Efeito da aplicação de lodo de esgoto na severidade da murcha-de-curtobacterium em feijoeiro

O presente trabalho teve por objetivo avaliar, sob condições de casa de vegetação, o efeito de lodo de esgoto (LE) na redução da severidade de murcha-de-curtobacterium em feijoeiro, cultivar Pérola, e no desenvolvimento das plantas (massa seca da parte aérea). No primeiro ensaio foram empregadas as doses de LE: 0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10%, e no segundo ensaio as doses de LE: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5% incorporados em solo com pH previamente corrigido e adubado com fertilizantes minerais na dose recomendada para a cultura. Nos dois ensaios foram conduzidas plantas não-inoculadas com o patógeno. Não foi verificado o efeito do lodo na redução da severidade dos sintomas da doença, bem como na massa seca da parte aérea das plantas inoculadas. Concentrações superiores à 5% de LE incorporado ao substrato foram fitotóxicos às plantas de feijoeiro, reduzindo a massa seca da parte aérea.

Tipificação de isolados deCurtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens por bacteriocinas

Este trabalho objetivou avaliar a produção e a sensibilidade à bacteriocinas, de 17 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens. Doze isolados foram procedentes do Estado de São Paulo e cinco de coleções internacionais. Apenas nove isolados de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens foram bacteriocinogênicos, e os 17 isolados avaliados foram separados em 12 grupos, conforme a sensibilidade às bacteriocinas produzidas pelos isolados bacteriocinogênicos.

Reação de cultivares de soja a isolado de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, proveniente de feijoeiro

O objetivo deste trabalho foi avaliar a reação das cultivares de soja EMBRAPA 46, EMBRAPA 47, EMBRAPA 48, EMBRAPA 58, EMBRAPA 59, EMBRAPA 60, EMBRAPA 61, EMBRAPA 62, BRS 66, BRS 132, BRS 133, BRS 134, BRS 135, BRS 136, BRS 155, BRS 156, BRS 157, IAC/BR-21, MG/BR-46 (Conquista) e MG/BR-48 (Garimpo RCH) a um isolado de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, proveniente de feijoeiro, usando dois métodos de inoculação, em casa de vegetação. Foram observados baixos níveis de severidade da doença nas cultivares de soja, independentemente do método de inoculação utilizado.

Herança da resistência em feijoeiro à murcha causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

O objetivo deste trabalho foi determinar a herança da resistência à murcha de Curtobacterium em feijoeiro. Foram realizados dois experimentos: no primeiro, cinco genótipos de feijoeiro, com diferentes reações de resistência à murcha de Curtobacterium, foram cruzados em arranjo dialélico; e no segundo, dois cruzamentos entre genótipos resistentes e suscetíveis - IAC Carioca Aruã x SCS Guará e IAC Carioca Pyatã x Pérola - foram realizados para dar origem às gerações P1, P2, F1, F2, RC1 e RC2. Em ambos os experimentos, a resistência do feijoeiro à murcha bacteriana foi avaliada por meio da inoculação do isolado Cff 2634. A análise dialélica mostrou que, embora efeitos aditivos e não aditivos estejam envolvidos, houve maior participação de genes com efeito aditivo no controle genético da resistência à murcha bacteriana, o que mostra a possibilidade de se obter sucesso com a seleção. A herança da resistência à murcha de Curtobacterium é complexa, com mais de três genes envolvidos, e herdabilidade no sentido restrito de 29%, para o cruzamento 'IAC Carioca Aruã' x 'SCS Guará', e de 44%, para o cruzamento 'IAC Carioca Pyatã' x 'Pérola'.

Tratamentos térmico e químico de sementes de feijoeiro: eficiência na erradicação de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens e efeitos na qualidade fisiológica das sementes

Foram testados o efeito da termo e quimioterapia na erradicação de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) e sobre a qualidade fisiológica de sementes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) cv. Pérola. Os tempos (30 min, 1 e 2 h) de embebição em água e em soluções de AGRIMAICIN 500 (sulfato de cobre, 500 g + oxitetraciclina, 30 g/kg do produto) nas concentrações de 5 e 10 g/L de água; o calor seco (60 e 70 ºC por 1, 2, 3, 6 e 12 h); e calor a 60 ºC/3 h em sementes previamente embebidas em água por 30 min, 1 e 2 h foram aplicados. Sementes embebidas em água por mais de 1 h tiveram o vigor afetado. Embebição das sementes (30 min, 1 e 2 h) em solução com 10 g de AGRIMAICIN 500/L de água afetou o comprimento das radículas e dos caulículos, enquanto que a germinação só foi afetada com 2 h. O tratamento eliminou a bactéria de sementes naturalmente infectadas, no entanto, em sementes inoculadas (10(8) ufc/mL) o tratamento não foi efetivo. Exposição ao calor seco (60 e 70 ºC) por mais de 3 h reduziu significativamente o vigor das sementes, mas não eliminou a bactéria. Embebição das sementes em água por 30 min e 1 h + 60 ºC/3 h afetou o comprimento dos caulículos e das radículas, mas não eliminou a bactéria. Embebição das sementes por duas horas em água + 60 ºC/3 h reduziu significativamente a germinação e o vigor; reduziu, ainda, significativamente o número de células de Cff em sementes inoculadas e eliminou a bactéria em sementes naturalmente infectadas.

Murcha-de-curtobacterium do feijoeiro no Estado de Santa Catarina e reação de genótipos a Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

Avaliou-se a ocorrência da murcha-de-curtobacterium em lavouras de feijoeiro comum em algumas localidades do Estado de Santa Catarina, nas safras 2002/03 e 2003/04, e o comportamento dos genótipos BRS Valente, Carioca, CHC 97-29, CHP 97-26, CNPF 8104, Diamante Negro, Empasc 201 - Chapecó, IAPAR 44, IPR Graúna, IPR Juriti, IPR Uirapuru, LP 9728, Pérola, SCS 202-Guará, Sel. CP 9310635, TPS Bionobre, TPS Bonito, TPS Magnífico, TPS Nobre, TPS Soberano e Xamego perante Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), em condições de casa-de-vegetação. As cultivares IAC Carioca Akytã, IAC Carioca Aruã e IAC Carioca Pyatã foram empregadas como padrões de resistência a Cff. As avaliações dos sintomas ocorreram aos 5, 10, 15, 20 e 25 dias após a inoculação (DAI) e, posteriormente, foi estimada a área abaixo da curva de progresso da murcha-de-curtobacterium (AACPMC), em cada genótipo. A doença esteve presente nos municípios de Campos Novos, Faxinal dos Guedes, Guatambu, Ipuaçu, Ponte Serrada e Tigrinhos e que, aos 10 DAI, as cultivares SCS 202 - Guará e IPR Juriti mostraram baixa severidade. Porém, aos 25 DAI, somente as cultivares padrões foram resistentes e apresentaram menor AACPMC.

Resistência genética em genótipos de feijoeiro a Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) agente causal da murcha-de-curtobacterium em feijoeiro (Phaseolus vulgaris), é um patógeno vascular de difícil controle. A doença foi detectada pela primeira vez no Brasil na safra das águas de 1995, no Estado de São Paulo. Por se tratar de uma doença de difícil controle, a resistência genética tem sido a melhor opção. O objetivo deste trabalho foi avaliar a reação de genótipos de feijoeiro à murcha-de-curtobacterium, frente a 333 acessos pertencentes ao banco de germoplasma de feijoeiro do Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Oportunamente, foram selecionados genótipos de feijoeiro altamente resistentes e suscetíveis, com a finalidade de comparar a colonização de Cff no vaso do xilema a partir da visualização sob microscopia eletrônica de varredura. Os resultados da triagem da resistência genética em genótipos de feijoeiro indicaram a existência de variabilidade genética nas amostras dos 333 genótipos avaliados, ao isolado de Cff Feij 2634. Os materiais foram classificados em 4 grupos de resistência: 29 genótipos (8,7%) comportaram-se como altamente resistentes, 13 genótipos (3,9%) como resistentes, 18 genótipos (5%) como moderadamente resistentes e 273 genótipos (81%) suscetíveis. A partir dos resultados obtidos, cerca de 18% dos genótipos de feijoeiros, desde altamente resistentes à moderadamente resistentes, poderão ser úteis para o programa de melhoramento genético como fonte de genes para resistência a Cff. Através da microscopia eletrônica de varredura, foram observadas em genótipos altamente resistentes, várias aglutinações da bactéria envolvidas por filamentos e estruturas rendilhadas sob pontuações da parede do vaso do xilema, não verificados em genótipos suscetíveis, o que sugere a ativação de mecanismos de defesa estruturais e bioquímicos nas plantas resistentes.

Meio de cultura semi-seletivo para detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em solo e sementes de feijoeiro

A murcha-de-curtobacterium, causada pela bactéria Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), é um importante problema para o cultivo de feijão (Phaseolus vulgaris L.) na região Centro-Sul do Brasil. A principal forma de disseminação da bactéria é por sementes contaminadas. Embora a ocorrência desta doença seja relativamente recente no Brasil, Cff tem sido disseminado rapidamente nas regiões produtoras de feijão do país. Este trabalho teve como objetivo ajustar o meio de cultura CNS (Corynebacterium Nebraskense Selective Medium) para recuperação e detecção de Cff em solo e sementes de feijoeiro. Suspensões provenientes da lavagem de amostras de solo e sementes contaminadas pela bactéria foram plaqueadas no meio de cultura CNS - modificado. Os ajustes realizados no meio de cultura possibilitaram a recuperação eficiente de Cff presente em solo e sementes contaminadas. As modificações estabelecidas para o meio CNS foram a redução da concentração de sulfato de polimixina para 16 mg/l, exclusão do componente ciclohexamida e substituição do fungicida Daconil 2787-F (530 mg/ml de chlorothalonil) pelo Dacostar 500 (500 mg/ml de chlorothalonil).

Análise ultraestrutural da interação de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em genótipos de feijoeiro

Observações com microscopia eletrônica de transmissão em secções ultrafinas de células de caules de feijoeiros (Phaseolus vulgaris L.), inoculados com Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), mostraram alterações nos vasos de xilema em genótipos de feijoeiros altamente resistentes, como formação de estrutura semelhante a tilose e presença de fibrilas ao redor das células bacterianas. Em genótipos suscetíveis, Cff colonizou além de vasos de xilema, células parenquimáticas e metaxilema.

Sensibilidade do método de obtenção das células bacterianas e da técnica de PCR para detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em sementes de feijão

Atualmente, existe a necessidade de se desenvolver métodos sensíveis, baratos, reproduzíveis e rápidos para a detecção de fitobactérias em sementes. O objetivo deste trabalho foi otimizar um método de obtenção das células bacterianas e a técnica de PCR para detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), em sementes de feijão. Foi utilizado o primer CffFOR2-REV4, desenhado a partir do fragmento amplificado via PCR baseado na seqüência repetitiva (Rep-PCR). Avaliaram-se também quatro métodos de preparação dos extratos de sementes de feijão para a obtenção células de Cff : 1) extrato bruto de sementes; 2 ) extrato concentra do por filtração em membra na milipore (0,22Mu de diâmetro) e ressuspensão em água; 3) extrato concentrado por centrifugação a 10 .00 0 xg por 15 minutos no volume de 20 ou de 80 mL e 4) Bio-PCR. Dentre esses métodos, tanto a Bio-PCR quanto a concentração do extrato por centrifugação, seja no volume de 20 ou de 80 mL, possibilitaram amplificar o segmento de DNA de 306 pb, característico de Cff. Essas duas técnicas, além de detectar a bactéria, apresentam alta sensibilidade, detectando até 1 semente inoculada artificialmente artificialmente com Cff em 999 sementes sadi as. Analisaram-se dezessete lotes comerciais de sementes de feijão pelo método de concentração de extrato por centrifugação, sendo qu e em doze detectou-se a bactéria Cff, observado pela presença de bandas com 306 pb. Portanto, foi possível otimizar um método de obtenção das células bacterianas e técnica de PCR para detecção de Cff em sementes de feijão, que seja sensível, reproduzível e de fácil execução, que poderá ser utilizado rotineiramente em laboratórios de análises de sementes.

Inoculação de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em sementes de feijão por meio da técnica de condicionamento fisiológico

Neste estudo foi testada a técnica de condicionamento fisiológico em meio agarizado para inoculação de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) em sementes de feijão. Na primeira etapa, avaliou-se o comportamento das sementes de feijão cultivar Pérola, durante o pré-condicionamento osmótico em substrato agarizado com restrição hídrica. Os tratamentos consistiram em expor, por diferentes períodos de tempo, sementes de feijão desinfestadas a quatro níveis de restrição hídrica do meio 523 (-0,55, -0,75, -0,95 e -1,15 MPa), com o uso de quatro substratos (meio 523, meio 523+KCl, meio 523+manitol e meio 523+sacarose). Como testemunha, utilizou-se o meio 523 sem restrição hídrica (-0,55 MPa). Decorridos os respectivos tempos, avaliou-se a percentagem de sementes com protrusão radicular e, posteriormente, o teor de água, a germinação e os padrões enzimáticos das sementes. Na segunda etapa do estudo, avaliou-se o crescimento de quatro isolados de Cff (Cff DF - Feij-2936, Cff PR - 12768, Cff SC - Feij-2928 e Cff SP - Feij-2634) em substrato agarizado com restrição hídrica. Os tratamentos da terceira etapa foram definidos com base na primeira etapa, em que o melhor tratamento foi o meio 523 com manitol no potencial hídrico de -0,95 MPa e com 48 horas de exposição das sementes no meio agarizado. Na segunda etapa, verificou-se que o isolado de Cff SC (Feij-2928), proveniente do estado de Santa Catarina, apresentou o melhor crescimento no substrato e no potencial hídrico definido na primeira etapa. Portanto, foi possível a inoculação artificial de sementes de feijão com Cff por meio da técnica de condicionamento fisiológico em substrato agarizado, sem o comprometimento de sua qualidade fisiológica.

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Otimização da técnica de PCR para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão

O crestamento bacteriano comum, causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap), é a principal bacteriose do feijoeiro no Brasil, sendo transmitida principalmente por sementes. O presente trabalho teve como objetivo aperfeiçoar uma técnica, por meio de diferentes métodos de preparação do extrato, para a detecção de Xap, bem como sua detecção simultânea com Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) nos extratos de sementes de feijão,via PCR. A partir de amostras de sementes de feijão inoculadas artificialmente com Xap e lotes comerciais, foram avaliados: extrato bruto obtido diretamente das sementes, extrato concentrado por filtração em membrana de 0,22µM de diâmetro, extrato concentrado por centrifugação e extrato plaqueado em meio semi-seletivo XCP1 com e sem antibióticos (BIO-PCR). Avaliou-se a presença simultânea de Xap e Cff em 10 lotes comerciais de sementes de feijão através da reação multiplex, utilizandos-se os primers X4c, X4e, CffFOR2 e CffREV4. A partir do extrato bruto, do extrato concentrado por centrifugação e por filtragem em membrana Millipore® não foi possível a detecção de Xap nas sementes de feijão artificialmente contaminadas nem nos 47 lotes comerciais de sementes/ grãos de feijão. A técnica de BIO-PCR permitiu a detecção de Xap a partir de extratos de sementes de feijão artificialmente contaminadas e em 18 dos 47 lotes comerciais. A técnica de detecção simultânea de Xap e Cff no mesmo gel é viável, por amplificar fragmentos de DNA típicos de cada fitobactéria. O uso do meio de cultura XCP1 sem adição de antibióticos permitiu detectar Xap com período de incubação menor em um dia em comparação à detecção utilizando-se o meio de cultura com antibióticos

Seleção precoce em plantas segregantes de feijoeiro para resistência à murcha de Curtobacterium

Os objetivos deste trabalho foram estimar a eficiência da seleção, em populações segregantes de feijoeiro, para a resistência à murcha de Curtobacterium, e indicar o melhor período do ciclo da cultura para se proceder à seleção das plantas resistentes. Foram realizados os cruzamentos convergentes IAC-Carioca Aruã x SCS Guará, IAC-Carioca Pyatã x SCS Guará e IAC-Carioca Pyatã x Pérola, dando origem às gerações F1, F2, F2:3, F3:4, que foram inoculadas com Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens isolado 2634. A resistência foi avaliada segundo escala de notas referentes aos sintomas comuns da doença aos 20, 40 e 60 dias após a inoculação. Os resultados indicaram que as gerações segregantes de Aruã x Guará, Pyatã x Guará e Pyatã x Pérola possuem comportamento semelhante em relação à resistência aos sintomas da murcha de Curtobacterium. A seleção foi efetiva para as gerações oriundas de Aruã x Guará e Pyatã x Pérola e o período entre 40 e 60 dias após a inoculação é o mais adequado para seleção de plantas segregantes para resistência.