Isolamento e caracterização do vírus da influenza pandêmico H1N1 em suínos no Brasil

A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais do líquido amniótico equino obtido em diferentes idades gestacionais

O interesse nas pesquisas com células-tronco derivadas de anexos fetais de diversas espécies cresceu exponencialmente nas últimas décadas em virtude de serem fontes de células-tronco adultas com potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares que apresentam pouca ou nenhuma imunogenicidade, apresentando-se assim como alternativa de grande importância para a formação de bancos celulares. Apesar do crescente interesse, os estudos para espécie equina ainda são escassos. O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico equino obtidas do terço inicial, médio e final da gestação (LA-CTMs), comparando suas características. Foram colhidas 23 amostras de líquido amniótico as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e às diferenciações osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro. Todas as amostras demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico as células de todos os grupos foram imunomarcadas para CD44, PCNA e vimentina com ausência de marcação para citoqueratina e Oct-4. Na citometria de fluxo observou-se a expressão de CD44 e CD90 e ausência de expressão de CD34, sendo que os marcadores CD44 e CD90 mostraram padrão de expressão decrescente em relação ao desenvolvimento gestacional. As amostras obtidas de todas as fases da gestação foram capazes de diferenciação nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. Portanto, as células obtidas do líquido amniótico apresentaram características morfológicas, imunofenotípicas e potencial de diferenciação típicos das CTMs, demonstrando que a colheita pode ser realizada em qualquer fase gestacional. No entanto, mais pesquisas devem ser realizadas principalmente quanto à expressão de marcadores de pluripotencialidade (como o Oct-4) e ao seu potencial de diferenciação em linhagens extra mesodermais já relatados na literatura.

Desempenho reprodutivo entre receptoras bovinas não contaminadas e naturalmente infectadas por Neospora caninum, após a transferência de embriões

O uso do conhecimento de biotécnicas para a melhoria da produção de bens e serviços tem avançado significativamente. O controle de doenças infecciosas continua a representar o maior obstáculo para a saúde dos animais. A perda embrionária pode ser responsável pelo aumento de prejuízos econômicos isolados para os produtores de bovinos. A infecção por Neospora caninum tem emergido como uma importante doença reprodutiva e, em vários países, tem sido diagnosticada como principal causa de aborto. O objetivo desse trabalho foi comparar o desempenho reprodutivo em receptoras bovinas não contaminadas e naturalmente infectadas por Neospora caninum após a transferência de embriões (TE). A escolha dos animais (n=395) para o experimento foi realizada através de avaliação ginecológica, via palpação transretal. As vacinações seguiram protocolo sanitário recomendado para a TE. O manejo nutricional foi baseado no National Research Council (NRC, 1999). A TE de embriões descongelados foi feita após a sincronização do ciclo estral das receptoras. Para a avaliação do desempenho reprodutivo se utilizou de ultrassonografia transretal. A identificação das receptoras positivas para Neospora caninum realizou-se através do teste de ELISA e, para as amostras reagentes, confirmação através de imunofluorescência indireta (IFI). Os dados foram analisados utilizando Past® e foram considerados estatisticamente significantes (P<0,01). Os resultados mostram uma taxa de prenhes (n=191) de 48,35%, seguida de uma taxa de abortos aos 60 dias de gestação (n=14) de 3,5% e abortos ao sexto mês de gestação (n=12) de 3,04%. Esses resultados tornam-se relevantes quando se leva em consideração que, receptoras infectadas pelo protozoário não apresentaram uma taxa elevada de perdas gestacionais. A insignificância estatística dos dados obtidos nesse estudo confere a segurança em sugerir que não há necessidade em implantar o diagnóstico ou controle prévios para Neosporose em rebanhos aptos a TE.

Detecção de Toxoplasma gondii em órgãos do sistema reprodutivo de carneiros naturalmente infectados no Brasil

Objetivou-se com esse estudo detectar o DNA genômico de T. gondii em amostras de testículo e epidídimo de ovinos comercializados em abatedouros do Estado de Pernambuco Região Nordeste do Brasil. Foram coletadas 50 amostras de soro sanguíneo, 50 amostras de testículos e 50 de epidídimos. Para a triagem dos animais foi utilizada a técnica de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e posteriormente empregou-se a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) nos animais positivos na sorologia. Observou-se 24% (12/50) dos animais positivos na RIFI e o DNA genômico foi detectado no epidídimo em 8,3% (1/12) das amostras. A identidade molecular dos produtos amplificados foi confirmada por sequenciamento. Relata-se a primeira ocorrência da presença do DNA de T. gondii em órgãos do sistema reprodutivo de carneiros naturalmente infectados no Brasil.

Isolamento e cultivo de neurônios e neuroesferas de córtex cerebral aviar

Métodos de cultivo celular são convenientes na realização de análises funcionais de alterações/interações protéicas das células neuronais, auxiliando a decifrar o interactoma de proteínas chaves na neurogênese de doenças do Sistema Nervoso Central. Por esse motivo, culturas de neurônios e neuroesferas isolados do córtex cerebral aviar representam um modelo acessível para o estudo de diversas doenças neurológicas, tal como a epilepsia. A espécie aviar apresenta peculiaridades em seu proteoma neuronal, visto a presença de uma expressão diferenciada de proteínas chaves no metabolismo energético cerebral, algumas destas (VDAC1 e VDAC2) desempenham papel importante na compreensão do mecanismo da epilepsia refratária. A metodologia estabelecida no presente estudo obteve cultivo de neuroeferas, onde as células cresceram tipicamente em aglomerados atingindo, dentro de 7 dias, o diâmetro ideal de 100-200 µm. A diferenciação celular das neuroesferas foi obtida após a aderência destas às placas tratadas com poli-D-lisina, evidenciada pela migração de fibras do interior da neuroesfera. Ao contrário das neuroesferas, os neurônios em cultivo extenderam seus neuritos após 11 dias de isolamento. Tal modelo in vitro pode ser utilizado com sucesso na identificação das variáveis neuroproteômicas, propiciando uma avaliação global das alterações dinâmicas e suas interações protéicas. Tal modelo pode ter aplicações em estudos dos efeitos de indutores da morte celular e bloqueadores de canais de membrana mitocondriais em proteínas chaves do metabolismo energético cerebral.

Número mais provável miniaturizado e microbiologia convencional para isolamento de Salmonella spp. em abatedouros de frangos de corte

Os produtos de origem avícola podem ser importantes veículos de transmissão de Salmonella spp. para humanos e, dentre os vários parâmetros que determinam a qualidade de um alimento, destacam-se os que definem suas características microbiológicas. Objetivou-se detectar e quantificar Salmonella spp. na tecnologia de abate de frangos de corte por microbiologia convencional (MC) e número mais provável miniaturizado (mNMP). As coletas foram realizadas em duas visitas a três abatedouros sob Inspeção Federal e em seis pontos de coleta em triplicata, definidos como: recepção das aves (swabs de cloaca e esponjas de gaiolas de transporte antes e após a higienização) e carcaças (após pré resfriamento em chiller, após o gotejamento e antes da embalagem primária e congeladas a -12oC por 24 horas), totalizando 108 amostras. Identificou-se Salmonella spp. em três dos seis pontos do fluxograma de abate e em dois dos três estabelecimentos amostrados, independentemente do método utilizado, perfazendo 5,5% de positividade, onde destaca-se a contaminação nas gaiolas de transporte das aves após a higienização. Não foi possível correlacionar os resultados da microbiologia convencional e do mNMP ou mesmo quantificar a contaminação ao longo da tecnologia de abate, o que indica a necessidade de se utilizar um método qualitativo aliado ao método de quantificação quando Salmonella estiver presente em quantidades inferiores ao limite de detecção do mNMP proposto (0,13 NMP/mL). Os sorovares identificados foram Typhimurium, Panama, Lexington e Rissen, consideradas paratíficos e, portanto, potencialmente capazes de causar infecções em humanos, embora estes sorovares não tenham sido isolados em produtos finais e sim na chegada dos frangos aos abatedouros (swabs de cloaca e gaiolas de transporte). A identificação de Salmonella spp. nas gaiolas de transporte após a higienização é um indicativo da necessidade de revisão e adequação dos métodos automatizados de lavagem atualmente utilizados nos abatedouros.

Estudo endócrino reprodutivo e do comportamento sócio-sexual de sagui-de-tufo-preto (Callithrix penicillata) mantido em cativeiro

A comunicação do estado reprodutivo nos primatas da família Callithrichidae, depende principalmente dos comportamentos sócio-sexuais como um sistema de sinalização primário, uma vez que nestas espécies a ovulação não é percebida pelos machos. Neste trabalho, os padrões de comportamentos sócio-sexuais foram analisados em conjunto com as concentrações de metabólitos fecais dos esteróides sexuais progesterona (MFP), estradiol (MFE) e testosterona (MFT) em casais cativos de Sagüi-de-tufos-pretos (Callithrix penicillata), nas diferentes fases do ciclo ovariano. O grupo estudado era composto por quarto casais adultos, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Selvagens da prefeitura de São Paulo. Os padrões comportamentais foram registrados pelo método de amostragem focal por intervalo de tempo a cada 30 segundos, cinco vezes por semana, totalizando 14.400 registros por animal. A mensuração das concentrações de metabólitos fecais dos esteroides sexuais foram realizados pelo método de enzima imunoensaio (EIE). Os resultados obtidos dessas concentrações possibilitaram a determinação endócrina das fases do ciclo ovariano (folicular e luteal) e de suas respectivas durações, assim como a determinação da fase periovulatória. Foram caracterizados 31 ciclos ovarianos completos, com duração de 24,3±4,1 dias (média ±DP), sendo que a fase folicular compreendeu 13,04±4,8dias e a fase lútea 11,2±4,2 dias. Os comportamentos sócio-sexuais (marcação por cheiro, cheirar genitália, catação e apresentação sexual) e a variável "proximidade" mostraram-se significativamente mais prevalentes na fase periovulatória do que nas demais fases do ciclo. Não houve alteração das concentrações de MFT dos machos ao longo de todo o período estudado. A análise conjunta das concentrações de metabólitos fecais de esteróides sexuais e dos comportamentos sócio-sexuais possibilitou um melhor entendimento das relações endócrino-comportamentais e reprodutivas de C. penicillata.

Isolamento microbiológico do canal auditivo de cães saudáveis e com otite externa na região metropolitana de Recife, Pernambuco

Resumo: Otite externa (OE) é o termo utilizado para definir a inflamação do conduto auditivo externo; esta doença possui diversas etiologias, ocorre em várias espécies e é particularmente frequente em cães. Os microrganismos da microbiota residente comumente estão envolvidos na etiopatogenia da OE, sendo apontados como agentes perpetuadores da doença. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil microbiológico de cães com conduto auditivo saudável e com otite na região metropolitana do Recife. Com o auxílio de suabes estéreis foram coletadas amostras das orelhas direita e esquerda de 41 cães, sendo 11 com OE e 30 sem OE. Foi realizado o isolamento bacteriano e fúngico das amostras cultivadas; observou-se positividade em 80% dos cães com orelhas saudáveis e presença de mais de um microrganismo em 38 amostras (63,3%); já nos cães com OE, a positividade foi 95,3%, com infecção polimicrobiana em 77,3% das amostras. No que se refere aos gêneros bacterianos, o perfil de isolamento microbiológico foi idêntico entre os cães otopatas e sadios. Os microrganismos isolados foram Staphylococcus sp., Micrococcus, Bacillus sp., Streptococcus sp. e Malassezia sp.

Comparação de dois métodos de colheita de medula óssea de equinos e de dois meios de diluição para o isolamento de células mononucleares

Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar a concentração e viabilidade da fração de células mononucleares (FCM) a partir de diferentes técnicas de colheita e processamento de medula óssea (MO) em equinos. Foram avaliados cinco equinos adultos, hígidos e sem raça definida. Obtiveram-se frações de medula óssea (MO) do osso esterno, de acordo com dois protocolos: na colheita A, utilizou-se 10mL de solução de heparina dentro da seringa e em seguida, aspirou-se a MO; na colheita B, 10mL de solução de heparina foi injetada na MO e a aspiração foi realizada após 20 segundos. Todos os animais foram submetidos aos dois protocolos de colheitas, realizadas em sequência, sem intervalo entre os dois procedimentos. Após isolamento da fração de células mononucleares (FCM), das amostras de MO obtidas nas colheitas A e B, cada amostra foi dividida em dois tubos, um contendo solução de DMEM e outro contendo PBS. Assim, alternando-se o tipo de colheita e a solução diluidora, obteve-se quatro tubos de amostras por animal. Os tubos foram centrifugados e os sedimentos foram homogeneizados nos respectivos meios obtendo-se o volume final de 100μL. Realizou-se determinação da concentração e viabilidade celular, obtendo-se as concentrações médias de FCM. Para ambos os meios de diluição, a colheita B apresentou valor numérico maior em comparação à colheita A, porém não foi significativo (p>0,05). Atribui-se tal tendência à menor ocorrência de coagulação da MO no momento da colheita B, sugerindo-se melhor aproveitamento da FCM. Não houve diferença (p>0,05) entre os meios DMEM ou PBS, indicando que os mesmos não alteraram a viabilidade celular. Os protocolos utilizados para colheita de MO e separação da FCM se mostraram eficientes, para o uso em terapia celular em equinos.

Efeitos de herbicidas aplicados no período reprodutivo sobre o crescimento inicial de plantas daninhas na geração seguinte

Em 1990, 91 e 92 foi conduzido experimento na Faculdade de Agronomia da UFRS, em Porto Alegre, RS, com o objetivo de avaliar os efeitos de herbicidas aspergidos durante a fase reprodutiva em balãozinho (Cardiospermum halicacabum), corriola (Ipomoea grandifolia) e quinquilho (Datura stramonium). Foram testados dois compostos imidazolinonas (imazaquin e imazethapyr) e duas sulfoniluréias (chlorimuron e metsulfuron), e avaliadas as áreas foliar e cotiledonar, estatura e matéria seca das plântulas da geração seguinte. Em quinquilho, as áreas foliar e cotiledonar das plântulas aspergidas não diferiram da testemunha. Já as estaturas de balãozinho e quinquilho foram afetadas pelos herbicidas: em quinquilho, especialmente por clorimuron; em balãozinho, além de clorimuron, também por metsulfuron. Diversos tratamentos afetaram a matéria seca total ou de segmentos de plântulas de quinquilho. Em corriola não se constataram efeitos dos tratamentos herbicidas nas variáveis avaliadas. De modo geral, as características de plântulas da geração seguinte foram afetadas por alguns herbicidas aplicados na fase reprodutiva, como matéria seca em quinquilho e estatura em balãozinho, dependendo do produto, dose e época de aplicação.

Taxa de cruzamento e sistema reprodutivo de uma população natural de Copaifera langsdorffii Desf. na região de Lavras (MG) por meio de isoenzimas

Uma população natural de Copaifera langsdorffii Desf., espécie arbórea comumente encontrada no Brasil, foi estudada por meio da eletroforese de isoenzimas, visando determinar a taxa de cruzamento e o sistema reprodutivo. A população amostrada localiza-se ao longo de um trecho do rio Capivari, em uma área de preservação permanente (floresta ciliar), entre os municípios de Lavras e Itumirim, sul do Estado de Minas Gerais, Brasil. Foram amostrados tecidos foliares de 20 indivíduos adultos da população e 400 indivíduos jovens (progênies) procedentes de sementes coletadas de 20 matrizes na população. Cinco sistemas enzimáticos revelaram 24 e 29 alelos totais para os indivíduos adultos e progênies, distribuídos em 12 locos. O sistema reprodutivo desta população foi inicialmente abordado pelo teste de Equilíbrio de Hard-Weinberg (EHW), tendo-se verificado que a maioria dos locos dos indivíduos adultos encontra-se nas proporções do EHW e a maioria dos locos das progênies encontra-se fora do EHW. A estimativa da taxa de cruzamento multilocos (t m) e unilocos (t s) média foi, respectivamente 0,917 e 0,877 indicando a existência de autofecundação (8%) na população estudada. Os resultados obtidos indicaram também que a espécie Copaifera langsdorffii é de reprodução mista predominantemente alógama. A população estudada mostrou-se potencial para fins de conservação in situ. A área mínima estimada para conservação in situ foi de 5,0 hectares.

Polinização de Cambessedesia hilariana (Kunth) DC. (Melastomataceae): sucesso reprodutivo versus diversidade, comportamento e freqüência de visitas de abelhas

A fenologia reprodutiva, a biologia da polinização e o sistema de reprodução de Cambessedesia hilariana foram estudados em uma população rupícola em Vinhedo, São Paulo, sudeste do Brasil. Essa espécie apresenta pico de floração entre outubro e dezembro, com alta produção de flores por dia. A antese se inicia por volta das 7:00 h com o afastamento das pétalas, seguida pela disposição em grupo dos elementos reprodutivos na parte inferior da flor. O recurso disponível é o pólen, liberado por vibrações realizadas pelas abelhas. O estigma é receptivo e o pólen é viável, ambos durante cerca de 60 horas. A frutificação em condições naturais (70%) assemelha-se à obtida por meio de polinizações cruzadas manuais (74%) sendo maiores que as porcentagens obtidas em flores autopolinizadas manualmente (12,5%), porém não há indícios de reações de autoincompatibilidade nos tubos polínicos. Os principais polinizadores são Bombus morio, Centris sp., Centris cf. nitens, Euglossa cordata e Xylocopa sp. O visitante mais freqüente é Centris sp. (50,71%), contudo suas visitas resultam nas menores taxas de formação de frutos e sementes quando comparadas às taxas resultantes de visitas das outras espécies de abelhas. Altas taxas de frutificação e formação de sementes em C. hilariana parecem estar relacionadas à diversidade de abelhas, ao comportamento de forrageio, à capacidade de transporte de pólen e à freqüência de visitas ao longo do período de floração, bem como ao sistema reprodutivo que favorece a xenogamia.

Polinização por vibração e sistema reprodutivo de duas espécies de Sauvagesia L. (Ochnaceae)

Foram estudados a fenologia, a morfologia floral, o sistema de polinização e de reprodução de Sauvagesia erecta L. e S. sprengelii A. St.-Hil., respectivamente, em um remanescente de Mata Atlântica, localizado no Parque Estadual Dois Irmãos, Recife, e em áreas abertas, em Goiana, litoral norte de Pernambuco. As espécies apresentam flores de pólen com anteras poricidas envolvidas por um cone, formado por estaminódios petalóides, deixando apenas um poro apical, através do qual o pólen é liberado. As espécies possuem um padrão de floração contínuo. Ambas são auto-compatíveis, autógamas e não formam frutos apomíticos. Foram observadas visitas de abelhas das famílias Apidae e Halictidae, as quais polinizam as flores através da vibração das anteras. Duas espécies de Paratetrapedia visitaram apenas flores de S. erecta. Bombus brevivillus Franklin, Florilegus similis Urban e Xylocopa muscaria Fabricius foram observadas somente em flores de S. sprengelii. Por sua vez, as espécies de Augochloropsis visitaram flores de ambas as espécies. Todas essas abelhas vibram o cone de estaminódios e as anteras e podem polinizar a flor, com exceção de uma espécie de Paratetrapedia. De acordo com o comportamento dos visitantes, observa-se que o cone de estaminódios tem uma função na polinização por vibração, equivalente a uma antera poricida, tratando-se, portanto, de uma transferência de função, já mencionada anteriormente para a família.

Biologia floral, melitofilia e influência de besouros Curculionidae no sucesso reprodutivo de Grobya amherstiae Lindl. (Orchidaceae: Cyrtopodiinae)

A fenologia, morfologia floral, mecanismos de polinização, biologia reprodutiva e sucesso reprodutivo de Grobya amherstiae Lindl. foram estudados em duas populações localizadas em regiões de mata mesofítica semidecídua de altitude da Serra do Japi (Jundiaí-SP). Grobya amherstiae floresce no verão, entre os meses de fevereiro e março. Todas as flores da inflorescência abrem mais ou menos simultaneamente pela manhã, e cada flor dura cerca de sete a oito dias. As flores emitem suave fragrância adocicada semelhante a do mel. Em ambas as populações G. amherstiae foi polinizada por abelhas Paratetrapedia fervida Smith (Anthophoridae), que coletam óleo produzido em elaióforos tricomáticos do ápice do labelo e da base da coluna. Além de P. fervida, em uma das populações, uma espécie de besouro do gênero Montella (Curculionidae) realizou autopolinizações na maioria das flores. Grobya amherstiae é autocompatível, mas depende de polinizador para transferência de pólen. As fêmeas do besouro ovipõem no ovário e suas larvas se alimentam das sementes. O número de frutos parasitados pelas larvas é baixo em relação à quantidade de frutos produzidos. Como a taxa de frutificação em condições naturais é baixa, os besouros contribuem para o sucesso reprodutivo de G. amherstiae em uma das populações.

Isolamento de oligossacarídeos de xiloglucano de dicotiledôneas através de hidrólise enzimática e cromatografia de exclusão molecular

Oligossacarídeos derivados do xiloglucano, um polissacarídeo constituinte da parede celular vegetal, vêm sendo considerados como moléculas capazes de sinalizar e/ou regular eventos relacionados ao crescimento e à expansão celular. A purificação desses oligossacarídeos é imprescindível para a realização de ensaios relativos à sua atividade biológica. Neste trabalho, xiloglucanos foram extraídos a partir de sementes de copaíba (Copaifera langsdorffii Desf.) e suspensões celulares de feijão (Phaseolus vulgaris L.) e hidrolisados com celulase (endo-glucanase) para obtenção dos oligossacarídeos de xiloglucano, os OXGs. Os resultados obtidos mostram que a técnica de cromatografia dupla em gel de exclusão molecular foi eficiente para purificação dos oligossacarídeos, apresentando OXGs dos tipos XLLG e XXXG com grau de pureza próximo a 90%, e do tipo XXFG próximo de 80%.