distâncias genéticas e geográficas (r = 0,08). Com o método de agrupamento de Tocher, houve a formação de cinco grupos e o valor mínimo de similaridade calculado, acima do qual os indivíduos são considerados geneticamente iguais, foi igual a 91%. Assim, os indivíduos analisados são considerados divergentes e podem ser utilizados como matrizes porta-sementes em programas de produção de sementes para a recuperação de mata ciliar.

Variabilidade genética em populações naturais de Ziziphus joazeiro Mart., por meio de marcadores moleculares RAPD

Os estudos de diversidade genética em populações naturais são imprescindíveis para a elaboração de estratégias de conservação. Assim, este trabalho foi realizado com o objetivo de caracterizar geneticamente, por meio de marcadores Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), populações naturais de Ziziphus joazeiro Mart., localizadas na região do Baixo São Francisco sergipano. Foram empregados 20 oligonucleotídeos e, a partir do polimorfismo observado, foram estimadas a porcentagem de polimorfismo, a variabilidade genética e a similaridade genética (Sgij), por meio do coeficiente de Jaccard. O teste de Mantel foi realizado para avaliar a correlação entre a similaridade genética e a distância geográfica; sendo o fluxo gênico também estimado. O polimorfismo observado nas populações de Z. joazeiro variou de 58,1 a 66,5% e a similaridade genética, de 44 a 54%. A similaridade genética não está correlacionada com a distância geográfica, e os valores observados para o índice de diversidade genética de Nei, para o índice de Shannon e para os parâmetros HS, HT e GST foram considerados altos e semelhantes aos encontrados em outras espécies arbóreas. A porcentagem de locos polimórficos foi considerada baixa. Maior identidade genética foi encontrada entre as populações de Canindé do São Francisco e Santana do São Francisco; e a maior distância genética entre as populações de Canhoba e Canindé do São Francisco. O fluxo gênico foi maior que 1. Com base nos resultados, pode-se afirmar que há alta variabilidade genética entre as populações e que estas podem estar geneticamente estruturadas.

Expressão imuno-histoquímica dos marcadores pcna, KI67 e p53 em carcinomas epidermóides do trato aerodigestivo superior

OBJETIVO: Os carcinomas epidermóides do trato aerodigestivo superior são tumores de comportamento biológico heterogêneo. O objetivo deste trabalho é verificar se a expressão imuno-histoquímica dos marcadores Ki67, PCNA e P53 apresenta correlações com parâmetros prognósticos clínico-patológicos. MÉTODOS: Determinação da expressão imuno-histoquímica dos antígenos Ki67, PCNA e P53 em espécimes tumorais fixados e embebidos em parafina de 53 pacientes com carcinoma epidermóide em diferentes sítios primários do trato aerodigestivo superior. RESULTADOS: Os marcadores tiveram altos índices de expressão imuno-histoquímica, sendo 46,5% para o Ki67, 66,5% para o PCNA e 36,5% para o P53. Não houve correlação da expressão do Ki67 e do PCNA com o estadiamento TNM (AJCC), nem com o grau de malignidade. A expressão do Ki67 apresentou correlação positiva com a expressão do PCNA (p = 0,037). O mesmo aconteceu para o PCNA e o número de mitoses por campo (p = 0,001). CONCLUSÕES: De acordo com estes resultados, concluiu-se que a determinação da imunorreatividade dos marcadores Ki67 e PCNA é um método objetivo e quantificável para avaliar proliferação celular que pode subsidiar as informações prognósticas.

Marcadores tumorais no câncer colorretal

Colorectal cancer is a clinical entity of a persistent relevance in clinical practice and its early diagnosis is a determinant factor to obtain better therapeutic results. Tumor markers are helpful means for a better approach to individuals with such neoplasm. In the present review, the authors analyze the phases in which surgical-clinical treatment markers must be used: diagnosis, determination of tumor stage, establishment of prognosis and detection of recurrence. Current and future markers and the consensus on their use are discussed. Causal factors for errors in diagnosis with markers and perspectives of use are also presented.

Avaliação do tempo de trânsito colônico com marcadores radiopacos: estudo com voluntários assintomáticos

OBJETIVO: Com a introdução de marcadores radiopacos para avaliação do tempo de trânsito intestinal, tornou-se possível mensurar não apenas o tempo de trânsito total, como também o segmentar. Visando a simplificação da técnica, especialmente no que diz respeito à diminuição da exposição à irradiação, foi descrito novo método com número menor de radiografias. Os autores apresentam estudo do tempo de transito colônico total e segmentar em indivíduos normais. MÉTODO: Quinze voluntários adultos e assintomáticos, oito do sexo feminino e sete do masculino, foram submetidos a exame radiológico com marcadores radiopacos para medida do tempo de trânsito colônico total e segmentar (cólon direito, esquerdo e retossigmóide). RESULTADOS: A média do tempo de trânsito colônico total foi de 36,61 ± 3,48 horas. Dos tempos de trânsito segmentares obtivemos as médias de 11,51 ± 2,28 horas para o cólon direito; de 12,14 ± 2,19 horas para o cólon esquerdo; e de 12,96 ± 2,23 horas para o retossigmóide. CONCLUSÕES: A técnica descrita é método simples e útil para a avaliação do tempo de trânsito colônico total e segmentar e quando aplicada a indivíduos assintomáticos reproduziu resultados comparáveis aos da literatura e aos obtidos a partir de outras técnicas.

Expressão dos marcadores tumorais CD-34 e CASPASE-3 no carcinoma epidermóide de esôfago

OBJETIVO: Analisar citofotometricamente a expressão do marcador de densidade microvascular CD-34 e de apoptose caspase-3 no carcinoma epidermóide de esôfago, e correlacionar os marcadores entre si. MÉTODOS: Análise imunoistoquímica de 29 peças cirúrgicas de carcinomas epidermóides de esôfago, baseada nos índices de marcagem dos anticorpos CD-34 e caspase-3, utilizando-se sistema de citofotometria computadorizada. Comparou-se a expressão quantitativa destes marcadores, a relação entre eles, a relação com a idade dos pacientes, tamanho das lesões e classificação TNM. RESULTADOS: O valor da mediana do índice de marcagem do CD-34 foi de 72,6% e o da caspase-3 de 96,5%. Não se obteve significância estatística na correlação destes marcadores com o tamanho tumoral ou com a idade dos pacientes. Houve discreta tendência à correlação positiva entre o CD-34 e a classificação TNM. O marcador caspase-3, apesar de apresentar maior índice de marcagem que o CD-34 nestes tumores, não revelou nenhuma correlação com as variáveis estudadas. A correlação entre o CD-34 e a caspase-3 apresentou tênue tendência positiva. CONCLUSÃO: Ambos os marcadores têm boa expressão no carcinoma epidermóide de esôfago, onde o CD-34 tem menor expressividade que a caspase-3 e os mesmos não apresentam correlação entre si.