Vacina experimental produzida em cultivo celular confere proteção parcial contra o ectima contagioso em ovinos

O ectima contagioso (também conhecido como orf), é uma doença debilitante de ovinos e caprinos causada pelo vírus do orf (ORFV). A vacinação tem sido usada com relativo sucesso no controle da doença. No entanto, as vacinas atuais contêm amostras virulentas do agente, são produzidas por escarificação cutânea de animais, e apresentam eficácia questionável. Assim, o presente trabalho teve como objetivo produzir e testar a eficácia de uma vacina experimental produzida em cultivo celular. A cepa IA-82 do ORFV foi submetida a 21 passagens em cultivo de células BHK-21 e usada para vacinar ovinos jovens (n=30), por escarificação cutânea na face interna da coxa. A vacinação produziu pústulas e crostas em 16 dos 30 ovinos vacinados, indicando imunização adequada. Noventa dias após a vacinação, ovinos vacinados (n=16) e controles (n=16) foram inoculados com uma cepa virulenta do ORFV (10(6,9)DICC50/mL) após escarificação na comissura labial. Todos os animais desenvolveram lesões típicas de ectima, incluindo hiperemia, vesículas, pústulas e crostas. No entanto, os animais vacinados desenvolveram lesões mais leves e passageiras do que os controles, e os escores clínicos foram estatisticamente diferentes (p<0,05) entre os dias 10 e 22 pós-desafio. Além disso, o tempo de duração da doença foi significativamente inferior (p<0,05) nos animais vacinados. Os animais vacinados também excretaram menor quantidade de vírus (p<0,05) e por um período significativamente mais curto do que os controles (13 dias versus 22 dias, p<0,001). Esses resultados demonstram a proteção parcial conferida pela vacina experimental e, dependendo da melhoria dos índices de imunização e proteção, são promissores no sentido da utilização de vacinas contra o ORFV produzidas em cultivo celular.

Cultura de Embriões até o Estágio de Blastocisto: Comparação entre o Uso de Meios Seqüenciais e de Co-Cultura

Objetivos: comparar o desenvolvimento embrionário com o uso de dois métodos diferentes de cultura (meio seqüencial ou co-cultura em células Vero). Métodos: foram incluídas 110 pacientes que tiveram ovócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Metade das pacientes teve seus embriões cultivados juntamente com células Vero e a outra metade em meio seqüencial G1:2/G2:2. Os embriões foram transferidos no dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica, verificando-se a taxa de blastulação. A gravidez foi definida por meio de ultra-sonografia, verificando-se batimento cardíaco após a 13ª semana pós-transferência. Resultados: a taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9% e 14% com células Vero e G1:2/G2:2, respectivamente. Com células Vero 36,0% das pacientes engravidaram com taxa de implantação de 18,9%. Quando se utilizou G1:2/G2:2 as taxas de gravidez e implantação foram 28,9% e 14,9%, respectivamente. Em apenas 17 casos obtiveram-se blastocistos após co-cultivo em células Vero, apresentando 76,5% de taxa de gravidez e 63,0% de implantação. Quando o cultivo foi em G1/G2 21 pacientes apresentaram blastocistos e as taxas de gravidez e implantação foram de 57,1 e 76,0%, respectivamente. Conclusão: não houve diferença significativa entre as taxas de gravidez ou implantação nos 2 tipos de cultivo. Nos casos em que blastocistos expandidos foram transferidos, as taxas de implantação e gravidez aumentaram com ambos os tipos de cultivo. Nestas pacientes, independente do tipo de cultivo utilizado, um número maior de ovócitos foi obtido, o que nos leva a pensar que não apenas as condições de cultura influenciam as taxas de implantação e gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as "boas respondedoras" tiveram melhores resultados.

Progressos na imunização contra Anaplasma marginale

Até o presente momento, as imunizações contra anaplasmose em rebanhos bovinos utilizam organismos vivos ou mortos. No entanto, esforços têm sido realizados nos últimos anos com o objetivo de desenvolver uma nova geração de vacinas. A membrana externa de Anaplasma marginale é capaz de induzir reposta imune protetora contra desafio homólogo e parcialmente protetora contra desafio heterólo-go. Nela foram identificadas seis proteínas principais de superfície (MSPs), as quais têm sido alvo de estudos para o desenvolvimento de imunógenos contra a anaplasmose. Destas proteínas, MSP1a e MSP2 têm demonstrado maior potencial como imunógenos, protegendo os animais contra desafio com isolados virulentos homólogos e heterólogos de A. marginale, apesar do polimorfismo de tamanho da primeira proteína e variabilidade do gene que codifica a segunda. Uma outra alternativa para a imunização contra A. marginale é o cultivo in vitro dessa riquétsia. Organismos inativados provenientes de cultivo em células IDE8 de Dermacentor variabilis foram testados como imunógeno. Os animais apresentaram uma significativa diferença na redução do volume globular após desafio e não apresentaram sinais clínicos de anaplasmose. Além da proteção conferida por este tipo de imunógeno, os organismos provenientes de cultura de células de carrapato são livres de células e patógenos de bovinos, o que é uma vantagem significativa quando comparado aos processos tradicionais de imunização.

Meningoencefalite por herpesvírus bovino-5

A meningoencefalite por herpesvírus bovino-5 (BoHV-5) é uma doença infecto-contagiosa, aguda ou subaguda, geralmente fatal e que afeta principalmente bovinos jovens submetidos a situações de estresse. A doença tem sido freqüentemente diagnosticada em várias regiões do Brasil e em outras partes do mundo. BoHV-5 é um vírus da família Herpesviridae e subfamília Alphaherpesvirinae e possui como genoma uma molécula de DNA fita dupla. Esses vírus são caracterizados por rápida replicação em cultivo, que resulta em lise das células infectadas, e afetam várias espécies de hospedeiros, estabelecendo latência principalmente em neurônios de gânglios sensoriais. A transmissão de BoHV-5 ocorre principalmente por contato direto ou indireto entre bovinos. Após a replicação primária nas mucosas oral, nasal, ocular e orofaríngea, o vírus invade as terminações nervosas e é transportado até os neurônios de gânglios sensoriais, onde replica ativamente e estabelece latência. A invasão viral do encéfalo pode resultar em replicação viral massiva e produção de doença neurológica. A maioria dos bovinos que desenvolvem doença neurológica morre em decorrência de meningo-encefalite, porém alguns podem desenvolver infecção subclínica e, após recuperação, permanecerem portadores da infecção latente. A disseminação viral nos rebanhos é facilitada em situações de grande concentração de animais, introdução de bovinos e desmame de lotes de bezerros em idade que coincide com o decréscimo da imunidade passiva. Certas condições, naturais ou induzidas, podem reativar o vírus do estado latente e propiciar condições para sua transmissão e disseminação a outros indivíduos. A doença pode ocorrer na forma de surtos ou em casos isolados, com coeficientes de morbidade que podem variar de 0,05%-5%; a letalidade é quase sempre de 100%. Os sinais clínicos incluem depressão, descarga nasal e ocular, ranger de dentes, andar em círculos, cegueira, febre, movimentos de pedalagem, disfagia, dor abdominal, nistagmo, tremores, sialorréia, incoordenação, opistótono, pressão da cabeça contra objetos, quedas e convulsões. A evolução do quadro clínico pode variar de 1 a 15 dias. Achados de necropsia podem estar ausentes, mas normalmente se observa tumefação das porções rostrais do córtex telencefálico e achatamento das circunvoluções, com segmentos amarelados e amolecidos (malacia). Com a evolução da doença, essas áreas se tornam gelatinosas e acinzentadas, e em casos avançados ocorre o desaparecimento segmentar do córtex telencefálico frontal (lesão residual). Em muitos casos podem ser observados focos de malacia na substância cinzenta dos núcleos basais e do tálamo. Histologicamente observa-se meningoencefalite não-supurativa necrosante, principalmente no córtex telencefálico frontal, associada a inclusões intranucleares eosinofílicas em astrócitos e neurônios, embora a freqüência dessas inclusões seja irregular. O diagnóstico de meningoencefalite por BoHV-5 deve ser feito com base nos achados epidemiológicos, clínicos, de necropsia e histopatológicos, associados com o isolamento do vírus em cultivo celular células ou com detecção de antígenos virais em seções do encéfalo ou em células descamadas presentes nas secreções nasais. A identificação e caracterização de BoHV-5 pode ser realizada por meio de testes com anticorpos mono-clonais, reação em cadeia de polimerase (PCR) e por análise de restrição genômica. Não há tratamento específico para a meningoencefalite por BoHV-5. Como o BoHV-1 e o BoHV-5 são antigenicamente muito semelhantes, recomenda-se a vacinação com vacinas para BoHV-1 como forma de reduzir as perdas causadas por BoHV-5, principalmente durante surtos de doença neurológica. Adicionalmente, outras medidas podem ser adotadas para prevenir ou reduzir os prejuízos ocasionados pela enfermidade, como testar sorologicamente os bovinos a serem introduzidos nos rebanhos, minimizar situações de estresse, sobretudo no desmame, e isolamento dos bovinos afetados.

Uma tentativa de cultivo de rotavírus humano em cultura de leucócitos humano (Nota Prévia)

Experimentos preliminares da permissividade de cultura de leucócitos humanos estimulados com mitógeno frente a infecção pelo rotavirus humano foram realizados por microscopia eletrônica. Observamos que, células mo-nonucleadas, mantidas em cultura, após estimulação com fitohemaglutinina (PHA) colhidas 36 horas pós-infecção apresentavam muitas partículas virais no citoplasma. Verificamos, também, muitas partículas virais associadas a fragmentos celulares, várias células em degeneração e alguns linfócitos pequenos intactos. Não presenciamos partículas virais em células colhidas previamente (12 e 24 horas p.i.) e nas culturas controle (sem tratamento com PHA). Sugerimos que o rotavirus humano pode se replicar em culturas de leucócitos humanos estimulados com PHA.

Influência do pH do meio de cultivo e da turfa no comportamento de estirpes de Bradyrhizobium

A acidez dos solos representa um problema que afeta grandes áreas agrícolas pelo mundo, principalmente nos trópicos, onde fósforo e nitrogênio também são limitantes. No caso do nitrogênio, a fixação biológica torna-se uma das alternativas mais viáveis do ponto de vista ecológico e econômico, por diminuir o uso e o impacto causado pelos fertilizantes nitrogenados. Neste trabalho, foram realizados dois experimentos in vitro e um em casa de vegetação com quatro estirpes de Bradyrhizobium (Br 4406, Br 29, SEMIA 587 e INPA 03-11B), no Departamento de Ciência do Solo (UFLA), de julho de 1998 a julho de 1999, para verificar o efeito de três valores de pH (5,0; 6,0; 6,9) no crescimento destas em meio de cultura YM, na sua simbiose com soja, assim como na sua sobrevivência em inoculantes produzidos com turfa. No primeiro experimento, as estirpes de Bradyrhizobium tiveram um comportamento diferenciado em meio líquido, obtendo melhor desempenho em pH 6,0, tanto em número de unidades formadoras de colônias quanto em produção de exopolissacarídeos. +No segundo experimento, o número de nódulos, a atividade da nitrogenase (Nase), as massas secas de nódulos, raízes e parte aérea de plantas de soja, de modo geral, não foram influenciados pelos valores de pH de cultivo das estirpes no inoculante. Entretanto, a estirpe INPA 03 - 11B mostrou-se efetiva, apresentando número de nódulos e atividade de Nase semelhantes aos de Br 29 e SEMIA 587, que são recomendadas como estirpes inoculantes, devendo, assim, ser indicada para testes de eficiência em campo. No terceiro experimento, com exceção da Br 29, que atingiu maior sobrevivência de células em pH 6,0, as outras estirpes tiveram sobrevivência semelhante neste valor de pH e em pH 6,9. O melhor desempenho das estirpes de Bradyrhizobium em pH 6,0 no meio de cultura e em turfa demonstrou a possibilidade do uso de inoculantes corrigidos para esse valor de pH, como modo de pré-adaptação às condições de acidez dos solos tropicais.

Identificação de isolados de Azospirillum amazonense associados a Brachiaria spp., em diferentes épocas e condições de cultivo e produção de fitormônio pela bactéria

Existem evidências de que pastagens formadas por algumas espécies do gênero Brachiaria poderiam beneficiar-se com o processo de fixação biológica do nitrogênio atmosférico (FBN), garantindo a estas pastagens maior longevidade. Dentre as bactérias diazotróficas encontradas em associação com estas gramíneas forrageiras, destaca-se a espécie Azospirillum amazonense. Neste trabalho, objetivou-se verificar a influência da espécie de Brachiaria, manejo da pastagem e sazonalidade sobre as populações de A. amazonense associadas às raízes destas plantas. Diferentes pastagens (B. humidicola, B. decumbens e B. brizantha) foram introduzidas em regiões do ecossistema Cerrado e de Mata Atlântica. Foram avaliados dois sistemas de manejo com diferentes taxas de lotação, e as coletas foram realizadas em diferentes épocas do ano. As populações de A. amazonense foram quantificadas e a identidade dos isolados confirmada, assim como sua capacidade de produção de fitormônios tipo AIA (ácido 3-indol acético) em meio de cultivo. Isolados de A. amazonense foram obtidos a partir de amostras de raízes das três espécies de Brachiaria avaliadas. Estimativas das populações desta bactéria variaram de 10³-10(7) células g-1 de raízes. Em amostras do ecossistema Cerrado, a época de coleta apresentou efeito significativo sobre a população destas bactérias. Os dados da região de Mata Atlântica mostraram que plantas de Brachiaria de diferentes espécies e pastagens sob diferentes taxas de lotação podem apresentar números populacionais distintos associados às suas raízes. A técnica de análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA) confirmou a identidade de todos os isolados avaliados. Estes isolados foram capazes de produzir fitormônios tipo AIA.

Potencial para o biocontrole de Botrytis cinerea por leveduras em sistema integrado de cultivo de lírio

O objetivo deste trabalho foi comparar uma população de leveduras do filoplano de lírio de um sistema convencional de cultivo com outra de sistema integrado, além de avaliar o antagonismo da levedura Sporidiobolus pararoseus a Botrytis cinerea. A comunidade de leveduras foi estimada pelo método da queda dos balistoporos nos terços inferior, médio e superior das plantas, bem como nas faces adaxial e abaxial das folhas. Nos discos de folhas de plantas do sistema integrado, foi alta a presença da população de leveduras, tendo sido maior na face adaxial das folhas do terço médio das plantas. Para avaliação do antagonismo, foram aplicadas aos discos de folhas as concentrações de 10(5), 10(6) e 10(7) células mL-1 da levedura, em três períodos de inoculação: 24 horas antes; simultânea a; e 24 horas após a inoculação de 10(4) esporos mL-1 de B. cinerea. A incidência, a percentagem de área de discos colonizados e a esporulação de B. cinerea foram avaliadas por meio de diagrama de notas, a partir do quarto dia após a inoculação. Todas as concentrações da levedura reduziram a esporulação de B. cinerea nos discos de folha, em comparação à testemunha, e a concentração de 10(7) esporos mL-1 foi a mais eficiente.

Carotenogênese em células de Haematococcus pluvialis induzidas pelos estresses luminoso e nutricional

O objetivo deste trabalho foi avaliar as respostas das células de Haematococcus pluvialis ao processo de indução à carotenogênese, sob estresse luminoso e nutricional. As células foram aclimatadas durante 15 dias em meio WC, com aeração com ar atmosférico sintético filtrado e fluxo de 100 mL min-1, intensidade luminosa de 50 µmol fótons m-2 s-1, fotoperíodo de 12 horas e temperatura de 23ºC. Foram comparados dois tratamentos: cultivo nas condições descritas, mas com aumento da intensidade luminosa para 350 µmol fótons m-2 s-1 ; e cultivo nas mesmas condições do tratamento anterior, mas com aeração contendo 4% de CO2. Os tratamentos foram conduzidos em triplicata, durante dez dias. Com a adição de CO2 e o incremento da iluminação, observou-se aumento da razão carotenoides/clorofila e da biomassa celular. As células cessaram a divisão no segundo dia de estresse, quando o nitrato se tornou limitante, e aumentaram significativamente seu biovolume. A excreção de carbono orgânico e a concentração de astaxantina aumentam em resposta à adição de CO2. O estresse por intensidade luminosa, aliado à adição de CO2, otimiza a carotenogênese em H. pluvialis e aumenta a produção de astaxantina.

Efeito do recipiente e ambiente de cultivo sobre o desenvolvimento de mudas de mamoeiro cv. Sunrise Solo

O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de três recipientes e três condições ambientais no desenvolvimento de mudas de mamoeiro (Carica papaya L.) Cv. Sunrise Solo, nas condições de clima tropical da Ilha de São Luís - MA. Os recipientes utilizados foram saco de polietileno preto nas dimensões de 20 x 32 cm e 15 x 20 cm e bandeja de poliestireno de 72 células e como ambientes foram utilizados túnel de plástico, viveiro-telado de sombrite com 50% de sombreamento e a céu aberto. Na avaliação dos caracteres biométricos, foram mensurados a altura das plantas, o diâmetro do caule e o número de folhas. No período de 14-06-2004 a 21-07-2004, foram monitoradas a precipitação, a temperatura e a umidade relativa do ar, com o auxílio de psicrômetros de ventilação natural, em cada um dos ambientes. De acordo com os resultados, concluiu-se que as mudas de mamoeiro produzidas em recipiente de sacos de polietileno 20 x 32 cm foram superiores em todos os caracteres analisados; o recipiente de bandeja de poliestireno mostrou-se inadequado para a produção de mudas; aos 45 dias após a semeadura, o ambiente a céu aberto, mostrou-se mais propício para o desenvolvimento adequado das mudas. Aos 60 dias, as mudas cultivadas sob viveiro telado apresentaram crescimento excessivo e estiolamento.

Diluição celular, características do meio de cultura e biorreatores de imersão temporária na diferenciação e regeneração de células em suspensão de bananeira

Altos custos de produção geralmente limitam o uso comercial da micropropagação. O uso de meios de cultura líquidos é considerado uma solução para a automação e redução de custos. Entretanto, dependendo da cultivar de bananeira, esse processo pode mostrar diferentes níveis de dificuldade, e adaptações nos protocolos são necessárias. Neste estudo, experimentos de diferenciação celular e regeneração de plantas foram desenvolvidos em células em suspensão de banana pela avaliação da densidade inicial de células, meios de cultura e sistemas de imersão temporária. Para tanto, uma sequência de três experimentos foi realizada: o primeiro avaliou os efeitos da densidade celular (0,5; 1 e 2 mL), meios de cultura (M1: 1/2MS, 0,1 g.L-1 de ácido ascórbico, 0,1 g.L-1 de L-prolina, 30 g.L-1 de sacarose e 10 µM de 2iP; M2: MS, 30 g.L-1 de sacarose, 2,2 µM de BAP e 11,4 µM de AIA) e períodos de diferenciação celular (40 e 130 dias); o segundo experimento analisou o efeito do tamanho dos propágulos diferenciados em meio líquido (aprox. 2,5; 5 e 10 mm em diâmetro) na formação de embriões somáticos ou na regeneração de plantas; finalmente, um terceiro experimento avaliou o efeito de sistemas de cultivo com papel-filtro cobrindo o meio de cultura semissólido e sistemas de imersão temporários na diferenciação dos propágulos e na regeneração de plantas. Não foram observadas diferenças significativas entre os meios de diferenciação, porém as melhores diluições de células para a diferenciação foram de 1 e 2 mL/30mL de meio de cultura, enquanto diluições de 0,5 mL/30 mL de meio aumentaram a oxidação celular. A extensão do período de diferenciação de 40 para 130 dias foi importante para produzir maior número de calos/propágulos uniformes e com pelo menos de 10 mm de diâmetro, que puderam ser usados em sistemas de imersão temporária (biorreatores) para a diferenciação de embriões somáticos e regeneração de plantas. Considerando todos os sistemas de regeneração, verificou-se que o uso de meios de regeneração de consistência semissólida com papel-filtro na superfície do meio é o mais responsivo para a diferenciação de embriões somáticos e regeneração de plantas.

Efeito de exsudatos de cultura de células de plantas em juvenis de segundo estádio de Meloidogyne incognita

Calus foram obtidos de tomateiro (Lycopersicon esculentum), cafeeiro (Coffea arabica), alfafa (Medicago sativa), orquídea (Dendrobium nobile), mostarda (Brassica rapa), batata doce (Ipomoea batatas), fumo (Nicotiana tabacum), cenoura (Daucus carota) e Crotalaria juncea em meio sólido de Murashige & Skoog (MS) seguido do cultivo em meio líquido MS em temperatura de 25-28 ºC. Após um mês, a suspensão foi passada em membrana Millipore 0,22 µm, obtendo-se, assim, o exsudato da cultura de células de cada planta testada. Ovos ou juvenis de segundo estádio (J2) de Meloidogyne incognita foram incubados nesses exsudatos e avaliadas as percentagens de eclosão, mobilidade e mortalidade dos J2. Com exceção dos ovos incubados em exsudato de orquídea, todos os demais inibiram a eclosão quando comparados com a incubação em água (testemunha). Entretanto, nos exsudatos de L. esculentum, cafeeiro e C. juncea a inibição foi mais drástica, semelhante ao aldicarb, mas significativamente diferente e menor do que em soluções contendo ingredientes do meio MS (1-5). Todos os exsudatos reduziram a mobilidade e aumentaram a mortalidade, com maior intensidade em 24 h de exposição. Porém, maior redução na mobilidade ocorreu nos exsudatos de tomateiro e alfafa, enquanto maior mortalidade no exsudato de tomateiro, seguido pelo de mostarda.

Produção de progesterona in vitro pelas células do corpo lúteo bovino ao longo da gestação

O presente trabalho foi desenvolvido para testar a hipótese de que células luteínicas bovinas em cultivo, provenientes dos três terços de gestação, comportam-se da mesma maneira que células in vivo em relação à produção de P4. Foram coletadas amostras de corpos lúteos (CL) de 90 (n=3), 150 (n=3) e 210 (n=3) dias de gestação obtidos em abatedouro. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 poços. Após 24 horas de cultivo foram feitas a lavagem dos poços e a adição do precursor pregnenolona. Os tratamentos foram realizados em octuplicata para cada tempo de tratamento (24, 48 e 96 horas) com três repetições de cada período gestacional. As amostras de meio de cultura e as células foram coletadas 24, 48 e 96 horas após adição do precursor e acondicionadas em freezer a -20ºC até o processamento. A progesterona foi dosada através de radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os resultados foram analisados estatisticamente e considerados diferentes quando p<0.05. Foi observada maior produção de P4 aos 90 dias de gestação (35,277±0,075), posterior decréscimo aos 150 dias (28,820±0,231) e novo aumento aos 210 dias (32,777±0,099). A produção de P4 em células cultivadas por 24 horas foi maior (p<0,05) em células oriundas do grupo de 90 dias (2,912±0,047) quando comparado a 150 (2,669±0,137) e 210 dias (2,741±0,088). As 48 e 96 horas de cultivo, células luteínicas bovinas de 90 dias produziram mais P4 que células de 210 dias (2,934±0,029 e 2,976±0,121 respectivamente x 2,760±0,059 e 2,695±0,149, respectivamente; p<0,05), que por sua vez produziram mais do que células de 150 dias (2,334±0,084 para 48 horas e 2,205±0,136 para 96 horas). Aos 150 dias de gestação a produção de progesterona apresentou diminuição gradativa ao longo das 96 horas de cultivo. Essas diferenças podem ser explicadas pela expressão gênica diferencial de enzimas ou também de fatores presentes na cascata esteroidogênica de acordo com a idade gestacional. Este modelo de cultura celular luteínica poderá ser utilizado em estudos funcionais uma vez que o padrão de secreção de P4 mimetizou o que ocorre in vivo.

Alterações do epitélio branquial e das lamelas de tilápias (Oreochromis niloticus) causadas por mudanças do ambiente aquático em tanques de cultivo intensivo

Objetivou-se analisar o comportamento do epitélio branquial de tilápias, cultivadas em tanques posicionados em diferentes altitudes e interconectados por tubos de PVC. Filamentos branquiais de quatro espécimes de quatro tanques (T1, T2, T3 e T4) interconectados seqüencialmente foram submetidos à rotina histológica, para obtenção de cortes de 5µm de espessura, os quais foram corados com Hematoxilina-Eosina, ou submetidos à técnica histoquímica para glicoconjugados: PAS + solução de diástase ou Alcian Blue pH 2,5 ou Alcian Blue pH 1,0. Considerando as regiões basal, intermediária e apical dos filamentos, mensurou-se a área lamelar e contou-se o número de células mucosas em cada uma dessas regiões, o que correspondia a 0,56 mm². Verificou-se que a concentração de oxigênio, pH e a temperatura se reduziam progressivamente com a passagem da água de um tanque para outro. Em função disso, constatou-se um aumento abrupto do número de células mucosas e da área lamelar no T2, e uma redução progressiva destas medidas nos tanques que recebiam água do T2. Além disso, observou-se nos animais do T2, T3 e T4, descolamento do epitélio branquial, hiperplasia celular no espaço interlamelar e telangectasias. Conclui-se que o ambiente aquático de tanques interconectados seqüencialmente por tubos de PVC se altera ao passar de um tanque para o outro, e que estas flutuações físico-químicas se refletem no comportamento do epitélio branquial através de variações da área lamelar e do número de células mucosas.

Isolamento e cultivo de neurônios e neuroesferas de córtex cerebral aviar

Métodos de cultivo celular são convenientes na realização de análises funcionais de alterações/interações protéicas das células neuronais, auxiliando a decifrar o interactoma de proteínas chaves na neurogênese de doenças do Sistema Nervoso Central. Por esse motivo, culturas de neurônios e neuroesferas isolados do córtex cerebral aviar representam um modelo acessível para o estudo de diversas doenças neurológicas, tal como a epilepsia. A espécie aviar apresenta peculiaridades em seu proteoma neuronal, visto a presença de uma expressão diferenciada de proteínas chaves no metabolismo energético cerebral, algumas destas (VDAC1 e VDAC2) desempenham papel importante na compreensão do mecanismo da epilepsia refratária. A metodologia estabelecida no presente estudo obteve cultivo de neuroeferas, onde as células cresceram tipicamente em aglomerados atingindo, dentro de 7 dias, o diâmetro ideal de 100-200 µm. A diferenciação celular das neuroesferas foi obtida após a aderência destas às placas tratadas com poli-D-lisina, evidenciada pela migração de fibras do interior da neuroesfera. Ao contrário das neuroesferas, os neurônios em cultivo extenderam seus neuritos após 11 dias de isolamento. Tal modelo in vitro pode ser utilizado com sucesso na identificação das variáveis neuroproteômicas, propiciando uma avaliação global das alterações dinâmicas e suas interações protéicas. Tal modelo pode ter aplicações em estudos dos efeitos de indutores da morte celular e bloqueadores de canais de membrana mitocondriais em proteínas chaves do metabolismo energético cerebral.