Cultivares de Pisum Sativum L. : caracterización e identificación por electroforesis de proteínas seminales totales

Se realizó el estudio electroforético de proteínas seminales totales de 13 cultivares de arveja (Pisum sativum L.) en geles de poliacrilamida con Sodio Dodecil Sulfato. Se logró fraccionar 53 bandas proteicas, de las cuales 36 mostraron diferencias en sus movilidades. De esta manera se obtuvieron modelos electroforéticos diferentes para cada cultivar y mediante análisis de conglomerados (método UPGMA) se obtuvo un dendrograma que mostró la distinción entre cultivares en dicho carácter, permitiendo expresar las diferencias entre ellos.

MLPA en el estudio de desórdenes genómicos

El término de desórdenes genómicos se utiliza para definir aquellas condiciones que surgen por inestabilidad en la molécula de ADN y, que ocasionan, rearreglos cromosómicos que involucran regiones de uno o varios pares de megabases. Estos rearreglos determinan la pérdida, ganancia o disrupción de genes cuya expresión fenotípica varía de acuerdo a la cantidad de secuencia codificante presente (dosage- sensitive- genes). Estas anormalidades genómicas surgen predominantemente durante eventos de recombinación no alélica entre cromosomas homólogos (NAHR), aunque otros mecanismos también han sido descriptos. Los rearreglos cromosómicos ocurren en puntos de quiebra que concentran regiones inestables de la molécula de ADN como lo son las secuencias repetidas llamadas LCRs (low copy repeats) que sirven como sustrato de recombinación o los sitios palindrómicos ricos en adenina- timina. Entre los desórdenes originados por alteración en la estructura genómica se cita al síndrome de deleción/duplicación 22q11.2, que incluye varios cuadros clínicos con superposición de rasgos fenotípicos. Se estima que la variabilidad clínica en estos pacientes es consecuente con la cantidad de secuencia codificante presente en relación al tamaño de la deleción/ duplicación. El advenimiento de nuevas técnicas moleculares permite actualmente determinar con precisión el segmento delecionado/ duplicado. Una nueva metodología conocida como MLPA (multiplex ligation probe amplification) podría discriminar, para este desorden en particular, cambios en el número de copias genómicas responsables de los diferentes fenotipos. Se considera que la técnica de MLPA es una herramienta de diagnóstico complementaria, con una alta sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de desórdenes genómicos, que permite cuantificar microdeleciones/ microduplicaciones no objetivables por otros métodos. Se espera en un futuro que el conocimiento en cuanto a los complejos mecanismos de producción de los diferentes desórdenes genómicos permita definir con claridad la existencia de una relación genotipo- fenotipo que pueda delinear a aquellas entidades con fenotipos intermedios.

Metodología para la detección de Agrobacterium vitis a partir de material vegetal de Vitis vinífera

En nuestro país no está desarrollada una técnica sensible y precisa que permita confirmar la presencia de la bacteria Agrobacterium vitis; por lo tanto es muy importante contar con herramientas analíticas que permitan identificar la bacteria en vides y/o suelos para controlar la diseminación y propagación de la misma, permitiendo así a las empresas, mejorar la competitividad de sus productos en el mercado y garantizar la seguridad y calidad de la materia prima principal de la industria vitivinícola. El objetivo de este estudio es poner a punto una metodología de detección de Agrobacterium vitis sensible y de bajo costo basada en la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). El desarrollo de esta metodología pretende ser una herramienta importante para la industria vitivinícola al permitir detectar la presencia o ausencia de la bacteria en programas de monitoreo, tomar decisiones a tiempo y así proteger la calidad y sanidad de las vides. En el presente trabajo se empleó la metodología propuesta por Eastwell y colaboradores en 1995. La misma consistió en el aislamiento de la bacteria en medio selectivo RS, en la extracción/purificación de ADN bacteriano, amplificación por PCR, separación del producto amplificado por electroforesis y revelado por tinción, pudiéndose observar que el 100% del material con sintomatología que se utilizó presentó desarrollo de colonias características de Agrobacterium vitis. Al hacer la amplificación de los ADN y posterior revelado se observó, en primera instancia, que la amplificación no fue óptima, pero cuando se realizaron las distintas adaptaciones de la técnica se vieron diferentes resultados encontrándose que podría tratarse de: A. vitis virulento, no virulento o A. tumefaciens. Para ello fue necesario adecuar la técnica y estudiar algunos aspectos tales como las temperaturas de incubación de los medios de cultivos, evaluación de la concentración de ADN para determinar si existía una concentración mínima del mismo para su posterior amplificación. También se trabajó con diferentes concentraciones del gel de agarosa y se modificaron los volúmenes de siembra y los tiempos de corrida del gel en la cuba de electroforesis. Fue posible adaptar la metodología para la identificación de cepas de Agrobacterium vitis. Los mejores resultados se evidenciaron trabajando con una temperatura de incubación de las colonias de 28 °C, con una concentración del gel de agarosa del 2 % tal como lo indicaba la técnica original, volúmenes de siembra de electroforesis de 10 μl de PCR producto y un tiempo de corrida del gel en la cuba de electroforesis de 70 min a 90 Voltios. Además observamos que concentraciones de ADN superiores a 49 ng/μl registraron bandas visibles siendo las de 116 ng/μl o superiores las concentraciones más adecuadas y optimas para la obtención de bandas bien definidas y nítidas.