Extração e caracterização de carboidratos presentes no alho (Allium sativum L.): proposta de metodologia alternativa

O alho é um alimento funcional que contém inulina, um polissacarídeo de reserva, que auxilia no controle das bactérias patogênicas e putrefativas existentes no intestino. O presente trabalho teve por objetivo avaliar uma metodologia simples de extração de carboidratos do alho, qualificar e quantificar a composição desse extrato empregando a cromatografia líquida de alta eficiência e a espectroscopia na região do infravermelho utilizando para isso um padrão de inulina. Os bulbos de alho foram submetidos à extração aquosa a quente por 4 horas; posteriormente o líquido resultante foi separado e a ele foram adicionados 300 mL de acetona. O extrato isolado foi avaliado quanto aos seus produtos de hidrólise alcalina e os resultados indicaram a presença de um oligossacarídeo como o observado para a inulina padrão. As principais bandas características dos carboidratos foram visualizadas entre 3600 a 3000 e 1200 a 900 cm-1. A técnica utilizada neste trabalho pode ser utilizada para extração da inulina, pois agrega valor a produtos naturais, gerando alternativas do ponto de vista econômico.

Utilização do Intron Splice Site primer EI-1 na discriminação de leveduras contaminantes do processo de fermentação alcoólica

Neste trabalho, utilizamos o Intron Splice Site primer EI-1 para a análise do perfil de amplificação de diferentes espécies de leveduras consideradas contaminantes no processo de fermentação alcoólica, originadas de uma destilaria no Estado da Paraíba na safra 2004/2005. Foram realizadas as etapas analíticas para discriminação molecular das leveduras a partir da extração do DNA total, amplificação por PCR e análise do perfil genético. Os resultados obtidos indicam que o Intron Splice Site primer EI-1é muito eficaz na discriminação das diferentes espécies de Saccharomyces e não Saccharomyces, evidenciando padrões de bandas específicos para as leveduras analisadas. Este primer, por ser complementar a uma região muito conservada do genoma das leveduras, mostrou-se incapaz de uma discriminação intraespecífica. Isto demonstra a utilidade deste marcador no auxílio à taxonomia de leveduras.

Análise da pureza genética e discriminação de cultivares de vinca (Catharanthus roseus (L.) G.Don) usando "random amplified polymorphic DNA" em DNA extraído de sementes e folhas

A técnica "Random Amplified Polymorphic DNA" (RAPD) surgiu como uma ferramenta útil para testar a pureza genética e a discriminação de cultivares em muitas espécies. É uma técnica simples, rápida, relativamente de baixo custo e permite o uso de DNA extraído de sementes secas, o que é muito importante em um programa de análise de sementes. O uso desta tecnologia no teste da pureza genética pode ser muito interessante para algumas espécies, como a vinca (Catharanthus roseus (L.) G.Don), pois pouco se conhece a respeito da seqüência de seu DNA. É interessante, também, pelo fato de existir grande número de "primers" comercialmente disponíveis, que podem ser prontamente utilizados para gerar dados. Essa técnica pode ser mais facilmente utilizada para gerar padrões de bandas polimórficas suficientes para discriminar genótipos diferentes. Todavia, no presente estudo, os padrões RAPD de bandas obtidas de amostras de DNA extraído de sementes de vinca em "bulk" foram não-consistentes, o mesmo ocorrendo com o uso de DNA extraído de sementes individuais de um mesmo cultivar, o que evidencia que a técnica não é aplicável para testar a pureza genética e a discriminação de cultivares de vinca. Entretanto, os padrões de bandas RAPD gerados a partir de DNA extraído de tecido foliar de plântulas foram mais reproduzíveis e poderiam ser considerados na caracterização de cultivares.

Análise numérica dos eletroforegramas de gliadinas de cultivares de triticale

Buscando automatizar o processo de identificação de cultivares pelo método de eletroforese de proteínas, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a viabilidade da utilização de valores de intensidade das bandas como dados adicionais de polimorfismos na discriminação de cultivares e comparar o comportamento de vários coeficientes de similaridade na análise dos eletroforegramas de gliadinas. Os eletroforegramas de gliadinas de quatro cultivares de triticale estreitamente relacionadas foram comparados pela análise computacional utilizando seis coeficientes de similaridade binários (presença/ausência) (Jaccard, Sorensen-Dice, Nei & Li, Simple Matching, Yule e Baroni-Urbani) e cinco quantitativos (Pearson product moment correlation, Spearman, Percent Similarity, Modified Morisita e Gower). As análises quantitativas dos eletroforegramas levaram em conta a intensidade das bandas, disposta em diferentes números de classes, possibilitando avaliar o efeito da variabilidade desse parâmetro. Foram utilizadas cerca de 60 amostras individuais de sementes de cada cultivar. Apesar do baixo polimorfismo intervarietal, os coeficientes médios de similaridade dentro das cultivares sempre foram maiores do que entre cultivares, o que indica o alto poder discriminatório dos testes. O estudo demonstra a viabilidade de identificar cultivares de triticale pela comparação numérica dos dados de eletroforese de gliadinas, obtidos das amostras, com uma biblioteca de eletroforegramas. Esse procedimento garante uma comparação mais objetiva dos eletroforegramas, em relação à análise visual. Foi constatado também, que a intensidade (densidade) das bandas nos eletroforegramas de gliadinas é muito variável, sendo portanto um parâmetro pouco confiável na análise de polimorfismos de gliadinas em triticale. Ainda com relação ao parâmetro intensidade, há uma perda progressiva na confiabilidade dos resultados de comparação com o aumento no número de classes de intensidade.

Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho

Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de alfa-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de "random primers". A amplificação por PCR de uma porção do gene da alfa-amilase foi realizada com os "primers": "sense" - CGACATCGACCACCTCAAC; "antisense" - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de alfa-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação.

Armazenabilidade de sementes de cafeeiro colhidas em diferentes estádios de maturação e submetidas a diferentes métodos de secagem

O momento da colheita e os métodos de secagem podem influenciar a qualidade das sementes de cafeeiro durante o armazenamento. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos do estádio de maturação e do método de secagem sobre a qualidade fisiológica e a armazenabilidade de sementes de cafeeiro. Os ensaios foram realizados nos Laboratórios de Análise de Sementes e de Técnicas Moleculares do Departamento de Agricultura da UFLA. Os frutos do cultivar Rubi foram colhidos, despolpados, e as sementes lavadas e deixadas sobre papel para retirada da água superficial. As sementes nos estádios verde cana e cereja foram submetidas à secagem convencional (à sombra) e à secagem em secador estacionário sob temperatura de 35ºC. Como testemunha foram analisadas sementes sem secagem. As avaliações foram feitas imediatamente após os tratamentos de secagem e após 4 e 8 meses de armazenamento. As sementes foram armazenadas a 10ºC em sacos plásticos impermeáveis. Foram realizados os testes de germinação, de protrusão radicular, de matéria seca de plântulas, de índice de velocidade de emergência, de condutividade elétrica, além de análises eletroforéticas de proteínas resistentes ao calor e da quantificação da atividade da enzima endo-ß-mananase. O delineamento foi inteiramente ao acaso em esquema fatorial dois (estádios de maturação) x três (métodos de secagem) x três (tempos de armazenamento), com quatro repetições. Sementes de cafeeiro colhidas no estádio cereja têm maior potencial de armazenamento que no estádio verde cana. Ocorre redução de germinação e vigor nas sementes de cafeeiro colhidas no estádio verde cana, quando submetidas à secagem rápida. A presença ou intensidade de bandas de proteínas resistentes ao calor está associada à secagem das sementes. Ocorre maior atividade da enzima endo-ß-mananase em sementes colhidas no estádio cereja que no estádio verde-cana. Ocorre aumento da atividade da enzima endo-ß-mananase durante o armazenamento.

Qualidade fisiológica de sementes de milho, feijão, soja e alface na presença de extrato de tiririca

A espécie Cyperus rotundus (tiririca) é perene e de difícil controle. Os órgãos subterrâneos dessa ciperácea produzem inibidores capazes de interferir na germinação e no crescimento de plântulas e de plantas de várias espécies, fenômeno chamado de alelopatia. A inibição na germinação de sementes pode estar associada à interferência de substâncias alelopáticas na atividade de enzimas chaves no processo de germinação. Nesse trabalho foi avaliada a qualidade fisiológica assim como a atividade de enzimas envolvidas no processo de germinação em sementes de milho, feijão, soja e alface submetidas ao extrato de bulbos de tiririca. As sementes foram germinadas em substrato contendo extrato de bulbos de tiririca, nas concentrações de 10 g L-1 e 100 g L-1 e água destilada. A avaliação da qualidade fisiológica foi feita por meio de testes de germinação e vigor. Avaliou-se a atividade das enzimas superóxido-dismutase e esterase para todas as espécies, catalase para as sementes de milho e feijão, peroxidase e endo-b-mananase para as de alface, glutamato-oxalacetato-transaminase e a-amilase para as de milho e glicose-6-fosfato-desidrogenase para as de soja. Observou-se uma diminuição da germinação das sementes de alface com o aumento da concentração do extrato, inibição da germinação das sementes de milho e de feijão quando submetidas ao extrato na concentração de 10 g L-1 e um estímulo da germinação de sementes de soja na presença do extrato na concentração de 10 g L-1 e uma inibição em extrato na concentração de 100 g L-1. Foi observada redução da atividade das enzimas superóxido-dismutase, endo-b-mananase, peroxidase e a-amilase com o aumento da concentração do extrato. Para glutamato-oxalacetato-transaminase e glicose-6-fosfato-desidrogenase observou-se aumento da atividade da enzima com o aumento da concentração do extrato, indicando a perda da qualidade das sementes. Para esterase foi verificada menor atividade da enzima nas sementes de alface submetidas à germinação em substrato contendo 100 g L-1 e em soja menor atividade dessa enzima foi observada nas concentrações de 0 e 100 g L-1. Para catalase, observou-se padrões diferenciados de bandas sob concentrações de 10 e 100 g L-1 para o milho. O extrato de bulbos de tiririca interfere na qualidade fisiológica na atividade das enzimas envolvidas no processo de germinação de sementes de milho, feijão, soja e alface.

Alterações fisiológicas e bioquímicas durante a embebição de sementes de sucupira-preta (Bowdichia virgilioides Kunth.)

Nessa pesquisa foi avaliado o comportamento das sementes de sucupira-preta durante a embebição, bem como as modificações em algumas proteínas durante esse processo. As sementes foram embebidas em rolo de papel umedecido, a 30°C e pesadas a cada 6 horas até a protrusão radicular de 50% das sementes, após o que as sementes foram submetidas a análises protéicas pela técnica da eletroforese. A curva de embebição dessa espécie segue um modelo trifásico. Na avaliação dos sistemas enzimáticos, foi observado um comportamento constante para as enzimas superóxido dismutase e malato desidrogenase. Para a enzima álcool desidrogenase, catalase e α-amilase, a intensidade das bandas variou em função do lote utilizado. Para as proteínas resistentes ao calor, foi observada a presença de bandas durante toda a germinação, com alterações na intensidade no decorrer do processo.