Bioensaios na detecção e quantificação de sementes de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

O cultivo mundial de soja geneticamente modificada (GM) resistente ao glifosato é crescente e a presença dessas sementes em lotes de sementes convencionais tornou-se um problema para o comércio internacional da soja. Reconhecendo a importância dos novos mercados e dos produtos GM, a Tecnologia de Sementes terá que assegurar a pureza genética dos produtos derivados da biotecnologia através de testes confiáveis, práticos e de baixo custo. Nesse contexto, os objetivos do trabalho foram verificar a eficiência do teste de germinação com herbicida no substrato (bioensaios) na detecção e na quantificação de misturas de cultivares GM em amostras de sementes convencionais. Amostras de sementes convencionais foram preparadas com 0, 1, 3 e 5% de sementes de soja GM e submetidas aos métodos de pré-embebição, substrato umedecido e imersão em herbicida, instaladas em bandejas plásticas contendo 25 sementes, com e sem associação ao kit de detecção de OGM. Na seqüência, amostras contaminadas com 0, 1, 3, 5 e 8% de sementes de soja GM foram semeadas em rolos de papel (25 e 50 sementes/rolo) e bandejas plásticas com 25 sementes seguindo o método de pré-embebição em herbicida. Aos seis dias após a instalação, avaliaram-se comprimento de hipocótilo, comprimento de raiz, número de raízes secundárias e comprimento da maior raiz secundária. O método de pré-embebição é o mais eficiente para a detecção e quantificação da presença de sementes de soja GM, permitindo 100% de acertos na detecção, independentemente da porcentagem de contaminantes nas amostras convencionais de sementes de soja e apresenta exatidão na quantificação da presença de até 3% de sementes de soja GM em amostras convencionais, sendo sua precisão condicionada ao porcentual de mistura presente na amostra.

Sistema hidropônico com uso de solução de herbicida na detecção de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

Os objetivos deste estudo foram verificar a eficiência do sistema hidropônico com uso de solução herbicida na detecção de cultivares de soja GM resistentes ao glifosato e convencionais e estabelecer um protocolo de detecção em sistema hidropônico. Foram utilizadas amostras de sementes de dois genótipos geneticamente modificados e os respectivos parentais não geneticamente modificados (não-GM). Foram realizados cinco ensaios para estabelecer o protocolo de detecção; nos ensaios I e II foi realizada a pré-germinação das sementes, seguida da colocação das plântulas em recipientes contendo solução nutritiva, com posterior transferência para solução de herbicida (as concentrações utilizadas foram 0; 0,12; 0,24; 0,36; 0,48% do equivalente ácido do glifosato), e finalmente, as plântulas retornaram para a solução nutritiva. Nos ensaios III, IV e V, as sementes foram colocadas diretamente em recipientes contendo solução de herbicida e depois transferidas para solução nutritiva. Os parâmetros avaliados foram porcentagem de plântulas normais, comprimento de plântula, de raiz e de parte aérea e número de raízes secundárias. O sistema hidropônico permite a detecção de sementes de soja resistente ao glifosato em 5 dias, após tratamento com solução de glifosato. O protocolo de detecção de sementes de soja GM em sistema hidropônico recomendado é a permanência das sementes em contato com a solução do herbicida na concentração de 0,12% do equivalente ácido do glifosato por quatro horas, seguido da transferência das sementes para a solução nutritiva até completar cinco dias, utilizando como parâmetro de avaliação o comprimento de plântulas e a presença de raízes secundarias das plântulas de soja GM.

Ajuste de metodologias para a identificação de cultivares de soja quanto à tolerância ao glifosato

Os bioensaios constituem numa alternativa prática e eficiente para detecção de sementes de soja geneticamente modificada (GM), tolerante ao glifosato. Contudo, deve ser verificada sua utilização na identificação das sementes quando o lote é de soja GM, ou seja, quando sementes de soja convencional são a minoria. Objetivou-se com este trabalho ajustar a metodologia de dois bioensaios de detecção de sementes de soja GM e testar os melhores protocolos, um de cada bioensaio, na detecção e quantificação de misturas simuladas, contendo genótipos contrastantes quanto à tolerância ao herbicida. Nos bioensaios, foram testadas três umidades do substrato (2,0; 2,5 e 3,0 vezes o seu peso seco), cinco soluções do herbicida (0; 0,01; 0,03; 0,06 e 0,12 %) no método papel umedecido com glifosato e quatro soluções (0; 0,3; 0,6 e 1,2 %) no método pré - embebição de sementes. A umidade 3,0 e solução 0,03 % constituíram o protocolo mais eficiente para detecção no método do papel umedecido. A umidade 2,0 e solução 0,3 % se destacaram no método da pré-embebição das sementes. Foi mais prático e rápido detectar plântulas tolerantes do que plântulas sensíveis em ambos os testes. Em amostras com maior taxa de contaminação, foi mais fácil detectar e mais difícil quantificar misturas com exatidão. Os erros foram relativamente raros considerando os acertos.

Parâmetros morfológicos para estabelecer tolerância diferencial à toxicidade de alumínio em cultivares de arroz

Dois experimentos em casa de vegetação foram conduzidos visando identificar parâmetros morfológicos ligados à tolerância ao alumínio (Al) e estabelecer a concentração de Al e o tempo de cultivo suficientes para a expressão da tolerância ao Al, em duas cultivares de arroz, em solução nutritiva. Plantas de determinado comprimento radicular máximo foram transferidas para solução nutritiva com quatro concentrações de Al (0, 80, 160 e 320 mimol L-¹), a pH 4,0. Em cada coleta, foram medidos o comprimento máximo radicular, área radicular, área foliar e massa seca de raízes e parte aérea. Apenas os parâmetros morfológicos ligados ao sistema radicular possibilitaram o reconhecimento da tolerância diferencial das cultivares; a elongação radicular relativa foi a medida mais sensível. Quatro dias de exposição ao Al foram suficientes para a detecção da tolerância diferencial por meio da elongação radicular relativa. Os procedimentos estabelecidos nos experimentos podem ser utilizados para a avaliação de um número maior de cultivares.

Detecção de fungos endofíticos em sementes de caupi provenientes de Serra Talhada e de Caruaru, estado de Pernambuco

O presente trabalho teve como objetivo detectar e identificar fungos endofíticos em sementes de caupi (Vigna unguiculata), IPA-201, IPA-202, IPA-204, IPA-205 e IPA-206, procedentes dos municípios de Serra Talhada e Caruaru, bem como verificar a influência desses microrganismos na germinação das sementes. Foram analisadas 400 sementes de cada cultivar, pelo método do papel de filtro, que demonstrou a presença de 71 espécies fúngicas compreendidas em 23 gêneros. Os mais freqüentes foram Aspergillus, Penicillium e Fusarium, correspondendo a 81,44% do total de colônias encontradas. Com relação à qualidade das sementes, as maiores incidências foram observadas nas sementes cultivadas em Serra Talhada, possivelmente pelo tempo de armazenamento. Os fungos afetaram a germinação, principalmente, nas cultivares IPA-201 e IPA-202 de Serra Talhada com percentuais de germinação correspondentes a 53,2 e 65,5%, respectivamente. A presença dos fungos foi observada nas sementes causando necrose nos cotilédones, radícula e folhas primárias, originando plântulas anormais. As sementes da cultivar IPA-206 apresentaram melhor padrão de sanidade e germinação.

Detecção de Xylella fastidiosa em germoplasma de cafeeiro

A bactéria Xylella fastidiosa possui uma ampla gama de plantas hospedeiras que inclui espécies de pelo menos 28 famílias de mono e dicotiledôneas. Em cafeeiro (Coffea spp.), a ocorrência dessa bactéria foi relatada previamente em cultivares da espécie Coffea arabica. Estudos foram realizados para determinar a presença de X. fastidiosa em diferentes espécies e híbridos interespecíficos de cafeeiro. As amostragens foram realizadas em dois anos consecutivos. As espécies de cafeeiro examinadas foram: C. kapakata, C. canephora, C. racemosa, C. arabica, C. dewevrei, C. stenophylla e C. eugenioides. Também foram incluídos neste estudo híbridos interespecíficos de C. arabica: C. arabica x C. dewevrei, C. arabica x C. eugenioides, C. arabica x C. racemosa e C. arabica x C. robusta. Foram coletadas amostras de ramos plagiotrópicos de diferentes plantas para cada espécie e híbrido. A detecção de X. fastidiosa nas amostras foi realizada utilizando os testes serológicos de DAS-ELISA e imunofluorescência indireta. A bactéria foi detectada nas sete espécies e nos quatro híbridos de cafeeiro examinados. Entretanto, as plantas aparentemente não apresentavam sintomas de infecção por X. fastidiosa. A espécie C. arabica apresentou a maior proporção de amostras positivas e maiores valores de absorbância no teste de DAS-ELISA. Em contraste, as espécies C. racemosa e C. dewevrei foram as que apresentaram menores proporções de amostras positivas para presença de X. fastidiosa, como também menores valores de absorbância no teste de DAS-ELISA.

Detecção do Southern bean mosaic virus no Paraná, e separação do Bean rugose mosaic virus em feijoeiro

Em lavouras de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) da cultivar Carioca Comum, no município de Londrina, Estado do Paraná, foram encontradas plantas com sintomas de necrose da haste, mosaico clorótico leve e porte reduzido, semelhantes aos sintomas causados por infecção viral. Exames de microscopia eletrônica revelaram a presença de partículas isométricas. Em testes de imunodifusão dupla em gel de ágar os extratos foliares de plantas infetadas reagiram positivamente com anti-soro específico para o Southern bean mosaic virus (SBMV). O vírus foi purificado e a massa molecular de sua proteína capsidial foi estimada em 30 kDa, valor esperado para proteínas do capsídeo de vírus do gênero Sobemovirus. A gama de hospedeiras do SBMV isolado no Paraná foi restrita ao feijoeiro e a algumas cultivares de soja (Glycine max). A separação de dois vírus isométricos comuns em infecções mistas no feijoeiro foi possível através da reação de imunidade ao SBMV apresentada por Crotalaria sp, Chenopodium quinoa e Mucuna deeringiana, e da reação de susceptibilidade dessas mesmas hospedeiras ao Bean rugose mosaic virus (BRMV).

Predominância de begomovírus em tomateiros na região produtora da Ibiapaba, Ceará, e sua detecção natural em plantas daninhas

O tomateiro, Lycopersicon esculentum Mill., hortaliça de grande importância econômica para o Brasil, apresenta muitos problemas fitossanitários, dentre os quais as viroses. Os vírus associados à cultura no país pertencem aos gêneros Begomovirus, mais frequentemente relatado, Potyvirus, Cucumovirus, Tospovirus e Tobamovirus. No Ceará, apesar de relatos da incidência de viroses em tomateiros na Chapada da Ibiapaba, maior região produtora do estado, há escassez de informações sobre a situação atual da ocorrência de begomovírus, nas diversas lavouras daquele agropólo. Assim, foram objetivos deste trabalho: realizar levantamento da presença de begomovírus nas cultivares e híbridos de tomateiro explorados comercialmente na Ibiapaba; verificar a ocorrência de plantas daninhas infectadas e investigar a transmissão artificial de begomovírus isolados de tomateiro e de plantas daninhas para tomateiro. Os testes sorológicos e a PCR realizados detectaram begomovírus em 'Alambra', 'Densus', 'Monalisa', 'Santa Clara', 'Sheila', 'Sofia', 'Raisa-N' e 'TY- Fanny', cultivares e híbridos mais cultivados nas lavouras. Além de begomovírus, Cucumber mosaic virus (CMV) e Potato virus Y (PVY) foram também detectados. As plantas daninhas Amaranthus spinosus, A. viridis, Ageratum conyzoides e Bidens pilosa foram identificadas como hospedeiras naturais de begomovírus. A transmissão de begomovírus de tomateiro para tomateiro ocorreu em inoculações por enxertia e via extrato foliar e de plantas daninhas infectadas para tomateiros sadios somente por enxertia. O levantamento revelou que, à semelhança do que ocorre no restante do país, begomovírus são predominantes nas lavouras de tomate da Ibiapaba e que as plantas invasoras ali encontradas podem ser fontes de infecção viral para a cultura.

Detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) em bananeiras no Brasil

A técnica de PCR utilizando-se "primers" degenerados para o gênero Badnavirus foi utilizada para a detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) provenientes de bananeiras. A partir desta metodologia seqüências do vírus puderam ser detectadas em cultivares diplóides (AA), triplóides (AAA; AAB) e tetraplóides (AAAB). Foram encontrados quatro padrões de seqüência do BSV (estirpes BSVBR-1, BSVBR-2, BSVBR-3 e BSVBR-4), diferenciadas através da análise do perfil eletroforético das amostras amplificadas. A estirpe BSVBR-1 prevalece nos estados do Acre, Amazonas, Bahia, Ceará, Goiás, Minas Gerais, Piauí, Rio de Janeiro, Rondônia, Santa Catarina, e São Paulo, enquanto que, a estirpe BSVBR-2 foi encontrada em amostras oriundas do Amazonas e do Ceará. As estirpes BSVBR-3 e BSVBR-4 foram encontradas apenas no Ceará. Este trabalho revela a presença de diferentes estirpes do BSV no Brasil, bem como a existência de cultivares de bananeiras sadias e livres de seqüências virais do BSV integradas ao seu genoma.

Detecção e variabilidade de Plasmopara halstedii no Brasil e avaliação da resistência de genótipos de girassol ao míldio

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de identificar a raça fisiológica de Plasmopara halstedii que ocorreu em plantas de girassol coletadas no campo experimental da Embrapa Soja, Londrina, PR, em 1998, 2001 e 2002 e avaliar a reação de genótipos de girassol ao míldio. Plântulas de girassol das diferenciadoras de raças e das cultivares foram inoculadas com suspensão de zoosporângios do patógeno e foram plantadas em caixas contendo areia autoclavada. As plântulas foram mantidas em câmara climatizada, com temperatura controlada em 21ºC, por 11 dias. Em seguida, as plantas foram aspergidas intensamente com água destilada, cobertas com saco plástico e mantidas no escuro, a 18ºC. No dia seguinte, foi observada a presença de esporulação nos cotilédones. As plantas que apresentaram esporulação foram consideradas suscetíveis e as sem esporulação foram resistentes. O resultado indicou tratar-se da raça 330 (antiga raça 7 americana), nas três ocasiões. Os genótipos de girassol Embrapa 122, BRS 191 e as cultivares de girassol ornamental BRS Capri M, BRS Encanto M, BRS Oásis, BRS Paixão M, BRS Pesqueiro M, BRS Refúgio M, BRS Saudade M e BRS Saudade U e seus respectivos parentais foram suscetíveis a P. halstedii raça 330. Os genótipos AGROBEL 910, AGROBEL 920, AGROBEL 960, AGROBEL 965, C11, EXP38, M734, M742 e RUMBOSOL 91 foram resistentes à raça 330 do patógeno e podem ser indicados aos agricultores para uso em regiões de risco de ocorrência da doença.

Detecção do Grapevine leafroll-associated virus 5 no Estado de São Paulo

O enrolamento da folha da videira ("grapevine leafroll") é uma doença atribuída a pelo menos nove vírus sorologicamente distintos, Grapevine leafroll-associated viruses 1 a 9 e designados GLRaV-1 a GLRaV-9. No Brasil, já é conhecida a existência do GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3 e GLRaV-6. Neste trabalho, foi demonstrada a ocorrência do GLRaV-5 em amostras de videiras cultivadas no Estado de São Paulo, mediante teste de Biotina-ELISA. O vírus foi detectado com baixa incidência nas cultivares avaliadas, exceto na 'Cardinal', que apresentou 100% de infecção. Este é o primeiro relato da ocorrência do GLRaV-5 no Brasil.

Murcha de fusário em helicônia: fontes de resistência, método alternativo de detecção e defesa estrutural

O cultivo das helicônias vem sendo afetado pela murcha, causada por Fusarium oxysporum f.sp. cubense. Este trabalho objetivou identificar fontes de resistência, verificar a detecção da resistência através de método alternativo e avaliar a lignificação como mecanismo de defesa do hospedeiro ao patógeno. As espécies utilizadas na identificação de resistência foram Heliconia bihai, H. psittacorum cvs. Golden Torch e Golden Torch Adrian, H. rostrata, H. stricta cvs. Capri e Fire Bird, H. psittacorum cvs. Sassy e Alan Carle, H. caribea, H. latispatha, H. wagneriana e H. chartacea cv. Sexy Pink. A avaliação dos sintomas foi realizada aos 40 dias após a inoculação baseada em escala de notas variando de 1 a 6. As espécies consideradas resistentes foram H. bihai, H. psittacorum cvs. Golden Torch e Golden Torch Adrian, H. rostrata, H. stricta cv. Capri, H. psittacorum cv. Sassy e H. caribea. O método alternativo de detecção de resistência consistiu na utilização de filtrado fúngico obtido a partir do cultivo em meio Czapek, utilizando várias concentrações do mesmo depositando em folhas destacadas das cultivares resistentes e suscetíveis H. psittacorum cvs. Golden Torch e Alan Carle, respectivamente. A avaliação foi feita após 48 horas de incubação, onde a concentração em 50% do filtrado foi a mais eficiente na distinção da resistência. O mecanismo estrutural foi observado em secções histológicas nas raízes das espécies utilizadas no estudo de resistência, inoculadas com o método de injeção e não inoculadas, que permitiram verificar a ausência de relação entre a resistência e a lignificação.

Qualidade de tubérculos de batatas-semente tratados com paraquat e o desenvolvimento de uma metodologia simplificada de detecção de resíduo do herbicida

O objetivo desse trabalho foi avaliar a qualidade de tubérculos de batatas-semente (Solanum tuberosum) tratados com paraquat e desenvolver uma metodologia simplificada de detecção de resíduos de herbicida. Dois ensaios foram realizados no Laboratório da Ciência das Plantas Daninhas do Centro Nacional de Pesquisa de hortaliças, Brasília, DF. No experimento, tubérculos das cultivares Achat e Baronesa foram submersos em soluções de 0 e 200 ppm de paraquat ou injetados com 0,5 ml de soluções de 0 e 200 ppm do herbicida. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 8 repetições e 12 tubérculos por parcela. Os tubérculos foram colocados em câmara fria, após a aplicação com paraquat, para quebra da dormência. Após a brotação dos tubérculos avaliou-se a qualidade interna dos mesmos, amostrando, posteriormente, 2 tubérculos de cada parcela para o plantio em vasos, sob condições de telado, para verificar possíveis danos no crescimento das plantas oriundas dos tubérculos tratados. Os tratamentos de imersão não provocaram, aparentemente, nenhum dano interno nos tubérculos, ou nem mesmo afetaram a nova geração, entretanto, os tubérculos injetados com paraquat foram severamente deteriorados e carbonizados, originando plantas bastante debilitadas. Esses resultados indicam que quando o paraquat for aplicado sob condições que favoreçam sua penetração ou translocação para o interior do tubérculo, atingindo os vasos e a polpa, pode danificá-lo severamente, prejudicar sua aparência, qualidade de produção e reduzir o desenvolvimento da nova geração de plantas oriundas dos tubérculos contaminados . No segundo experimento, desenvolveu-se uma metodologia simplificada para detectar resíduos de paraquat nos tubérculos através de colorimetria, visto que o paraquat é reduzido a um radical de cor azul na presença de ditionito de sódio (Na2S2O4) a 1% em meio básico, a qual se intensifica à medida que a concentração do produto aumenta. A metodologia simplificada desenvolvida permitiu detectar resíduos de paraquat ao nível de 0,06 ppm, indicando uma excelente aproximação, pois, o limite de tolerância do paraquat em tubérculos de batata é de 0,2 ppm, normalmente, determinado pelo método analítico completo, que apresenta limites de detecção em torno de 0,01 ppm e recuperação acima de 70%. Uma avaliação qualitativa da concentração residual de produto nas amostras foi possível através de leitura e comparações visuais entre os diferentes graus de cores desenvolvidas nas soluções visuais entre os diferentes graus de cores desenvolvidas nas soluções padrão e a cor desenvolvida na amostra, não necessitando, portanto, das leituras colorimétricas, podendo ser feita inclusive no campo. Observou-se que a maioria do paraquat permaneceu na região de casca até o período de 4 semanas após a aplicação do paraquat.

Detecção de soja geneticamente modificada tolerante ao glifosato por métodos baseados na atividade de enzimas

Avanços na engenharia genética permitiram a obtenção de plantas geneticamente modificadas tolerantes a determinados herbicidas. O uso de sementes de plantas geneticamente modificadas está aumentando rapidamente, havendo a necessidade de desenvolver métodos de identificação e detecção rápidos, práticos e de baixo custo, que possam ser padronizados.O objetivo desta pesquisa foi desenvolver um método bioquímico de deteccção de soja tolerante ao glifosato. Foram comparados dois genótipos de soja, um tolerante ao glifosato e seu parental não geneticamente modificado. As sementes foram submetidas a tratamentos de pré-embebição por 16 horas, em água e em solução de herbicida contendo 0,6% do ingrediente ativo e, mantidas a seguir em germinador à temperatura de 25°C por sete dias. Após, foi realizada a extração e a determinação da atividade da enzima peroxidase pela avaliação dos eletroforegramas e de reação colorimétrica. Os resultados obtidos permitiram concluir que é possível diferenciar cultivares de soja quanto à tolerância ao herbicida glifosato através da reação colorimétrica. Há diferença nos eletroforegramas de atividade da enzima peroxidase entre os cultivares tolerante e suscetível ao glifosato.

Comparação de métodos na detecção de sementes de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

Pesquisas tem sido conduzidas visando determinar métodos de detecção de organismos geneticamente modificados (OGM), devido, principalmente, à importância sobre a atividade comercial. Atualmente, são utilizados bioensaios, que avaliam características fenotípicas das plântulas, testes de ELISA e Kits, que possibilitam identificar proteínas transgênicas específicas de DNA. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência dos métodos para detectar sementes de soja Roundup Ready (RR). Amostras de sementes de soja geneticamente modificada (GM) resistente ao glifosato e de sementes do parental suscetível foram submetidas a bioensaios (pré-embebidas, umedecidas em substrato, imersas em solução contendo glifosato e pulverização de plântulas), Kit Trait Test e detecção pelo método da PCR. Os bioensaios são métodos mais eficientes comparando a relação custo/benefício na detecção de sementes de soja GM, sendo o método de pré-embebição o mais indicado e a análise das características morfológicas de plântulas é importante nos bioensaios para detecção de sementes de soja GM.